Влажные химии и пептидный иммобилизации на политетрафторэтилена для улучшенного клеточной адгезии

Резюме

Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.

Аннотация

Наделение материалы поверхность с клеточно-адгезионные свойства является общей стратегией в исследовании биоматериалов и тканевой инженерии. Это особенно интересно для уже утвержденных полимеров, которые имеют длительный срок использования, стоя в медицине, так как эти материалы хорошо охарактеризованы и правовые вопросы, связанные с введением новых синтезированных полимеров можно избежать. Политетрафторэтилен (PTFE), является одним из наиболее часто применяемых материалов для изготовления сосудистых тканей, но полимер испытывает недостаток клеток, усиливающего адгезию особенности. Эндотелиализацию, то есть полный охват трансплантатов внутренней поверхности с вырожденным слоем эндотелиальных клеток считается ключом к оптимальной производительности, в основном , за счет снижения тромбогенности искусственного интерфейса.

Это исследование исследует рост эндотелиальных клеток на пептид-модифицированный ПТФЭ, и сравнивает эти результаты, полученные на немодифицированной подложке. Сцепление сэндотелиальный клей клетка пептид Arg-Glu-Asp-Val (REDV) осуществляется через активацию Fluorin полимера, содержащего, используя реагент нафталинид натрия с последующим последующих стадий конъюгации. Культура клеток осуществляется с использованием человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены (HUVECs) и отличный клеточный рост на пептидной иммобилизованным материале демонстрируется в течение двух недель.

Введение

Различные полимеры , используемые в медицине , которые были утверждены в течение некоторого времени не проявляют повышенную биосовместимость, т.е. отсутствие клеток-липкости, индукцию фиброзной капсулой и тромбообразования, чтобы упомянуть некоторые из них. Взаимодействие между биоматериала и биологической системы происходит в основном на поверхности имплантата. Как следствие этого, исследование сосредоточилось на модификации поверхности для того, чтобы создать соответствующие свойства для требуемого применения, оставляя объемные свойства материала не изменяются. Политетрафторэтилена (ПТФЭ) в качестве физиологически инертный полимер используется во многих областях медицины , таких как грыжа хирургической сетки ^1, медицинские порты ² и, самое главное, сосудистых трансплантатов ^3.

Особенно в крови контактирование ситуации гидрофобный характер PTFE вызывает неспецифическую адсорбцию компонентов плазмы и, как следствие адгезии тромбоцитов, что часто приводит к thrombotiC события и закупорка трансплантата ^4. Кроме того, из ПТФЭ, как и большинство полимеров, не поддерживает клеточную адгезию и покрытие , которое было бы желательным признаком , чтобы вызвать образование полезного слоя эндотелиальных клеток (ЭКС) на внутренней (полостной) поверхности сосудистой трансплантата ^5. Биомиметический эндотелий , как ожидается , выполнять многие из функций его естественного эквивалента, в частности , его антитромбогенные свойства ^6. Общая биомиметический стратегия модификации основана на концепции исключительно наделение материал с клеточной адгезионной способностью, оставляя материалы объемные свойства не изменяются. Кроме того, адгезия тромбоцитов может быть уменьшена за счет включения антиадгезионного (анти-обрастания) признаки ^7. Различные пептиды - в основном полученные из протеинов внеклеточного матрикса - были описаны , что сильно повысить клеточную адгезию путем связывания с клеточными рецепторами, принадлежащий к классу интегринов ^8. БытиеSt известным примером в этом отношении является пептид Arg-Gly-Asp (RGD), который взаимодействует с большинством типов клеток. Другие аминокислотные последовательности распознаются интегринов экспрессируется исключительно на конкретных клетках. Например, Арг-Glu-Asp-Val (REDV) и Тир-Иле-Гли-Ser-Arg (YIGSR) было обнаружено, что связываться с КЧС определенным образом ^9. Ковалентной иммобилизации таких пептидов было проведено на изобилием по своей природе не липких материалов , включая металлы и полимеры ^10,11.

Пористый ПТФЭ, более точно расширен ПТФЭ (ПТФЭ) - наряду с полиэтилентерефталата (ПЭТ) - это наиболее важный материал для производства сосудистых трансплантатов ^12. Установленные физические методы для надлежащего лечения, такие как модификация плазмы ¹³ или фотохимическим методами ^14, затруднены тем , что пористые и / или трубчатые структуры не легко поддается лечению в порах или просвет соответственно. Влажная химияПТФЭ является сложной задачей из-за чрезвычайно инертной природы Fluorin содержащего полимер , который противодействует большинство химических атак ^15.

В этой статье мы опишем сравнительно легкое метод стратегии ковалентной модификации. Адаптировано из процедуры для визуализации ПТФЭ к связыванию, функциональные группы были созданы на поверхности материалов, которые служат в качестве опорных точек для дальнейшего сопряжения биологически активных молекул.

протокол

1. Получение натрия нафталинид активизирующего раствора и поверхности активации

Примечание: Проведение реакции в хорошо вентилируемом вытяжном шкафу. Следуйте общим правилам для сылно растворителей и коррозионные металлы, такие как металлический натрий. Нафталин имеет очень неприятный запах (законсервировать), даже в очень небольших количествах! Если не указано иначе реакции проводят при комнатной температуре. Азид натрия очень токсичен! ТГФ (99,9%, см список материалов) хранился в течение примерно 20% (по объему) молекулярного сита. Отфильтровываю ТГФ с заметным содержанием воды над натрием. Формирование нафталенидом натрия не происходит, если следовые количества воды присутствуют.

1. К раствору 1,4 г (10,9 ммоль) нафталина в 20 мл тетрагидрофурана (ТГФ, сушили над 3 молекулярного сита), добавляют 0,25 г (10,9 ммоль) металлического натрия в завинчивающейся крышкой стеклянный флакон 100 мл, снабженную PTFE- с покрытием магнитной мешалкой.
   Примечание: Dissoluция может быть значительно повышена за счет сокращения натрия на мелкие кусочки и скромные нагрева (35 - 40 ° C). Конечный раствор имеет темный, слегка зеленоватого цвета, и могут храниться в строго сухих условиях.
2. Выбивать PTFE диски диаметром 12 мм из материала толстой фольги 0,5 мм. Марк с одной стороны (например, с использованием штампа письмо удар) и чистый с изопропанолом.
3. Выдержите ПТФЭ образцы по отдельности в растворе активирующего (шаг 1,1) в течение 1 - 2 мин с помощью щипцов. Примечание: Изменение цвета от белого до темно-коричневого указывает на успешное лечение.
4. Затем прополоскать дважды ТГФ и затем изопропанолом.
   Примечание: Решение нафталинид исчерпывается, когда его цвет меняется на водянистой светло-коричневого цвета. Неиспользованный раствор нафталинид (возможно, содержащий металлический натрий) должен быть разложен, медленно добавляя изопропанола перед удалением.
5. Oxidize обработанные образцы в перекиси водорода (30%), содержащего 20% (вес / объем) трихлоруксусной кислоты в течение 3 ч. мытьс водой и высушить. Поверхность теперь имеет небольшой коричневатый внешний вид. Примечание: Включение и результат окисления в резко повышенной смачиваемостью поверхности. Этот вывод был подробно рассмотрен ранее ^14.
6. Лечить окисленные диски с 50% (об / об) гексаметилендиизоцианатом (HMDI) в сухом ТГФ в течение 2 ч, промывают ТГФ и оставить до полного высыхания.
7. Hydrolyze изоцианатные образцы подшипников в воде в течение 2 - 3 ч и сухой. Примечание: Конечный амино-функционализированные поверхности ПТФЭ является гораздо более стабильным, чем по отношению к изоцианату, приносящих образцов и совместим со многими стандартными сшиватели для дальнейшей связи.

2. Пептид иммобилизации

1. Приготовьте раствор 20% (об / об) диэтиленгликоля диглицидиловый эфир (диэпоксидную) в 50 мМ карбонатном буфере, рН 9.
2. Поместите аминируется диски с отмеченной стороной вверх по отдельности в 24-луночный планшет и добавляют 1,5 мл раствора эпоксида. Обеспечить полный охват образцов. Выдержите в течение 2 часов и мыть двараз водой и один раз с карбонатным буфером.
3. Добавляют 50 мкл 0,5 мг / мл пептида (например, REDV) в 50 мМ карбонатном буфере, рН 9 , содержащего 0,01% NaN _3, в нижней части отдельные лунки свежей 24 - луночного планшета и осторожно поместить эпоксидную функционализованных диски вверх -вниз (то есть, отмеченные стороной вниз) на каплю раствора пептида. Убедитесь, что пространство между дном скважины и PTFE диск полностью смачивается из-за капиллярного действия.
4. Выдержите во влажной камере (например, любой закрывающийся пластиковый ящик с плотно закрывающей крышки) с влажной атмосфере (путем размещения бумаги мокрой ткани на дне) , по крайней мере , 3 часа или на ночь.
   Примечание: REDV хотя и введены мотив можно рассматривать как хорошо охарактеризован, скремблированный или обратная аминокислотная последовательность может быть включена в качестве дополнительного отрицательного контроля.
5. Промыть три раза водой и стерилизуют в 50% изопропанол / вода в течение по крайней мере 30 мин. До посева клеток, RINSе образцы в стерильном физиологическом растворе с фосфатным буфером (PBS).

3. Посев Cell

1. Grow HUVECs с использованием процедур культивирования клеток стандарт ^17,18.
2. Поместите пептидные-конъюгированные образцы с модифицированной стороной вверх в 24-луночные планшеты. Использование необработанной PTFE дисков в качестве контроля.
3. Семя 5 х 10 ⁴ HUVECs в 2 мл среды на лунку и инкубировать в течение 4 ч при температуре 37 ° С и 5% СО ₂ в инкубаторе.
4. Удалите диски, промойте тщательно, чтобы удалить клетки и неприкрепленные передавать на свежий 24-луночного планшета. Добавляют 2 мл свежей среды и инкубировать в течение требуемого периода (например, 24 часа в сутки, 1 ш и т.д.). Изменение средних каждые два дня.
5. Подготовка исходного раствора 1 мг / мл кальцеином AM в диметилсульфоксиде (ДМСО).
6. После выращивания клеток удаления среды, промывают PBS и добавляют PBS , содержащего 1 мкл / мл кальцеин-АМ краситель (например, 1 мкл исходного раствора на мл PBS). Аккуратно агитировать и incubatе при 37 ° С в течение 45 мин в темноте.
7. Мытье с PBS и немедленно принять микрофотографии на флуоресцентный микроскоп оснащен стандартными FITC фильтрами (Ex 488 нм, Em 515 нм). С помощью 100-кратным увеличением. Выполните трехкратном повторе из немодифицированного, а также обработанные образцы.
8. С помощью программного обеспечения ImageJ определить площадь колонизировали клеток. В качестве альтернативы подсчитывать клетки вручную или с помощью ImageJ. Оба метода дают аналогичную информацию о прикрепленном и роста клеток на соответствующих поверхностях.

Результаты

Результаты важнейших химических стадий реакции контролировали с помощью ИК - спектроскопии (рис 1). Первоначальная активация нафталенидом натрия порождает двойные связи - и в незначительной степени - ОН-функциональные возможности. Сигнал, указывающий С = С св?...

Обсуждение

Подробное описание протокола модификации поверхности ПТФЭ состоит из последовательных этапов , начиная с преодолением фтора из полимерной цепи , как показано на рисунке 6. В результате, слой образуется , который содержит большое количество конъюгированных двойных углерод-угл...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PTFE foil 0.5 mm	Cadillac Plastic	n/a
REDV peptide	Genecust	n/a	custom synthesis >95% purity
iso-propanol	Sigma Aldrich	34965
tetrahydrofurane (THF)	Sigma Aldrich	401757
dimethylsulfoxide	Sigma Aldrich	D8418
molecular sieve 3 Å	Sigma Aldrich	208574
sodium metal	Sigma Aldrich	483745
phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
naphthalene	Sigma Aldrich	147141
hydrogen peroxide 30%	Sigma Aldrich	95321
trichloroacetic acid	Sigma Aldrich	T6399
diethylene glycol diglycidyl ether	Sigma Aldrich	17741
hexamethylene diisocyanate (HMDI)	Sigma Aldrich	52650
Calcein-AM	Sigma Aldrich	56496
sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014
sodium azide	Sigma Aldrich	71290
24 well plates	Greiner-Bio-One	662 160
ATR-FTIR spectrophotometer Nicolet Magna-IR 850	Nicolet	n/a
fluorescence microscope Olympus X-70	Olympus	n/a
humbilical vein endothelial cells (HUVECs)	Lonza	n/a
ePTFE vascular graft	Gore	n/a