Adenofection: שיטה בחקר התפקיד של מלוויהם מולקולריים הסלולרית Morphodynamics ידי ניסויי דלדול-הצלה

Summary

We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.

Abstract

תהליכים תאיים כגון מיטוזה התמיינות תאים נשלטים על ידי שינויים בצורת תא נשענים ברובם על שיפוץ התקין של מבני cytoskeletal התא. זה כולל את מכלול הפירוק של מבני macromolecular מסדר גבוה בכל זמן נתון ומיקום, תהליך רגיש במיוחד להפרעות הנגרמת על ידי ביטוי יתר של חלבונים. שיטות שיכולים לשמר הומאוסטזיס חלבון ולשמור ליד אל-נורמלי מורפולוגיה הסלולר הן רצויות מאוד לקבוע את התרומה התפקודית של חלבון של עניין במגוון רחב של תהליכים תאיים. דלדול-הצלת חלוף ניסויים מבוססים על התערבות RNA גישות רבות עצמה כדי לנתח פונקציות חלבון ודרישות מבניות. עם זאת, חידוש של חלבון המטרה עם מינימום סטיות מרמתו הפיזיולוגית הוא אתגר אמיתי. כאן אנו מתארים adenofection שיטת כינה אשר פותח כדי ללמוד את התפקיד של מלווים מולקולרייםשותפי ד ב הפעולה הרגילה של תאי מתחלקים ומערכת היחסים עם שיפוץ יקטין. תאי הלה היו מתרוקנים של BAG3 עם דופלקסים siRNA מיקוד באזור 3'UTR. חלבונים BAG3-tagged GFP היו מחדש סימולטנית לאנגלית> 75% של תאים באמצעות adenoviruses רקומביננטי מצמידים את ריאגנטים transfection. Adenofection לאפשר להביע חלבונים BAG3-GFP ברמות פיזיולוגיות ליד בתאים הלה מדולדל של BAG3, בהעדר תגובת הלחץ. אין השפעה נצפתה על הרמות של מלוות חלבון הלם חום אנדוגני, רגולטורי מתח מושרה הראשיים של הומאוסטזיס חלבון. יתר על כן, על ידי הוספת baculoviruses נהיגת הביטוי של סמני ניאון בזמן-transfection התמר תא, נוכל לנתח דינמיקת תא mitotic ידי מיקרוסקופי זמן לשגות מנתח עם הפרעות מינימום של התקדמות mitotic הנורמלית. Adenofection ישימה גם לתאי עכבר שקשה להדביק, ומתאים עבור ניתוחים תפקודיים של diff myoblasterentiation לתוך myotubes. לפיכך adenofection מספק שיטה צדדית לבצע מבנה-תפקוד המנתח של חלבונים מעורבים בתהליכים ביולוגיים רגישים המסתמכים על דינמיקת cytoskeletal מסדר גבוה.

Introduction

איון פונקציונלי של ביטוי גנים בתאי יונקים הוא תקן הזהב לנתח פונקציות חלבון. חדש הטכנולוגיות שפותחו של עריכת הגנום מבוסס על השימוש nucleases באתר ספציפי כגון nucleases אבץ-אצבע התקבצו בקביעות interspaced חזרות palindromic קצר (CRISPR) / CAS9 כעת לאפשר לדור של שורות תאים עם המחיקה הגן ממוקדות מוטציה ^1,2. גישות חדשות אלו צריכות לחולל מהפכה באופן שבו אנו לומדים תפקוד חלבון ואת הבנתנו את הגנטיקה של מחלות אנושיות. בחלק מהמקרים, לעומת זאת, לטווח ארוך או נוקאאוט גנטי שלם אינו רצוי ועלול לעורר מנגנוני פיצוי התא המשני. הדור של שורות תאים מהונדסים גנטית יכול להיות גם להגביל כשדנים בתרביות תאים ראשוניים עם קיבולת התפשטות מוגבלת, או כאשר ההקרנה של רשימה ארוכה של מוטציות תאים מסוגים שונים הוא ביקש. זה נדרש לעתים קרובות לקביעת התלות של b התאתהליך iological על דרישות מבניות של חלבון. לשם כך, מציאה הפיכה על ידי התערבות RNA המאפשרת ניסויים-הצלת דלדול חולפים ברקע הסלולר שונה עדיין גישה פשוטה ורב עצמה כדי לבצע מבנה-תפקוד המנתח של חלבון של עניין ^3. עם זאת, חסרון עיקרי של גישה זו הוא הקושי להשיג השתקה יעילה לחדש את החלבון של עניין או גרסותיה ברמות הפיזיולוגיות קרובות מוצג רוב אוכלוסיית התא. זה חיוני כדי לאפשר מחקרים מקיפים המנסים לתאם השפעות פונקציונליות לראות ברמה של תאים בודדים (פנוטיפ hypomorphic) לאלו שנראו מבוססי מבחני אוכלוסיית תאים, למשל על אינטראקציות בין חלבונים.

שימוש בשיטות transfection קלסיים, נדמה שאי אפשר להשיג ביטוי הומוגנית ונמוך של חלבונים אקסוגניים אוכלוסייה גדולה של תאים. התמרה של תאים עם וירוסים רקומביננטיכמו adenoviruses מאפשר לעתים קרובות ביטוי מנורמל יותר של חלבונים אקסוגניים. עם זאת, ספיגת אדנווירוס הוא מוגבל על ידי קולטן CAR, אשר נעדר בתאים שאינם בני אדם או רק הביע חלש בחלק סוגי תאים אנושיים. יתר על כן, כניסת הסלולר של adenoviruses מפעילה מסלולי איתות מווסתים ^4-6 צורת הידבקות תא. זה כמובן לא רצוי כאשר לומדים מנגנוני ויסות של morphodynamics התא. אנו עומדים בפני בעייתיים הזה כשאנחנו התחייבנו ניתוחים תפקודיים של קומפלקס מלווה, BAG3-HSPB8, חלוקת תא ואת הדינמיקה תקטין. החלוץ לעבוד תיארה תפקיד מורכב המלווה הזה בקרת איכות חלבון autophagy במהלך מתח ^7,8. רוב המחקרים האלה, לעומת זאת, הסתמכו על ביטוי יתר של חלבון, בהנחת המלווים הם שהוגברו כרגיל בזמן המתח. זה השאיר פתוח את השאלה של BAG3 אם, בקומפלקס עם HSPB8, יכול לתרום לפעילות התקינה של תאים המתחלקים להביע המלווה אסה כמו סוגים רבים של תאים סרטניים ^9. בפרט, אם מורכבי המלווה תורמים השיפוץ של מבנים מבוססים יקטינו השולטים התקדמות mitotic היה עניין רב, בהתחשב הקשרים המתעוררים בין מלווי HSPB ודינמיקת cytoskeletal ^10. כדי לטפל בבעיה זו, אנו מחפשים לפתח שיטה יעילה ניסויי דלדול-הצלה שלא תפריע להתקדמות mitotic או מורפולוגיה הסלולר, ואשר שיישמר הומאוסטזיס חלבון כדי למנוע הפרעה משנית של הדינמיקה של מתחמי macromolecular המסדיר שינויים בצורת התא . כך באופן אידיאלי, דלדול-התוספת האחורי של הגן של עניין צריך להתבצע בו זמנית.

השימוש מכלולי אדנו עם פולימר קטיוני או שומנים תואר לקדם העברת גנים במבחנת in vivo ^11,12. למשל, סידן פוספט (קאפי) מופיע לגבש משקע עםאדנו-וירוס המשפרים כניסה מחייבת באמצעות מסלול CAR-עצמאי ^13. ואכן, מצאנו כי שילוב התמרה מבוסס תאי אדנו ו transfection עם תרכובות קטיוני יכול לשפר את היעילות של ניסויי דלדול-ההצלה. זה אפשר לנו להוריד את הכמויות של נגיף על ידי 3 עד פי 20, בהתאם לקו התא ואת הגן של עניין, ותועלת מחלון רחב יותר על מנת להתאים את הביטוי של חלבונים אקסוגני ברמות אנדוגני קרובות הרוב אוכלוסייה של עניין תא עם השפעה מינימאלית על מורפולוגיה הסלולר. בתנאים כאלה, אנחנו גם יכולים להשיג מציאה יעילה גבוהה של ביטוי חלבון אנדוגני (> 75%). הנם מתארים את שיטת הצעד אחרת צעד ולספק ראיות לכך הומאוסטזיס חלבון אינו מוטרד באופן משמעותי כפי שהוערך על ידי הרמות ללא שינוי של מלוות בעקבות לחץ של מש' חלבון הלם החום, מה שהופך את השיטה מתאימה עבור ניתוחים תפקודיים של ro הפיזיולוגיle של מלווים מולקולריים ידי מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו. הפרוטוקול ניתן נהלי סנכרון תא לשימוש baculoviruses הזמין מסחרי עבור שיתוף ביטוי של רמות הנמוכות של סמני ניאון, עם התערבות מינימאלית עם מבוססים תקטינו נורמלית ודינמיקת הציר במהלך התקדמות mitotic. בנוסף, אנו מציגים את הרבגוניות של שיטה, אשר חל על "קשה transduce" בתאי עכבר C2C12, ללא השפעה משמעותית על בידול myoblast לתוך myotubes במבחנה.

Protocol

1. הכנת בינוני ופתרונות (כל סטרילי מסונן)

1. תאי שריר עכבר C2C12 (מחקרי בידול)
   1. כן 500 מיליליטר של צמיחה בינונית עבור תחזוקת תרבית תאי C2C12: גלוקוז גבוה DMEM בתוספת 10% FBS ו 2 המ"מ L- גלוטמין.
   2. כן 100 מיליליטר בידול בינוני (DM) לבידול C2C12: גלוקוז DMEM הגבוה בתוספת 2% סוס סרום.
2. תאי הלה (מחקרים בתאי mitotic)
   1. הכן 500 מ"ל αMEM לתחזוקה תרבות הלה RFP-H2B התא וניסויים: αMEM בתוספת 10 FBS% ו -2 מ"מ L- גלוטמין (αMEM ^10%).
   2. הכן 500 מ"ל αMEM-מינוס (ללא deoxyribonucleosides / ribonucleosides) לסינכרון תא הלה RFP-H2B: αMEM-מינוס בתוספת 10% FBS ו 2 מ"מ L- גלוטמין (αMEM-מינוס ^10%).
   3. הכן 20 מ"ל αMEM ללא פנול אדום עבור הלה-RFP-H2B lרכישת תא ive: αMEM ללא פנול אדום בתוספת 10 FBS% ו -2 מ"מ L- גלוטמין.
   4. הכן 100 thymidine מ"מ: להמיס 24.2 מ"ג 1 מ"ל H ₂ O ב 37 ° C על ידי vortexing. סנן לעקר ולשמור על 4 מעלות צלזיוס.
3. פתרונות משותפים
   1. הכן 0.05% טריפסין / EDTA: 0.05% טריפסין, 0.625 מ"מ EDTA ב בופר פוספט 1x (PBS). סנן לעקר aliquots ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. לאחר מופשר, לשמור aliquot על 4 מעלות צלזיוס.
   2. כן HBS2x: 280 mM NaCl, 50 HEPES מ"מ, 1.5 מ"מ Na ₂ HPO _4. התאם את ה- pH בדיוק בין 7.01-7.05 עם 10 N NaOH. סינון סטרילי ולשמור ב 4 ° C..

ציפוי 2. של צלחות תרבית תאים עם פיברונקטין ו ציפוי של תאים הלה-RFP-H2B

הערה: לפני הניסוי, כל מניפולטור צריכה להגדיר את תנאי ציפוי תא אופטימליים להשגת צפיפות נכונה של תאים מאז וריאציות עשויות OCנוכ בין כל מניפולטור וכל שורת תאים שונה.

1. היום לפני הניסוי, להרחיב תאים הלה-RFP-H2B לוודא כי הם במסגרת שלב מעריכי צמיחה ביום ציפוי. הפוך 2 רצופים 1/3 דילולים 10 צלחות ס"מ החל צלחת ס"מ 1x10 80% ומחוברות.
   הערה: תכנן את מספר הצלחות עבור הניסוי. לחשב כל תנאים ככפילויות, אחד עבור הדמיה לטווח קצר לחיות תאים ואחד עבור חלבון מוציאים כדי לקבוע את היעילות של מציאת ביטוי חלבון אקסוגני על ידי ניתוח כתם מערבי. תכנן צלחת אחת נוספת כדי לקבוע את המספר הסלולרי לפני תמרת וירוס.
2. לפני תא ציפוי, מנות תחתיות זכוכית מעיילת עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר פיברונקטין. הוסף 1 מ"ל של דילול 1: 100 של 1 מ"ג / מ"ל פיברונקטין (מדולל PBS 1x סטרילי) לכל 35 מ"מ צלחת כדי גם לכסות את כל פני השטח דגירה במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
3. במהלך הדגירה, αMEM טרום חם בתוספת wiה 10% FBS (αMEM ^10%) ו 0.05% טריפסין / EDTA על 37 מעלות צלזיוס.
4. לאחר 45 דקות של דגירה, להתחיל להכין את פתרון התא. ב למכסה המנוע סטרילית, לשאוב את המדיום מהצלחת 10 ס"מ, לשטוף פעמיים בעדינות עם 1.5 מ"ל 0.05% טריפסין / EDTA, ולהשאיר 0.5 מ"ל של EDTA טריפסין / על השאיפה האחרונה.
5. דגירת התאים במשך 2-3 דקות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. על ידי הקשה על הצלחת והתבוננות בעדינות מתחת למיקרוסקופ, לוודא שכל התאים שהופרדו. הוסף 10 מ"ל של αMEM ^10% ו פיפטה בעדינות מספר פעמים על מנת להפריד בין תאים. רוזן מדגם 10 μl של השעית התא באמצעות haemocytometer.
6. פתרון פיברונקטין לשאוב מנות תחתית זכוכית. אל תאפשר פיברונקטין להתייבש לפני ציפוי התא.
7. פלייט 1.5x10 ⁵ תאים לכל 35 צלחת מ"מ 2 מ"ל αMEM ^10% ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. ודא לאחר 30-45 דקות תחת מיקרוסקופ כי התאים הם SEPA היטבמדורג, שכן יש להם נטייה להצטבר במרכז הצלחת.
8. במידת הצורך, להתסיס את צלחות בעדינות צולבות חכם כדי לפזר מחדש את התאים. צלחת אחת 35 מ"מ צלחת נוספת למספר תנאים, על מנת לספור את מספר הסלולרי לפני התמרה וירוס.
9. לגדל תאים עד למחרת כדי להשיג צפיפות תאים של 50% לפחות. צפיפות תאים נמוכים מ -50% תוצאות לירידה משמעותית של יעילות התמר וירוס, גדלו וריאציות של ביטוי חלבון לכל תא, וגדילה רעילה לתא.
   הערה: ציפוי של כלים מזכוכית עם פיברונקטין משפר את גדילת תאים ומורפולוגיה ומקדם התקדמות נאותה של תאים דרך מיטוזה. זה יכול להיות מוחלף בדרך כלל על ידי ג'לטין הזמין מסחרי כי הוא זול יותר.

3. התמרה Adenovirus ו אנדוגני חלבון מציאה ידי siRNA Transfection בתאי הלה-RFP-H2B שימוש קאפי משקעים

זהירות! עבודהing עם וירוסים דורש אמצעי זהירות מיוחדת וכן לסילוק נאות של כל החומר כי כבר במגע עם הנגיף.

זהירות! בידיים שלנו, קאפי משקעים לעתים קרובות יש תופעות יותר רצויה, למשל על תהליכים ביולוגיים מעורבים בסחר שלפוחית ​​(למשל, autophagy). לפיכך מומלץ להשתמש מגיב transfection שומנים קטיוני (ראה להלן) ולהמתין לפחות 48 שעות לפני הניתוחים.

הערה: אדנו מלא נושאת גנים שאינם קשורים (כלומר, LacZ) או לא גן משמשת להגיע פנים מינימאליים בכל Adenofections (10-20 pfu / תא) באמצעות הסכום הנמוך ביותר של אדנו רקומביננטי נושא את הגן של עניין.

הערה: הליך זה הוכח לעזור ביטוי נרמול לכל תא באוכלוסייה תא גדול.

1. יום אחד לאחר ציפוי תא, לספור את מספר תאי מצלחת המצופית הנוספת. לשאוב בינונילשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל 0.05% טריפסין / EDTA. להוסיף שוב 1 מ"ל של 0.05% טריפסין / EDTA ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עד שכל התאים מנותקים. הפרד את התאים היטב בעזרת פיפטה 1ml ולספור את מספר התאים לכל מ"ל באמצעות haemocytometer.
2. לקבוע את כמות הנגיף צריך transduce תאים על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 2 יחידות להרכיב פלאק (PFU) של החלבון של עניין (POI) לכל תא ו -18 PFU לכל תא של וקטור ריק (למשל, LacZ) צריך בסך הכל 20 PFU לכל תא. במקביל transduce 4 PFU של כל baculovirus (אקטין αTubulin, GFP ו RFP-tagged בהתאמה). Transduce תא באמצעות פרוטוקול adenofection הבא. וירוסים שימשו כמתואר פוקס ואח '. ¹⁴
3. הכן במנדף סטרילי צינור פלסטיק 1.5 מיליליטר עבור כל תנאים ולהוסיף 400 μl של αMEM-מינוס חם ^10%.
4. להפשיר aliquot של וירוסים לאט על קרח, ואם יש צורך, לדלל tהוא מניות וירוס כדי pipet נפח גדול מ -1 μl כדי למזער שגיאות pipetting.
5. מוסיפים את כמות הנגיף המחושב לכל מצב לכל צינור פלסטיק 1.5 מ"ל המכיל 400 μl αMEM-מינוס ^10% ומערבבים בעדינות על ידי pipetting. מניח את מניות הווירוס מייד בחזרה ב -80 ° C כדי לשמור על פעילותה.
6. לשאוב את המדיום מן התאים פיפטה בעדינות לתערובת וירוס טיפה חכמה. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ו להתסיס את הצלחות בקפידה מתחת למכסה המנוע סטרילית כל 15 דקות במשך שעה 1 כדי גם לכסות את התאים עם הנגיף. באמצעות כמות קטנה של המדיום הופך לפשוט יותר את הקשר של הנגיף עם התאים.
7. לאחר דגירה, פיפטה בעדינות 1.6 מ"ל αMEM-מינוס ^10% על כל צלחת להשיג בנפח כולל של 2 מ"ל, להתחיל סינכרון התא על ידי הוספת thymidine 2 מ"מ ו דגירה התאים במשך שעה 2 נוסף על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ .
8. בינתיים מכינים את followi תערובת transfection siRNAng שיטת transfection קאפי (ראה איור 1). אם לא siRNA יש צורך, להחליף את כמות siRNA ידי מים סטריליים כדי לבצע transfection ריק.
9. חישוב 200 תערובת μl עבור כל תנאי, וכתוצאה מכך 400 μl לכל כפולים. הדוגמה הבאה ניתנת ריכוז siRNA סופי של 50 ננומטר צריך להיות מותאם עבור כל חלבון של עניין. בתוך צינור פלסטיק 1.5 מ"ל, פיפטה 50 μl 1 M CaCl ₂ ו -11 μl 20 מיקרומטר siRNA לתוך 139 μl סטרילי H ₂ O ומערבבים ידי vortexing. אחרי סיבוב מהיר, להוסיף בזהירות טיפה חכם 200 μl HBS2x (280 mM NaCl, 50 HEPES מ"מ, 1.5 מ"מ Na _{2 4} HPO, pH 7.01-7.05).
   הערה: קטנות הטיפין הקטנות הם משקעים, וכתוצאה מכך יעיל transfection טוב יותר. לערבב בעדינות שלוש פעמים על ידי הזרקת אוויר באמצעות μl-פיפטה 200.
10. דגירת התמהיל למשך 30 דקות ב RT. הוסף לאט נפתח חכם 200 μl של תערובת transfection לכל צלחתלהתסיס צולבות חכמות. מעבירים את הצלחות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עבור 16 שעות.
11. למחרת, לשטוף תאים פעמיים עם 2 מ"ל HEPES חם (6.7 KCl מ"מ, 150 מ"מ NaCl, 10 HEPES מ"מ, pH 7.3) ומוסיפים 2 מ"ל αMEM-מינוס ^10%. אין להמשיך עם יותר מארבעה צלחות תא בכל פעם מאז וריאציות הטמפרטורה משפיעות על האורך של מחזור התא.
12. דמיין את יעילות הזיהום תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בהגדלה של 20-40x (אוויר) ולרכוש שלוש תמונות נציג לכל מצב בשני ערוצים פלורסנט והעבירו לתיעוד. שבע שעות לאחר מכן, להוסיף thymidine 2 מ"מ ו דגירה במשך שעה 16 נוסף על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
13. למחרת, 48 שעות לאחר transfection siRNA ו הידבקות בווירוסים, לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל תמיסת מלח פוספט חיץ חם (PBS) ולשחרר במשך 7 שעות ב 2 מ"ל αMEM ^10% w / o פנול אדום עבור הדמיה תא חי או עם פנול אדום עבור מיצוי חלבון.
14. קציר תאים עבור כל תנאי 48 שעות שלאחר transfection להכנת תמציות חלבון וניתוח כתם המערבי כדי לקבוע את היעילות של מציאה ואת הביטוי של חלבון אנדוגני ^15.
    הערה: השתמש נוגדנים נגד החלבון של עניין, כמו גם נוגדנים מתאימים לשמש שולט טעינה. היעילות של מציאה צריכה להיקבע על ידי טעינת כמויות ירידה של lysates תאים בלתי מבוקרים (טרנספקציה עם siRNA שליטה), כדי לספק עקומת טיטרציה (כלומר, 1, ½, ¼, ⅛).

4. התמרה Adenovirus וחלבון אנדוגני מציאה ידי siRNA Transfection בתאי הלה שימוש מגיב transfection ליפידים קטיוני

הערה: כאן אנו מציגים פרוטוקול הותאם ניסויים שאינם כרוכים סנכרון תא ו / או כאשר transfection siRNA לא יכול להתבצע על ידי שיטת קאפי, למשל, כדי למנוע השפעות רעילות רצויות באיזה תא ליןes. פרוטוקול זה כולל גם צעד replating תא לאחר adenofection כדי לעבוד על צפיפות תאים מתאימה. בדקנו רק את מגיב transfection שומנים קטיוני.

זהירות! עבודה עם וירוסים דורשת אמצעי זהירות מיוחדת וכן לסילוק נאות של כל החומר כי כבר במגע עם הנגיף.

1. פלייט 1.75 x 10 ⁵ תאים לכל צלחת 35 מ"מ 2.5 מ"ל αMEM ^10% ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. צלחת אחת 35 מ"מ צלחת נוספת למספר תנאים, על מנת לספור את מספר הסלולרי לפני התמרה וירוס.
2. לגדל תאים עד למחרת כדי להשיג צפיפות תאים של 50% לפחות. צפיפות תאים של פחות מ -50% תוצאות לירידה משמעותית של יעילות התמר וירוס, גדלה וריאציות של ביטוי חלבון לכל תא, וגדילה רעילה לתא.
3. יום אחד לאחר ציפוי תא, לספור את מספר תאי מצלחת המצופית הנוספת. לשאובהמדיום ולשטוף פעם אחת עם 1 מ"ל 0.05% טריפסין / EDTA. להוסיף שוב 1 מ"ל של 0.05% טריפסין / EDTA ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עד שכל התאים מנותקים. תאים נפרדים גם בעזרת פיפטה 1 מ"ל ולספור את מספר התאים לכל מ"ל.
4. לקבוע את כמות הנגיף צריך transduce ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 20-40 יחידות פלאק יוצרי (PFU) של החלבון של עניין (POI) לכל תא ו 0-20 PFU לכל תא של וקטור ריק (למשל, LacZ) כדי לקבל סכום כולל של 40 PFU לכל תא.
5. הכן במנדף סטרילי צינור פלסטיק 1.5 מיליליטר עבור כל תנאים ולהוסיף 400 μl של αMEM החם ^10%.
6. להפשיר aliquot של וירוסים לאט על קרח, ואם יש צורך, לדלל את המניות וירוס כדי pipet נפח גדול מ -1 μl כדי למזער שגיאות pipetting.
7. מוסיפים את כמות הנגיף מחושב לכל מצב לכל צינור פלסטיק 1.5 מ"ל המכיל 400 μl αMEM ^10% ומערבבים בעדינות על ידי pipetting. ה מקוםדואר מניות וירוס מיד בחזרה ב -80 ° C כדי לשמור על פעילותה.
8. לשאוב את המדיום מן התאים פיפטה בעדינות לתערובת וירוס טיפה חכמה. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ו להתסיס את הצלחות בקפידה מתחת למכסה המנוע סטרילית כל 15 דקות במשך שעה 1 כדי גם לכסות את התאים עם דילול וירוס. באמצעות כמות קטנה של המדיום הופך לפשוט יותר את הקשר של הנגיף עם התאים.
9. בינתיים מכינים את תערובת transfection siRNA בעקבות שיטת transfection. אם לא siRNA יש צורך, להחליף את כמות siRNA ידי בינוני ללא בסרום לבצע transfection ריק.
   1. הדוגמה הבאה ניתנת ריכוז siRNA סופי של 50 ננומטר צריך להיות מותאם עבור כל חלבון של עניין. עבור כל adenofection, להכין צינור פלסטיק אחד 1.5 מ"ל המכיל 416 ננומטר siRNA ב 150 בינוני μl ללא בסרום (למשל, 6.25 μl 20 מיקרומטר siRNA + 144 בינוני μl ללא נסיוב) ו containi צינור פלסטיק אחד 1.5 מ"לng 6.25 μl transfection השומנים קטיוני מגיב + 144 בינוני μl ללא בסרום.
   2. מערבבים את התוכן של כל צינור פלסטיק ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים עם טפטפת 200 μl. מערבבים את התוכן של שני צינורות ומערבבים ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים עם טפטפת 200 μl. דגירה במשך 5 דקות ב RT.
10. לאחר דגירה בווירוס, פיפטה בעדינות 1.8 מ"ל αMEM ^10% על כל צלחת להשיג בנפח כולל של 2.2 מ"ל ומיד להוסיף לאט נפתח חכם לערבב transfection siRNA על כל צלחת להתסיס צולבות חכם. מעבירים את הצלחות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ למשך 24 שעות.
11. למחרת, מחדש הצלחת על התאים מפני כל צלחת 35 מ"מ לארבע צלחות 35mm חדשות 2.5 מיליליטר αMEM ^10% כל דגירה במשך 24 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
12. למחרת, 48 שעות לאחר transfection siRNA ו הידבקות בוירוסים, תאי קציר מצלחת אחד עבור כל תנאי להכנהתמציות חלבון וניתוח כתם המערבי כדי לקבוע את היעילות של מציאה ואת הביטוי של חלבון אנדוגני ^15.
    הערה: עם הצלחות הנותרות, להמשיך עם קיבוע תא, באמצעות פרוטוקול הבחירה להכפיף את דגימות ניתוח immunofluorescence עם נוגדני עניין ^14.

5. הדמיה של תא חי תאים mitotic וניתוח נתונים

1. בצע ניסויים הדמיה תא לטווח קצר לחיות על התאים mitotic עם מיקרוסקופ הפוכה מצויד בתא humidified / 5% CO ₂ / התרמו-מוסדר.
   הערה: במחקר זה, מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב (40X, 0.75 NA) שימש, המצויד EMCCD מקורר המצלמה תשלום מצמידים ב -50 ° C.
2. לפני הרכישה, לוודא כי הקאמרי הגיעה לטמפרטורה המתאימה של 37 מעלות צלזיוס.
   הערה: פעולה זו עשויה להימשך מספר שעות בהתאם למערכת המיקרוסקופית.
3. מניח את כלי התרבות ב micrתא oscope 1 hr לפני הרכישה כדי לאפשר שיווי משקל נאות של המדיום ולהימנע מוקד נסחף בשל שינויי טמפרטורה. לפקח על מצב mitotic של התאים. בנקודה זו, 10-15% של התאים צריכים להיות בשלבים המוקדמים של מיטוזה (prophase-prometaphase).
4. במהלך זמן האיזון, להגדיר את פרמטרי הרכישה כפי שנקבעו בניסויים קודמים. בדרך כלל, זמן החשיפה בשני הערוצים (488 ו 594) של 0.2-3 שניות עם עוצמת הלייזר של 100% ורגישות של 121-130 הם פרמטרים מתאימים בידינו.
   הערה: בדיקות ראשית צריך להיעשות כדי לקבוע את עוצמת הלייזר מינימום ורכישת זמן / מרווח שתוצאתן רזולוציה מתאימה עם photobleaching מינימום הגורמת נזקים התא מדאיג התקדמות mitotic.
5. בחר מספר שדות לכל תנאי על מנת לקבל מספר משמעותי של תאים לנתח מבלי לחרוג את מרווח הרכישה. באמצעות מערכת confocal דיסק מסתובבת, התקנה טיפוסית תהיה בclude ארבעה תנאים שונים, 7 תחומים לכל צלחת ו -2 ערוצי צבע (488 ו 594) עם מרווח 1.5-2 דקות על פני תקופה דקה 75.
6. בחר תאים הנמצאים בכניסה mitotic, להגדיר מחדש את הפוקוס פעם בכל התחומים נבחרו ולהתחיל רכישת מהר ככל האפשר.
7. לפקח על יציבות המערכת עבור נקודות זמן לפחות שלושה מחדש להגדיר את המיקוד במידת הצורך.
8. לאחר הדמית תא חי לטווח הקצר הראשונה של 75 דקות, תחומים חדשים של תאי mitotic עשויים להיבחר לרכוש סט שני של סרטים כדי להגדיל את מספר תאים להיות מנותחים.
9. לקבוע קריטריונים מוגדרים היטב לנתח את פנוטיפים mitotic של תאים, אשר יהיה תלוי סמנים ניאון בשימוש. פגמים מיטוזה עשויים לכלול ממושך הזמן המושקע מיטוזה (מ התמוטטות גרעינית עד anaphase), חוסר כרומוזום, נדנדת ציר, ואת קליפת blebbing ^14.

6. LifeAct-TagGFP2 Adenovirus התמרה ב Differentiating C2C12 עכבר myoblasts

הערה: פרוטוקול adenofection תופס גם לגבי myoblasts שקשה להדביק עכבר C2C12 שעבר התמיינות.

1. פלייט 2 x 10 ⁵ C2C12 תאים בצלחות 35 מ"מ תרבות במדיום הגידול על פלסטיק או על מצע של בחירה.
   הערה: התמיינות תאים משופרת על מנות gelatine- או מצופה matrigel. תכנן צלחת אחת נוספת כדי לקבוע את המספר הסלולרי לפני תמרת וירוס.
2. למחרת, תאים צריכים יגיעו ל -80% של confluency. להשרות התמיינות myoblast ידי שטיפת התאים פעמיים עם PBS חם והוספת 2 מ"ל של מדיום בידול (DM).
3. למחרת, שכותרתו כשמש 1 (D1) של בידול, transduce מיוציטים עם אדנו LifeAct-TagGFP2 לדמיין את cytoskeleton אקטין בתאים חיים. ספירת התאים מהצלחת הנוספת כמתואר תחת 3.2. חישוב 5 PFU / תא של אדנו-LifeAct-TagGFP2 ו -45 PFU / תא AdLacZ בעקבות הבחינהple המתואר בטבלה 1. כמות וירוס הכולל הוא 50 PFU / תא. וירוסים שימשו כמתואר ¹⁴
4. הכן במנדף סטרילי צינור פלסטיק 1.5 מיליליטר עבור כל תנאים ולהוסיף 400 μl של DM החם.
5. להפשיר aliquot של וירוסים לאט על קרח, ואם יש צורך, לדלל את המניות וירוס כדי pipet נפח גדול מ -1 μl כדי למזער שגיאות pipetting.
6. מוסיפים את הכמות המתאימה של חלקיקי הנגיף לכל מצב לכל צינור פלסטיק 1.5 מ"ל המכיל 400 μl DM ומערבבים בעדינות על ידי pipetting. מניח את מניות הווירוס מייד בחזרה ב -80 ° C כדי לשמור על פעילותה.
7. לשאוב את המדיום מן כלי פיפטה בעדינות לתערובת וירוס טיפה חכמה. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ ו להתסיס את הצלחות בקפידה מתחת למכסה המנוע סטרילית כל 15 דקות עבור סכום כולל של 1 שעה כדי גם לכסות את התאים עם הנגיף.
8. לאחר דגירה, פיפטה בעדינות 1.6 מ"ל DM על כל צלחת ולהמשיך את incubation עבור שעה 2 נוספת ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
9. בינתיים מכינים תערובת transfection ריק בעקבות שיטת transfection קאפי. חישוב 200 תערובת μl עבור כל תנאי. השתמש בדוגמה הבאה בנפח כולל של 400 תערובת μl.
   1. בתוך צינור פלסטיק 1.5 מ"ל, פיפטה 50 μl 1 M CaCl ₂ אל 150 μl סטרילי H ₂ O ומערבבים ידי vortexing. אחרי סיבוב מהיר, להוסיף בזהירות טיפה חכם 200 μl HBS2x (280 mM NaCl, 50 HEPES מ"מ, 1.5 מ"מ Na _{2 4} HPO, pH 7.01-7.05). לערבב בעדינות על ידי הזרקת אוויר שלוש פעמים בעזרת פיפטה 200 μl.
10. דגירת התמהיל למשך 30 דקות ב RT. להוסיף לאט נפתח חכם 200 μl של תמהיל transfection לכל צלחת להתסיס צולבות חכמות. מעבירים את הצלחות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עבור 16 שעות.
11. למחרת, לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל HEPES חם (6.7 KCl מ"מ, 150 מ"מ NaCl, 10 HEPES מ"מ, pH 7.3) ומוסיפים 2 מ"ל DM. דמיינו את infeיעילות ction תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בהגדלה של 20-40X (אוויר) ולרכוש שלוש תמונות נציג לכל מצב בשני ערוצים פלורסנט והעבירו לתיעוד.
12. בהתאם להגדרת הניסוי הרצוי, בצע בידול לתוך myotubes במשך כמה ימים. תאים יכולים להיות קבוע ובהמשך נתון ניתוח immunofluorescence או בדיקות הדמיה תא חי יכול להתבצע.

תוצאות

Transfection של פלסמיד דנ"א BAG3-GFP באמצעות שומני קטיוני היה קשור ביטוי הטרוגנית בתאים הלה, כמה תאים מראים רמות לגילוי בקושי של החלבון ואחרים הנושאים רמות BAG3 גבוהות מאוד (איור 2 א). בתאים אלה, אובדן הומאוסטזיס חלבון שמעיד הצטברות של BAG3-GFP לתוך אג...

Discussion

כאן תארנו שיטה המאפשרת ניסויי דלדול-הצל להתבצע, אשר חלו על ניתוחים תפקודיים של תהליכים ביולוגיים סלולריים, כי הם רגישים במיוחד ביטוי יתר של חלבונים המשפיעים על והרכב ודינמיקה של קומפלקסי חלבונים ומבני macromolecular. חלוקת תא mitotic היא דוגמא קיצונית של morphodynamics תא מכוון היטב ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C2C12 Mouse Myoblasts	ATCC	CRL-1772
Adenovirus custom design	Welgen	Custom design
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose	Thermo Fisher	11965-092
EDTA	Sigma	E5134
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
Fibronectin	Sigma	F1141
Glass bottom dishes, 35mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada		Klebig C et al. 2009
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
Horse Serum, New Zealand	Thermo Fisher	16050-122
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher	13778-150
Minimal Essential Medium  (MEM) Alpha	Wisent	310-101-CL
Minimal Essential Medium  (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides	Thermo Fisher	12000-022
Minimal Essential Medium  (MEM) Alpha without Phenol Red	Thermo Fisher	41061-029
Na2HPO4	Biobasic	S0404
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
OptiMEM	Thermo Fisher	11058-021
rAVCMV-LifeAct-TagGFP2	IBIDI	60121
siRNA duplexes	Dharmacon	Custom design
Thymidine	Sigma	T9250
Trypsine 2.5%	Thermo Fisher	15090-046