Adenofection: метод изучения роли молекулярных шаперонов в клеточных морфодинамики истощением-спасательных экспериментов

Резюме

We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.

Аннотация

Клеточные процессы, такие как митоза и дифференциации клеток регулируется изменением формы клеток, которые в значительной степени полагаются на соответствующую ремоделирования клеточных структур цитоскелета. Это включает в себя монтаж-демонтаж макромолекулярных структур высшего порядка в данный момент времени и местоположения, процесс, который особенно чувствителен к возмущениям, вызванных избыточной экспрессии белков. Методы, которые могут сохранять белковый гомеостаз и поддерживать почти к нормальной клеточной морфологии весьма желательны для определения функционального вклада интересующего белка в широком диапазоне клеточных процессов. Переходные эксперименты истощения-спасательных работ, основанного на интерференции РНК являются мощными подходы для анализа функций белка и структурных требований. Тем не менее, повторное включение в состав белка-мишени с минимальным отклонением от его физиологического уровня является реальной проблемой. Здесь мы опишем метод называется adenofection, который был разработан, чтобы изучить роль молекулярных шапероновг партнеров в нормальной работе делящихся клеток и отношения с актина ремоделирования. HeLa клетки были истощены BAG3 с миРНК дуплексы ориентации на 3'UTR область. GFP-меченных белков BAG3 вновь были введены одновременно в> 75% клеток с использованием рекомбинантных аденовирусов, соединенных с реагентов трансфекции. позволило Adenofection выразить BAG3-GFP белки на близких физиологических уровнях в клетках HeLa, истощенных BAG3, при отсутствии ответа на стресс. Никакого эффекта не наблюдалось на уровни эндогенных белков теплового шока наставниками, основные стресс-индуцируемых регуляторов белка гомеостаза. Кроме того, путем добавления бакуловирусов вождения экспрессии флуоресцентных маркеров во время клеточной трансдукции трансфекции, мы могли бы рассекать динамику митотических клеток путем покадровой микроскопического анализа с минимальным возмущением нормальной прогрессии митоза. Adenofection применимо также к клеткам труднодоступных Infect мыши, и подходит для функциональных анализов миобластов Differentiation в мышечных трубках. Таким образом, adenofection обеспечивает универсальный метод для выполнения структуры-функции анализа белков, участвующих в чувствительных биологических процессов, которые опираются на динамику цитоскелета высшего порядка.

Введение

Функциональная инактивация экспрессии генов в клетках млекопитающих является золотым стандартом рассекать функции белка. Недавно разработанные технологии редактирования генома , основанные на использовании нуклеаз конкретных участков , таких как нуклеаз цинкового пальца и кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы (CRISPR) / cas9 теперь позволяют генерацию клеточных линий с целенаправленным делеции гена и мутации ^1,2. Эти новые подходы должны революционизировать способ, которым мы изучаем функцию белка и наше понимание генетики заболеваний человека. В некоторых случаях, однако, долгосрочный или полный нокаут гена не является желательным и может спровоцировать вторичные компенсационные механизмы клеток. Генерирование генетически модифицированных клеточных линий также может быть ограничение при работе с первичными культурами клеток с ограниченной способностью пролиферации, или при скрининге большого множества мутаций в различных типах клеток ищется. Это часто требуется для определения зависимости ячейки Ьiological процесс структурных требований белка. С этой целью, обратимы нокдаун РНК интерференции , который позволяет переходных экспериментов истощения-спасательных работ в различных клеточных фонов по- прежнему остается простой и мощный подход для выполнения структуры-функции анализа интересующего белка ^3. Тем не менее, основным недостатком такого подхода является трудность достижения эффективного глушителей и вновь ввести интересующий белок или его вариантов на вблизи физиологических уровней в большинстве клеточной популяции. Это очень важно для того, чтобы комплексные исследования, которые пытаются соотнести функциональные эффекты, наблюдаемые на уровне отдельных клеток (гипоморфными фенотип) с тем, которые наблюдаются в анализах населения на основе клеток, например, на белок-белковых взаимодействий.

Используя классические методы трансфекции, трудно добиться однородной и низкую экспрессию экзогенных белков в большой популяции клеток. Трансдукции клеток с рекомбинантными вирусамикак аденовирусы часто позволяет более нормализованное экспрессии экзогенных белков. Тем не менее, аденовирус поглощение ограничено рецептором CAR, который отсутствует в не-клетках человека или слабо выражены в некоторых типах клеток человека. Кроме того, клеточная запись аденовирусов активирует пути , которые регулируют формы клеток и адгезии ^4-6 сигнализации. Это, очевидно, не желательно при изучении механизмов регуляции клеточных морфодинамики. Мы столкнулись с этой проблематикой, когда мы провели функциональный анализ шаперонного комплекса, BAG3-HSPB8, в делении клеток и динамики актина. Новаторская работа была описана роль этого комплекса в шаперонного контроля качества белка и аутофагии во время стресса ^7,8. Большинство из этих исследований, однако, полагаться на белок избыточной экспрессии, предполагая, что наставники, как правило, усиливает свою активность во время стресса. Это остается открытым вопрос о том, BAG3, в комплексе с HSPB8, может способствовать нормальному функционированию делящихся клеток, экспрессирующих-еESE наставники , как и многие типы раковых клеток ^9. В частности, способствует ли сопровождающий комплекс с перепланировкой актина на основе структур , которые контролируют митоза представляет большой интерес, учитывая возникающие связи между HSPB наставниками и динамики цитоскелета ^10. Для решения этой проблемы, мы стремились разработать эффективный метод истощения-спасательных экспериментов, которые не будут мешать митоза или клеточной морфологии, и который позволит сохранить белка гомеостаза чтобы избежать вторичного возмущения динамики макромолекулярных комплексов регулирования изменения клеточного формы , Таким образом, в идеале, истощение-надстройку задней части представляющего интерес гена должны быть выполнены одновременно.

Использование комплексов аденовируса с катионным полимером или липидов было описано для содействия передаче генов в пробирке и в естественных условиях ^11,12. Например, фосфат кальция (çapı), как представляется, с образованием осадка саденовирус , которые усиливают вируса связывающего запись через CAR-независимого пути ^13. Действительно, мы обнаружили, что объединение на основе аденовирусов трансдукции клеток и трансфекцию с катионными соединениями может повысить эффективность экспериментов истощения-спасательных работ. Это позволило снизить количество вируса от 3- до 20-кратного, в зависимости от клеточной линии и представляющего интерес гена, и извлекают пользу из широкого окна для того, чтобы регулировать экспрессию экзогенных белков на близких эндогенных уровней в большинстве клеточной популяции, представляющей интерес с минимальным воздействием на клеточной морфологии. В таких условиях, мы могли бы также достичь высокой эффективности нокдаун экспрессии эндогенного белка (> 75%). Настоящим описывают шаг за шагом метод и предоставить доказательства того, что белок гомеостаз существенно не возмущенный, оцененной по неизменных уровней индуцированных стрессом шаперонов семейства белков теплового шока, что делает этот метод пригоден для функциональных анализов физиологической роле молекулярных шаперонов путем покадровой видео микроскопии. Протокол поддается процедур синхронизации клеток и с использованием коммерчески доступных бакуловирус для коэкспрессией низких уровней флуоресцентных маркеров, с минимальным вмешательством в нормальных актина основе и шпиндельных динамики во время митоза. Мы также показать универсальность метода, который применим к "трудно трансдукции" С2С12 клетки мыши, без существенного влияния на миобластов дифференцировки в мышечных трубках в пробирке.

протокол

1. Получение средних и растворов (все стерильно фильтруют)

1. Клетки мыши мышцы C2C12 (дифференциация исследований)
   1. Приготовьте 500 мл питательной среды для С2С12 поддержания клеточной культуры: DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% FBS и 2 мМ L-глутамина.
   2. Приготовьте 100 мл Дифференциация среда (DM) для С2С12 дифференциации: DMEM с высоким содержанием глюкозы, дополненной 2% лошадиной сыворотки.
2. HeLa клетки (исследования в митотических клетках)
   1. Приготовьте 500 мл αMEM для HeLa ЗП-Н2В технического обслуживания и экспериментов клеточной культуры: αMEM , дополненной 10% FBS и 2 мМ L-глутамина (αMEM ^10%).
   2. Приготовьте 500 мл αMEM-минус (без деоксирибонуклеозидами / рибонуклеозидов) для синхронизации ЗП-Н2В клеток HeLa: αMEM-минус , дополненной 10% FBS и 2 мМ L-глутамина (αMEM-минус ^10%).
   3. Приготовьте 20 мл αMEM без фенолового красного для HeLa-RFP-Н2В лАйв соте: αMEM без фенолового красного с добавлением 10% FBS и 2 мМ L-глутамина.
   4. Подготовьте 100 мМ тимидина: растворить 24,2 мг в 1 мл H ₂ O при 37 ° С с помощью встряхивания. Фильтр стерилизовать и хранить при температуре 4 ° C.
3. Общие решения
   1. Готовят 0,05% трипсин / ЭДТА: 0,05% трипсина, 0,625 мМ ЭДТА в 1X фосфатным буферным раствором (PBS). Фильтр стерилизовать и хранить аликвоты при -20 ° С. После оттаивания держать аликвоты при температуре 4 ° С.
   2. Приготовьте HBS2x: 280 мМ NaCl, 50 мМ HEPES, 1,5 мМ Na ₂ HPO _4. Регулировка рН точно между 7,01-7,05 с помощью 10 N NaOH. Фильтр стерильными и хранить при температуре 4 ° С.

2. Покрытие клеточной культуры пластин с фибронектина и обшивке HeLa-RFP-Н2В клеток

Примечание: Перед началом эксперимента каждый манипулятор должен создать оптимальные условия ячейки обшивки для достижения надлежащей плотности клеток, так как изменения могут Остекущ между каждым манипулятором и каждой другой клеточной линией.

1. За день до начала эксперимента, расширить HeLa-RFP-Н2В клетки, чтобы убедиться, что они находятся в экспоненциальной фазе роста в день посева. Сделайте 2 последовательных 1/3 разведений в 10 см пластинах, начиная с 80% сливающийся 1x10 см пластины.
   Примечание: Планирование количества пластин для эксперимента. Рассчитать каждое условие как дублирующий, один для краткосрочных живых клеток изображений и один для белковых экстрактов, чтобы определить эффективность нокдауна и экзогенной экспрессии белка методом Вестерн-блот-анализа. План одну дополнительную пластину для определения количества клеток перед вирусной трансдукции.
2. До клеточной обшивки, пальто со стеклянным дном блюда с 10 мкг / мл фибронектина. Добавить 1 мл 1: 100 разбавлении 1 мг / мл фибронектина (разбавленного в стерильном 1x PBS) на 35 мм чашку , чтобы хорошо покрыть всю поверхность и инкубировать в течение 1 часа при температуре 37 ° С, 5% СО _2.
3. Во время инкубации, предварительно теплой αMEM дополнена Wiй 10% FBS (αMEM ^10%) и 0,05% трипсин / ЭДТА при 37 ° С.
4. Через 45 мин инкубации начинают приготовления раствора клеток. В стерильных капот, аспирация среды от 10 см планшете, полоскание осторожно дважды 1,5 мл 0,05% трипсина / EDTA, и оставить 0,5 мл трипсин / ЭДТА в последнем аспирацией.
5. Инкубируйте клетки в течение 2-3 мин при температуре 37 ° С, 5% СО _2. Прижав пластину и наблюдения под микроскопом, убедитесь, что все клетки были отделены. Добавьте 10 мл ^10% αMEM и пипеток аккуратно несколько раз , чтобы отделить клетки. Количество образца 10 мкл суспензии клеток с использованием гемоцитометра.
6. Отберите раствор фибронектина из стекла дна посуды. Не позволяйте фибронектин высохнуть перед клеточной обшивки.
7. Пластина 1.5x10 ⁵ клеток на 35 мм блюдо в 2 мл αMEM ^10% и инкубируют при температуре 37 ° С, 5% СО _2. Проверка после 30-45 мин под микроскопом, что клетки хорошо SEPAспроектировано, поскольку они имеют тенденцию к накоплению в центре пластины.
8. При необходимости, агитировать пластины аккуратно крест-накрест, чтобы перераспределить клетки. Пластина один 35 мм пластина дополнительно к числу условий для подсчета количества клеток перед вирусной трансдукции.
9. растут клетки на следующий день, чтобы достичь плотности клеток, по крайней мере на 50%. Плотность клеток ниже, чем 50% приводит к значительному снижению эффективности вирусной трансдукции, увеличение вариаций экспрессии белка на клетку, и повышенной токсичности клеток.
   Примечание: Покрытие стеклянной посуды с фибронектина улучшает клеточный рост и морфологию и способствует правильному прогрессию клеток путем митоза. Как правило, он может быть заменен на коммерчески доступного желатина, который дешевле.

3. аденовирус трансдукции и эндогенного белка Нокдаун от миРНК Трансфекция в HeLa-RFP-Н2В клеток с использованием чапи осаждается

Внимание! РаботаИНГ вирусами требует специальных мер предосторожности и надлежащей утилизации всех материалов, которые были в контакте с вирусом.

Внимание! В наших руках, чапи осаждается часто имеют более нежелательные эффекты, например , на биологических процессах , связанных с торговлей везикул (например, аутофагии). В соответствии с этим рекомендуется использовать катионный липидный реагент трансфекции (смотри ниже) и подождать, по крайней мере, 48 часов до анализа.

Примечание: Контрольный аденовирус , несущий ген , не связанный (т.е. LacZ) , либо оно ген используется для достижения минимального MOI во всех Adenofections (10-20 КОЕ / клетку) , используя наименьшее количество рекомбинантного аденовируса , несущего интересующий ген.

Примечание: Эта процедура, как было показано, чтобы помочь нормализующее экспрессию на клетку в большой популяции клеток.

1. Однажды после того, как клетки обшивкой, подсчитывать количество клеток из дополнительных гальванопокрытием блюдо. Аспирируйте среды иполоскать один раз с 1 мл 0,05% трипсина / EDTA. Добавить снова 1 мл 0,05% трипсина / EDTA и инкубировать при 37 ° C, 5% CO ₂ , пока все клетки не отсоединена. Отдельные клетки хорошо используя 1мл пипетку и подсчитывают количество клеток на мл с использованием гемоцитометра.
2. Определить количество вируса , необходимого для трансдукции клеток при множественности инфекции (MOI) 2 бляшкообразующих единиц (PFU) белка интереса (POI) на клетку и 18 БОЕ на клетку пустого вектора (например, LacZ) иметь в общей сложности 20 БОЕ на клетку. В то же время трансдукции 4 БОЕ каждого бакуловируса (актин и αTubulin, GFP и RFP-меченый соответственно). Трансдукции клеток с использованием следующего протокола adenofection. Вирусы были использованы , как это описано в Fuchs и соавт. ¹⁴
3. Подготовьте в стерильной капот пластиковой трубки 1,5 мл для каждого условия и добавить 400 мкл теплого αMEM-минус ^10%.
4. Растаяйте аликвоты вирусов медленно на льду и, при необходимости, разбавить тон вирусный, чтобы пипеткой объемом более 1 мкл, чтобы свести к минимуму ошибки пипетирования.
5. Добавить расчетное количество вируса на состоянии каждого 1,5 мл пластиковую пробирку , содержащую 400 мкл αMEM-минус ^10% и аккуратно перемешать с помощью пипетки. Поместите вирусный немедленно назад при -80 ° С, чтобы сохранить свою активность.
6. Аспирируйте среду из клеток и осторожно пипеткой по каплям смесь вируса. Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ и тщательно перемешивать пластины под стерильным колпаком каждые 15 мин в течение 1 часа , чтобы хорошо покрыть клетки с вирусом. С помощью небольшого количества среды облегчает контакт вируса с клетками.
7. После инкубации, осторожно пипеткой 1,6 мл αMEM-минус ^10% к каждой пластине , чтобы получить общий объем 2 мл, начать синхронизацию клеток путем добавления 2 мМ тимидина и инкубировать клетки еще в течение 2 ч при температуре 37 ° С, 5% СО ₂ ,
8. В то же время, подготовить followi трансфекция микс миРНКнг метод трансфекции Капи (рисунок 1). Если нет миРНК нет необходимости заменить количество миРНК стерильной водой для выполнения пустой трансфекцию.
9. Подсчитайте 200 мкл смеси для каждого из условий, что приводит к 400 мкл на дубликате. Следующий пример приведен для конечной концентрации киРНК 50 нМ и должен быть адаптирован для каждого интересующего белка. В пластиковой пробирке 1,5 мл, 50 мкл 1 М CaCl ₂ и 11 мкл 20 мкМ миРНК в 139 мкл стерильной H ₂ O и перемешать встряхиванием. После быстрого вращения, добавьте осторожно по каплям 200 мкл HBS2x (280 мМ NaCl, 50 мМ HEPES, 1,5 мМ Na ₂ HPO _4, рН 7,01-7,05).
   Примечание: Чем меньше капель тем меньше осадки, что приводит к лучшей эффективности трансфекции. Аккуратно перемешайте три раза путем инъекции воздуха с использованием 200 мкл-пипетки.
10. Выдержите смесь в течение 30 мин при комнатной температуре. Медленно добавляйте по каплям 200 мкл трансфекции смеси в каждую чашку иагитировать крест-накрест. Передача пластин при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ в течение 16 часов.
11. На следующий день, ополосните клетки дважды 2 мл теплой HEPES (6,7 мМ KCl, 150 мМ NaCl, 10 мМ HEPES, рН 7,3) и добавляют 2 мл αMEM-минус ^10%. Не продолжайте с более чем четырех клеточных пластин в то время, так как колебания температуры влияют на продолжительность клеточного цикла.
12. Визуализируйте эффективность инфекции под инвертированным флуоресцентным микроскопом при увеличении 20-40x (воздуха) и получить три представительных изображений в состоянии в обоих флуоресцентных и передачи каналов для документации. Семь часов спустя, добавьте 2 мМ тимидина и инкубировать еще в течение 16 ч при 37 ° С, 5% СО _2.
13. На следующий день, через 48 часов после того, как миРНК трансфекции и вирусной инфекции, промыть клетки дважды 2 мл теплого фосфатного буферного солевого раствора (PBS) и выпустить в течение 7 ч в 2 мл αMEM ^10% вес / O феноловый красный для получения изображений живых клеток или с фенолом Красный для извлечения белка.
14. Урожай клетки для каждого условия 48 ч после трансфекции для получения белковых экстрактов и Вестерн - блоттинга , чтобы определить эффективность нокдауна и экспрессию эндогенного белка ^15.
    Примечание: Используйте антитела против белка, представляющего интерес, а также соответствующих антител, выступающей в качестве контрольной нагрузки. Эффективность нокдаун должна определяться путем загрузки уменьшающиеся количества контроля клеточных лизатов (трансфицировали управления миРНК), чтобы обеспечить кривой титрования (т.е. 1, ½, ¼, ⅛).

4. аденовирусом трансдукция и эндогенного нокдаун белка с помощью миРНК трансфекции в HeLa клеток с использованием катионного липида Реагент для трансфекции

Примечание: Здесь мы приводим протокол, который был адаптирован для экспериментов, которые не связаны с синхронизацией клеток и / или когда миРНК трансфекции не может быть выполнена с помощью метода çapı, например, чтобы избежать нежелательных токсических эффектов в какой-то клетке линэс. Этот протокол также включает в себя этап ячейки replating после adenofection для того, чтобы работать при подходящей плотности клеток. Мы проверили только катионного липидного реагента трансфекции.

Внимание! Работа с вирусами требует специальных мер предосторожности и надлежащей утилизации всех материалов , которые были в контакте с вирусом.

1. Пластина 1,75 х 10 ⁵ клеток на 35 мм блюдо в 2,5 мл αMEM ^10% и инкубируют при температуре 37 ° С, 5% СО _2. Пластина один 35 мм пластина дополнительно к числу условий для подсчета количества клеток перед вирусной трансдукции.
2. растут клетки на следующий день, чтобы достичь плотности клеток, по крайней мере на 50%. Плотность клеток меньше, чем 50% приводит к значительному снижению эффективности вирусной трансдукции, увеличение вариаций экспрессии белка на клетку, и повышенной токсичности клеток.
3. Однажды после того, как клетки обшивкой, подсчитывать количество клеток из дополнительных гальванопокрытием блюдо. придыхательныйсреда и прополоскать один раз с 1 мл 0,05% трипсина / EDTA. Добавить снова 1 мл 0,05% трипсина / EDTA и инкубировать при 37 ° C, 5% CO ₂ , пока все клетки не отсоединена. Отдельные клетки хорошо с помощью 1 мл пипетки и подсчитывают количество клеток на мл.
4. Определить количество вируса , необходимого для трансдукции множественности инфекции (MOI) 20-40 бляшкообразующих единиц (PFU) белка интереса (POI) на клетку и 0-20 БОЕ на клетку пустого вектора (например, LacZ), чтобы иметь в общей сложности 40 БОЕ на клетку.
5. Готовят в стерильной капот пластиковой трубки 1,5 мл для каждого условия и добавить 400 мкл теплого αMEM ^10%.
6. Растаяйте аликвоты вирусов медленно на льду и, при необходимости, разбавить вирусный, чтобы пипетка объемом более 1 мкл, чтобы свести к минимуму ошибки пипетирования.
7. Добавить расчетное количество вируса на состоянии каждого 1,5 мл пластиковую пробирку , содержащую 400 мкл αMEM ^10% и аккуратно перемешать с помощью пипетки. Место йе вирусный немедленно назад при -80 ° С, чтобы сохранить свою активность.
8. Аспирируйте среду из клеток и осторожно пипеткой по каплям смесь вируса. Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ и тщательно перемешивать пластины под стерильным колпаком каждые 15 мин в течение 1 часа , чтобы хорошо покрыть клетки с вирусом разведения. С помощью небольшого количества среды облегчает контакт вируса с клетками.
9. В то же время, подготовить трансфекции смесь миРНК следуя методу трансфекции. Если нет миРНК нет необходимости заменить количество миРНК средой без сыворотки , чтобы выполнить пустую трансфекцию.
   1. Следующий пример приведен для конечной концентрации киРНК 50 нМ и должен быть адаптирован для каждого интересующего белка. Для каждого adenofection, подготовить один 1,5 мл пластиковую трубку , содержащую 416 нМ миРНК в 150 мкл среды без сыворотки (например, 6,25 мкл 20 мкМ миРНК + 144 мкл среды без сыворотки) и один containi пластиковая трубка 1,5 млнг 6,25 мкл катионного реагента липидная трансфекция + 144 мкл среды без сыворотки.
   2. Смешайте содержимое каждой пластиковой трубки с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз с 200 мкл пипетки. Смешайте содержимое обеих трубок и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз с 200 мкл пипетки. Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре.
10. После инкубации с вирусом, осторожно пипеткой 1,8 мл αMEM ^10% к каждой пластине , чтобы получить общий объем 2,2 мл , и сразу же добавляют медленно по каплям смесь для трансфекции миРНК к каждой пластине и перемешивать крест-накрест. Передача пластин при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ в течение 24 часов.
11. На следующий день, повторно пластины клеток из каждого 35 - мм пластины в четыре новых 35 - миллиметровых пластин в 2,5 мл αMEM по ^10% , и инкубируют в течение еще ​​24 ч при температуре 37 ° С, 5% СО _2.
12. На следующий день, 48 ч после трансфекции миРНК и вирусной инфекции, урожай клеток из одной пластины для каждого условия для подготовкибелковые экстракты и Вестерн - блот - анализ , чтобы определить эффективность нокдауна и экспрессию эндогенного белка ^15.
    Примечание: С помощью остальных пластин, продолжить фиксации клеток, используя протокол выбора и подвергнуть образцы для анализа иммунофлуоресценции с антителами , представляющих интерес ^14.

5. Живая ячейки изображения делящихся клеток и анализа данных

1. Выполните краткосрочные эксперименты визуализации живых клеток на митотических клеток с помощью инвертированного микроскопа , оснащенного / Термо регулируемой камере увлажняется / 5% CO _2.
   Примечание: В данном исследовании использовался вращающийся диск конфокальной микроскопии (40X, 0,75 NA), снабженный EMCCD охлаждением с зарядовой связью камеру при температуре -50 ° C.
2. До приобретения, убедитесь, что камера достигла нужной температуры 37 ° C.
   Примечание: Это может занять несколько часов в зависимости от микроскопической системы.
3. Поместите посуду культуры в MICRoscope камера 1 час до приобретения для обеспечения надлежащего равновесия среды и избежать фокуса дрейфует из-за изменений температуры. Монитор митотического состояния клеток. На данный момент, на 10-15% клеток должны быть на ранних стадиях митоза (профазы-прометафазе).
4. Во время уравновешивания настроить параметры сбора данных, как определено в предыдущих экспериментах. Как правило, время экспозиции для обоих каналов (488 и 594) от .2-3 сек с интенсивностью лазерного 100% и чувствительностью 121-130 являются подходящими параметрами в наших руках.
   Примечание: Первые тесты должны быть сделаны, чтобы определить минимальную интенсивность лазерного излучения и времени измерения / интервал, который приведет к соответствующей резолюции с минимальным фотообесцвечивания, который вызывает повреждения клеток и возмущению митоза.
5. Выбрать несколько полей на каждое условие, чтобы получить значительное количество клеток для анализа без превышения интервала оцифровки. Используя вращающийся диск конфокальной системы, типичная установка будет вчетыре различных заключить, условия, 7 полей для каждой пластины и 2 цветовых каналов (488 и 594) с интервалом 1,5-2 мин в течение 75 мин периода.
6. Выберите ячейки, которые в митотической записи, повторно установить фокус были выбраны сразу все поля и начать приобретение как можно быстрее.
7. Монитор стабильности системы, по крайней мере, три момента времени, и повторно установить фокус, если это необходимо.
8. После первого кратковременного живой ячейки изображения 75 мин, новые области митотических клеток, могут быть выбраны, чтобы получить второе множество фильмов, чтобы увеличить количество клеток анализируемого.
9. Определить четко определенные критерии для анализа митотические фенотипы клеток, которые будут зависеть от флуоресцентных маркеров используются. Дефекты в митоза могут включать в себя длительное время , проведенное в митоза (от ядерного распада до анафазы), хромосомные перекоса, покачиваясь шпинделя и коры блеббинга ^14.

6. LifeAct-TagGFP2 аденовирус трансдукции в Differentiatinг C2C12 миобластов мышей

Примечание: Протокол adenofection также применим к труднодоступные Infect миобластов мыши С2С12 подвергаться дифференциации.

1. Пластина 2 × 10 ⁵ клеток в C2C12 культуральных чашках 35 мм в ростовой среде на пластике или на подложке из выбора.
   Примечание: Дифференциация клеток улучшается на gelatine- или Матригель покрытием блюд. План одну дополнительную пластину для определения количества клеток перед вирусной трансдукции.
2. На следующий день клетки должны достигли 80% сплошности. Индуцируют миобластов дифференциацию путем промывки клеток дважды с теплым PBS и добавлением 2 мл дифференциации среды (DM).
3. На следующий день, помечены как 1-й день (D1) дифференциации, трансдукции миоцитов с аденовирусной LifeAct-TagGFP2 для визуализации актина цитоскелета в живых клетках. Подсчитайте количество клеток с дополнительной пластины, как описано в разделе 3.2. Рассчитать 5 БОЕ / клетку LifeAct-TagGFP2 аденовируса и / клеток AdLacZ 45 PFU следующий экзаменаPLE описаны в таблице 1. Общее количество вируса составляет 50 КОЕ / клетку. Вирусы были использованы , как описано ¹⁴
4. Готовят в стерильной капот пластиковой трубки 1,5 мл для каждого условия и добавить 400 мкл теплого DM.
5. Растаяйте аликвоты вирусов медленно на льду и, при необходимости, разбавить вирусный, чтобы пипетка объемом более 1 мкл, чтобы свести к минимуму ошибки пипетирования.
6. Добавьте соответствующее количество вирусных частиц на состоянии каждого 1,5 мл пластиковую пробирку, содержащую 400 мкл DM и осторожно перемешать с помощью пипетки. Поместите вирусный немедленно назад при -80 ° С, чтобы сохранить свою активность.
7. Аспирируйте среду из блюд и осторожно пипеткой по каплям смесь вируса. Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ и тщательно перемешивать пластины под стерильным колпаком каждые 15 мин в течение в общей сложности 1 ч , чтобы хорошо покрыть клетки с вирусом.
8. После инкубации, осторожно пипеткой 1,6 мл DM на каждую тарелку и продолжить Incubation еще в течение 2 ч при температуре 37 ° С, 5% СО _2.
9. В то же время, подготовить пустой трансфекции смесь следующего метода трансфекции чапи. Вычислить 200 мкл смеси для каждого условия. Используйте следующий пример для общего объема 400 мкл смеси.
   1. В пластиковой пробирке 1,5 мл, 50 мкл 1 М CaCl ₂ в 150 мкл стерильной H ₂ O и перемешать встряхиванием. После быстрого вращения, добавьте осторожно по каплям 200 мкл HBS2x (280 мМ NaCl, 50 мМ HEPES, 1,5 мМ Na ₂ HPO _4, рН 7,01-7,05). Осторожно перемешать с помощью нагнетания воздуха в три раза с помощью 200 мкл пипетки.
10. Выдержите смесь в течение 30 мин при комнатной температуре. Добавить медленно по каплям 200 мкл трансфекции смеси в каждую тарелку и агитировать крест-накрест. Передача пластин при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ в течение 16 часов.
11. На следующий день промыть клетки дважды с 2 мл теплой HEPES (6,7 мМ KCl, 150 мМ NaCl, 10 мМ HEPES, рН 7,3) и добавьте 2 мл DM. Визуализируйте инфеЭффективность фикция под инвертированным флуоресцентным микроскопом при увеличении 20-40X (воздуха) и получить три представительных изображений в состоянии в обоих флуоресцентных и передачи каналов для документации.
12. В зависимости от желаемой настройки эксперимента, следовать дифференцировки в мышечные трубки в течение нескольких дней. Клетки могут быть зафиксированы и впоследствии подвергнуты анализу иммунофлуоресценции или исследований живых изображений клеток может быть выполнена.

Результаты

Трансфекция плазмидной ДНК BAG3-GFP с использованием катионных липидов было связано с гетерогенной экспрессии в клетках HeLa, некоторые клетки , показывающие едва детектируемые уровни белка и других несущих очень высокие уровни BAG3 (фиг.2А). В этих клетках, потеря б?...

Обсуждение

Здесь мы описали метод, позволяющий обеднение-спасательные эксперименты должны быть выполнены, который применим к функционального анализа клеточных биологических процессов, которые особенно чувствительны к избыточной экспрессии белков, влияющих на стехиометрии и динамику белковых...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
C2C12 Mouse Myoblasts	ATCC	CRL-1772
Adenovirus custom design	Welgen	Custom design
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose	Thermo Fisher	11965-092
EDTA	Sigma	E5134
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
Fibronectin	Sigma	F1141
Glass bottom dishes, 35mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada		Klebig C et al. 2009
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
Horse Serum, New Zealand	Thermo Fisher	16050-122
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher	13778-150
Minimal Essential Medium  (MEM) Alpha	Wisent	310-101-CL
Minimal Essential Medium  (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides	Thermo Fisher	12000-022
Minimal Essential Medium  (MEM) Alpha without Phenol Red	Thermo Fisher	41061-029
Na2HPO4	Biobasic	S0404
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
OptiMEM	Thermo Fisher	11058-021
rAVCMV-LifeAct-TagGFP2	IBIDI	60121
siRNA duplexes	Dharmacon	Custom design
Thymidine	Sigma	T9250
Trypsine 2.5%	Thermo Fisher	15090-046