Adenofection: Une méthode pour étudier le rôle des chaperons moléculaires dans Cellular Morphodynamique par Experiments Depletion-sauvetage

Résumé

We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.

Résumé

processus cellulaires tels que la mitose et la différenciation des cellules sont régis par des changements dans la forme des cellules qui reposent en grande partie sur une bonne remodelage des structures du cytosquelette cellulaire. Ceci implique l'assemblage de démontage des structures macromoléculaires d'ordre supérieur à une heure et l'endroit donné, un processus qui est particulièrement sensible aux perturbations causées par la surexpression de protéines. Les méthodes qui peuvent préserver la protéine homéostasie et de maintenir la morphologie proche de la normale cellulaire sont hautement souhaitables pour déterminer la contribution fonctionnelle d'une protéine d'intérêt dans un large éventail de processus cellulaires. Transitoires expériences déplétion de sauvetage basés sur l'interférence ARN sont des approches puissantes pour analyser les fonctions des protéines et des exigences structurelles. Cependant, la réintroduction de la protéine cible avec un écart minimum à son niveau physiologique est un véritable défi. Nous décrivons ici une méthode appelée adenofection qui a été développé pour étudier le rôle des chaperons moléculaires d'unpartenaires d dans le fonctionnement normal des cellules en division et la relation avec l'actine remodelage. Les cellules HeLa ont été épuisées de BAG3 avec duplex siRNA ciblant la région 3'UTR. BAG3 protéines GFP étiqueté ont été réintroduites simultanément dans> 75% des cellules en utilisant des adénovirus recombinants couplés à des réactifs de transfection. Adenofection a permis d'exprimer des protéines BAG3-GFP aux niveaux physiologiques proches dans les cellules HeLa appauvries de BAG3, en l'absence d'une réponse de stress. Aucun effet n'a été observé sur les niveaux de endogènes chaperons de protéines de choc thermique, les principaux régulateurs inductibles par le stress de la protéine homéostasie. En outre, en ajoutant de baculovirus qui contrôlent l'expression des marqueurs fluorescents, au moment de la transfection cellulaire de transduction, on peut disséquer la dynamique des cellules en mitose par microscopie time-lapse analyse avec une perturbation minimale de la progression mitotique normale. Adenofection est également applicable à des cellules difficiles à infecter la souris, et adaptés aux analyses fonctionnelles des myoblastes différentiation en myotubes. Ainsi adenofection fournit un procédé polyvalent pour effectuer des analyses structure-fonction de protéines impliquées dans les processus biologiques sensibles qui reposent sur la dynamique du cytosquelette d'ordre supérieur.

Introduction

l'inactivation fonctionnelle de l'expression génique dans des cellules de mammifères est l'étalon-or pour disséquer les fonctions des protéines. Nouvellement développé des technologies de l' édition du génome basé sur l'utilisation des nucléases spécifiques au site tels que des nucléases à doigt de zinc et en grappes régulièrement espacées répétitions palindromiques courtes (CRISPR) / cas9 permettent maintenant la génération de lignées cellulaires avec délétion du gène ciblé et la mutation ^1,2. Ces nouvelles approches devraient révolutionner la façon dont nous sommes en train d'étudier la fonction des protéines et notre compréhension de la génétique des maladies humaines. Dans certains cas, cependant, à long terme ou knockout gène complet ne sont pas souhaitables et peuvent provoquer des mécanismes de compensation des cellules secondaires. La génération de lignées cellulaires génétiquement modifiées peuvent aussi être limitatifs en traitant des cultures de cellules primaires avec une capacité de prolifération limitée, ou lors de la projection d'un grand nombre de mutations dans divers types cellulaires est recherchée. Ceci est souvent nécessaire pour déterminer la dépendance d'une cellule bprocessus iologiques sur les exigences structurelles d'une protéine. À cette fin, knockdown réversible par interférence ARN qui permet transitoires expériences déplétion sauvetage dans divers milieux cellulaires reste encore une approche simple et puissant pour effectuer des analyses structure-fonction d'une protéine d'intérêt ^3. Cependant, un inconvénient majeur de cette approche est la difficulté à atteindre le silençage efficace et de réintroduire la protéine d'intérêt ou de ses variantes à des niveaux proches physiologiques dans une majorité de la population de cellules. Ceci est crucial pour permettre des études approfondies qui tentent d'établir une corrélation entre les effets fonctionnels observés au niveau des cellules individuelles (phénotype hypomorphic) avec ceux observés dans les essais basés sur la population de cellules, par exemple sur les interactions protéine-protéine.

En utilisant des méthodes de transfection classiques, on peut difficilement obtenir une expression homogène et faible de protéines exogènes dans une grande population de cellules. Transduction des cellules avec des virus recombinantscomme adenovirus permet souvent une expression plus normalisée de protéines exogènes. Or, l'absorption d'adénovirus est limitée par le récepteur CAR, qui est absente dans les cellules non humaines ou seulement faiblement exprimé dans certains types de cellules humaines. En outre, l'entrée cellulaire des adénovirus active des voies qui régulent la forme des cellules et l' adhérence ^4-6 signalisation. Ceci est évidemment pas souhaitable lors de l'étude des mécanismes de régulation de la morphodynamique cellulaires. Nous avons été confrontés à cette problématique lorsque nous avons entrepris des analyses fonctionnelles d'un complexe de chaperon, BAG3-HSPB8, dans la division cellulaire et de la dynamique de l'actine. Un travail de pionnier a décrit un rôle pour ce complexe chaperon en protéines contrôle de la qualité et de l' autophagie au cours du stress ^7,8. La plupart de ces études, cependant, appuyé sur surexpression de la protéine, en supposant que les chaperons sont normalement régulés à la hausse au cours du stress. Cela a laissé ouverte la question de savoir si BAG3, dans un complexe avec HSPB8, peut contribuer à l'exploitation normale des cellules en division exprimant echaperons ese comme de nombreux types de cellules cancéreuses ^9. En particulier, si le complexe chaperon contribue au remodelage des structures à base de l' actine qui contrôlent la progression mitotique était d' un grand intérêt, étant donné les liens émergents entre chaperons hspB et la dynamique du cytosquelette ^10. Pour résoudre ce problème, nous cherchions à développer une méthode efficace pour les expériences déplétion de sauvetage qui ne serait pas interférer avec la progression mitotique ou la morphologie cellulaire, et qui préserverait la protéine homéostasie pour éviter une perturbation secondaire de la dynamique des complexes macromoléculaires de régulation des changements de cellules forme . Ainsi, idéalement, l'épuisement-add-back du gène d'intérêt doit être réalisée simultanément.

L'utilisation de complexes d'adénovirus avec un polymère cationique ou de lipides a été décrite pour favoriser le transfert de gènes in vitro et in vivo ^11,12. Par exemple, le phosphate de calcium (ICPA) semble former un précipité avecadénovirus qui améliorent la liaison du virus d'entrée par l' intermédiaire d' une voie de CAR-indépendante ^13. En effet, nous avons constaté que la combinaison de transduction et de transfection cellulaire à base d'adénovirus avec des composés cationiques, pourrait améliorer l'efficacité des expériences d'appauvrissement de sauvetage. Cela nous a permis d'abaisser les quantités de virus par 3 à 20 fois, en fonction de la lignée cellulaire et le gène d'intérêt, et de bénéficier d'une fenêtre plus large afin d'ajuster l'expression de protéines exogènes à des niveaux proches endogènes dans la majorité d'une population de cellules d'intérêt avec un impact minimal sur la morphologie cellulaire. Dans ces conditions, on pourrait aussi obtenir une grande knockdown de l'efficacité de l'expression de protéine endogène (> 75%). Nous décrivons par la présente l'étape de procédé par étape et fournir la preuve que la protéine homéostasie est pas significativement perturbée évaluée par les niveaux inchangés de chaperons induites par le stress de la famille des protéines de choc thermique, ce qui rend la méthode appropriée pour les analyses fonctionnelles de la ro physiologiquele des chaperons moléculaires par time-lapse vidéo microscopie. Le protocole se prête à une procédure de synchronisation de cellule et à l'utilisation de baculovirus disponibles dans le commerce pour la co-expression de faibles taux de marqueurs fluorescents, avec un minimum d'interférence avec la dynamique à base d'actine et de la broche normale lors de la progression mitotique. Nous montrons en outre la versatilité de la méthode, qui est applicable à «difficile à transduction" cellules C2C12 de souris, sans impact significatif sur la différenciation des myoblastes en myotubes in vitro.

Protocole

1. Préparation des moyennes et Solutions (tout filtré stérile)

1. C2C12 cellules musculaires de souris (études de différenciation)
   1. Préparer 500 ml de milieu de croissance pour le maintien C2C12 de culture cellulaire DMEM élevé de glucose supplémenté avec 10% de FBS et 2 mM de L-Glutamine.
   2. Préparer 100 ml Différenciation moyenne (DM) pour la différenciation des C2C12: DMEM Haute glucose additionné de 2% de sérum de cheval.
2. Les cellules HeLa (études dans les cellules en mitose)
   1. Préparer 500 ml d' aMEM pour HeLa DP-H2B entretien de la culture cellulaire et les expériences: aMEM complété avec 10% de FBS et 2 mM de L-Glutamine (aMEM ^10%).
   2. Préparer 500 ml d' aMEM-moins (sans désoxyribonucléosides / ribonucléosides) pour la synchronisation des cellules HeLa DP-H2B: aMEM-moins supplémenté avec 10% de FBS et 2 mM de L-Glutamine (aMEM-moins ^10%).
   3. Préparer 20 ml aMEM sans Phénol Red pour HeLa-RFP-H2B live acquisition cellulaire: aMEM sans rouge de phénol supplémenté avec 10% de FBS et 2 mM de L-Glutamine.
   4. Préparer thymidine 100 mM: dissoudre 24,2 mg dans 1 ml H ₂ O à 37 ° C par tourbillonnement. Filtre stériliser et conserver à 4 ° C.
3. Des solutions communes
   1. Préparer trypsine à 0,05% / EDTA 0,05% de trypsine, 0,625 mM d'EDTA dans 1 x tampon phosphate salin (PBS). Filtre stériliser et aliquotes stocker à -20 ° C. Une fois décongelé, gardez aliquote à 4 ° C.
   2. Préparer HBS2x: NaCl 280 mM, HEPES 50 mM, 1,5 mM de Na ₂ HPO _4. Ajuster le pH exactement entre 7,01-7,05 avec NaOH 10. Filtre stérile et conserver à 4 ° C.

2. Revêtement de plaques de culture cellulaire avec la fibronectine et Placage des cellules HeLa-RFP-H2B

NOTE: Avant l'expérience, chaque manipulateur doit mettre en place les conditions optimales de placage de cellules pour obtenir une densité adéquate de cellules puisque les variations peuvent OCcur entre chaque manipulateur et chaque lignée cellulaire différente.

1. La veille de l'expérience, développez les cellules HeLa-RFP-H2B pour vous assurer qu'ils sont dans la phase de croissance exponentielle sur le jour du dépôt. Faire 2 successifs 1/3 dilutions en plaques de 10 cm à partir d'un confluentes 1x10 cm plaque de 80%.
   NOTE: Prévoyez le nombre de plaques pour l'expérience. Calculer chaque condition que les doublons, l'un pour l'imagerie des cellules vivantes à court terme et un pour les protéines des extraits afin de déterminer l'efficacité de l'effet de choc et d'expression de la protéine exogène par analyse Western blot. Prévoyez une plaque supplémentaire pour déterminer le nombre de cellules avant la transduction du virus.
2. Avant la cellule de placage, plats à fond de verre de revêtement avec 10 pg / ml de fibronectine. Ajouter 1 ml d'une dilution 1: 100 de 1 mg / ml de fibronectine (dilué dans du PBS stérile 1x) par boîte de 35 mm pour bien couvrir toute la surface et laisser incuber pendant 1 heure à 37 ° C, 5% de CO _2.
3. Au cours de l'incubation, aMEM préchauffer complété wie 10% de FBS (aMEM ^10%) et 0,05% de trypsine / EDTA à 37 ° C.
4. Après 45 minutes d'incubation, commencer à préparer la solution de cellules. Dans la hotte stérile, aspirer le moyen d'une plaque de 10 cm, rincer délicatement deux fois avec 1,5 ml de 0,05% de trypsine / EDTA, et de laisser 0,5 ml de trypsine / EDTA à la dernière aspiration.
5. Incuber les cellules pendant 2 à 3 min à 37 ° C, 5% de CO _2. En tapotant doucement la plaque et l'observation au microscope, vérifier que toutes les cellules ont été détachées. Ajouter 10 ml d'aMEM ^10% et la pipette doucement plusieurs fois pour séparer les cellules. Compter un échantillon de 10 pi de la suspension cellulaire à l'aide d'un hémocytomètre.
6. solution de fibronectine Aspirer des plats de fond en verre. Ne pas laisser la fibronectine sécher avant le placage cellulaire.
7. Plate 1,5x10 ⁵ cellules par boîte de 35 mm dans 2 ml de ^10% et incuber à 37 ° C, 5% de CO _2. Vérifiez après 30-45 min sous le microscope que les cellules sont bien sepanominal, étant donné qu'ils ont tendance à s'accumuler au centre de la plaque.
8. Si nécessaire, agiter les plaques doucement contre-sages pour redistribuer les cellules. Plaque une plaque supplémentaire pour le nombre de conditions afin de compter le nombre de cellules avant la transduction du virus de 35 mm.
9. Cultiver des cellules jusqu'au lendemain pour obtenir une densité cellulaire d'au moins 50%. Une densité cellulaire inférieure à 50% se traduit par une diminution significative de l'efficacité de transduction virale, une augmentation des variations de l'expression de protéine par cellule, et a augmenté la toxicité cellulaire.
   REMARQUE: Le revêtement des boîtes de verre avec de la fibronectine améliore la croissance cellulaire et de la morphologie et favorise une bonne progression des cellules à travers la mitose. Elle peut généralement être remplacé par de la gélatine disponibles dans le commerce qui est moins cher.

3. Adenovirus transduction et Protein Endogène Knockdown par siRNA Transfection dans les cellules HeLa-RFP-H2B Utilisation de CaPi Précipités

Attention! Le travailtion avec des virus nécessite des précautions particulières et une bonne disposition de tout le matériel qui a été en contact avec le virus.

Attention! Dans nos mains, CaPi précipités ont souvent des effets indésirables plus, par exemple sur les processus biologiques impliquant le trafic vésiculaire (par exemple, l' autophagie). En conséquence, il est recommandé d'utiliser un réactif de transfection lipide cationique (voir ci-dessous) et d'attendre au moins 48 heures avant les analyses.

REMARQUE: Un adenovirus de commande portant un gène non apparenté (c. -à- LacZ) ou pas de gène est utilisé pour atteindre une MOI minimale dans tous Adenofections (10 à 20 pfu / cellule de) en utilisant la quantité la plus faible de l' adénovirus recombinant portant le gène d'intérêt.

REMARQUE: cette procédure a été montré pour aider l'expression de normalisation par cellule dans une grande population de cellules.

1. Un jour après l'étalement cellulaire, compter le nombre de cellules de la boîte plaquée supplémentaire. Aspirer le moyen etrincer une fois avec 1 ml de 0,05% de trypsine / EDTA. Ajouter à nouveau 1 ml de trypsine à 0,05% / EDTA et on incube à 37 ° C, 5% de CO ₂ jusqu'à ce que toutes les cellules sont détachées. Séparer les cellules puits à l'aide d'une pipette 1ml et compter le nombre de cellules par ml en utilisant un hémocytomètre.
2. Déterminer la quantité de virus nécessaire pour transduire des cellules à une multiplicité d'infection (MOI) de 2 unités formant des plaques (PFU) de la protéine d'intérêt (POI) par cellule et 18 UFP par cellule d'un vecteur vide (par exemple, LacZ) pour un total de 20 UFP par cellule. Dans le même temps transduire 4 UFP de chaque baculoviral (Actine et αTubulin, la GFP et RFP marqués respectivement). Transduire des cellules en utilisant le protocole suivant adenofection. Les virus ont été utilisés comme décrit dans Fuchs et al. ¹⁴
3. Préparer dans une hotte stérile , un tube en plastique de 1,5 ml pour chaque condition et ajouter 400 ul de chaud-aMEM moins ^10%.
4. Décongeler une aliquote des virus lentement sur la glace et, si nécessaire, diluer til stock de virus afin de pipeter un volume supérieur à 1 pi pour minimiser les erreurs de pipetage.
5. Ajouter la quantité de virus calculée par condition à chaque tube en plastique de 1,5 ml contenant 400 ul aMEM-moins ^10% et mélanger doucement par pipetage. Placez le stock de virus immédiatement revenir à -80 ° C pour maintenir son activité.
6. Aspirer le milieu des cellules et la pipette doucement le mélange de virus goutte à goutte. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO ₂ et agiter les plaques soigneusement sous la hotte stérile chaque 15 min pendant 1 heure pour bien couvrir les cellules avec le virus. En utilisant une petite quantité de fluide facilite le contact du virus avec les cellules.
7. Après incubation, la pipette doucement 1,6 ml d' aMEM-moins ^10% à chaque plaque pour obtenir un volume total de 2 ml, lancer la synchronisation des cellules par l' addition mM thymidine 2 et on incube les cellules pendant encore 2 heures à 37 ° C, 5% de CO ₂ .
8. Pendant ce temps, préparer les siARN followi transfection mixng la méthode de transfection CaPi (voir Figure 1). Si aucun siRNA est nécessaire, remplacer la quantité de siRNA par l' eau stérile pour effectuer une transfection vide.
9. Calculer 200 ul mélange pour chaque état, résultant dans 400 ul par double. L'exemple suivant est donné pour une concentration de siRNA finale de 50 nM et doit être adaptée à chaque protéine d'intérêt. Dans un tube en plastique de 1,5 ml, pipette 50 pi 1 M CaCl ₂ et 11 pi 20 uM siRNA dans 139 ul H ₂ O stérile et mélanger par tourbillonnement. Après un tour rapide, ajouter prudemment goutte à goutte 200 ul HBS2x (NaCl 280 mM, HEPES 50 mM, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, pH 7,01-7,05).
   NOTE: Le plus petites gouttes plus petites sont les précipités, résultant en une meilleure efficacité de la transfection. Mélanger doucement trois fois par injection d'air à l'aide d'une pipette ul-200.
10. Laisser incuber le mélange pendant 30 min à température ambiante. Ajouter lentement goutte à goutte 200 pi de mélange de transfection à chaque plaque etagiter en croix. Transférer les plaques à 37 ° C, 5% de _CO2 pendant 16 heures.
11. Le lendemain, rincer les cellules deux fois avec 2 ml de HEPES chaudes (KCl 6,7, NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,3) et ajouter 2 ml aMEM-moins ^10%. Ne pas procéder à plus de quatre plaques de cellule à la fois, car les variations de température affectent la durée du cycle cellulaire.
12. Visualisez l'efficacité de l'infection sous un microscope à fluorescence inversée à un grossissement de 20-40x (air) et l'acquisition de trois images représentatives par condition dans les deux canaux fluorescents et de transmission pour la documentation. Sept heures plus tard, ajouter 2 mM thymidine et on incube pendant encore 16 heures à 37 ° C, 5% de CO _2.
13. Le lendemain, 48 heures après transfection de siRNA et infection par le virus, laver les cellules deux fois avec 2 ml chaude saline de tampon phosphate (PBS) et relâcher pendant 7 heures dans 2 ml de ^10% p / o Phénol Red pour l' imagerie des cellules vivantes ou avec des Phénol rouge pour l'extraction des protéines.
14. La récolte des cellules pour chaque condition 48 heures après la transfection pour la préparation d'extraits de protéines et analyse par Western Blot afin de déterminer l'efficacité de l' effet de choc et l'expression de la protéine endogène ^15.
    REMARQUE: Utilisez des anticorps contre la protéine d'intérêt, ainsi que des anticorps appropriés servant de contrôles de chargement. L'efficacité de knock - down doit être déterminée en chargeant des quantités décroissantes de lysats de cellules de commande (transfectées avec le siRNA contrôle), afin de fournir une courbe de titrage ( par exemple, 1, ½, ¼ ⅛).

4. Adenovirus transduction et Protein Endogène Knockdown par siRNA Transfection dans des cellules HeLa Utilisation d'un lipide cationique réactif de transfection

REMARQUE: Nous présentons ici un protocole qui a été adapté pour des expériences qui ne nécessitent pas de synchronisation des cellules et / ou lors de transfection de siRNA ne peut pas être effectuée par le procédé CaPi, par exemple pour éviter des effets toxiques indésirables dans certaines cellules Lines. Ce protocole comprend également une étape de réensemencement des cellules après adenofection afin de travailler à une densité cellulaire appropriée. Nous avons seulement testé le réactif de transfection lipide cationique.

Attention! Travailler avec des virus nécessite des précautions particulières et une bonne disposition de tout le matériel qui a été en contact avec le virus.

1. Plaque 1,75 x 10 ⁵ cellules par boîte de 35 mm dans 2,5 ml d' aMEM ^10% et on incube à 37 ° C, 5% de CO _2. Plaque une plaque supplémentaire pour le nombre de conditions afin de compter le nombre de cellules avant la transduction du virus de 35 mm.
2. Cultiver des cellules jusqu'au lendemain pour obtenir une densité cellulaire d'au moins 50%. Une densité de cellules de moins de 50% se traduit par une diminution significative de l'efficacité de transduction virale, une augmentation des variations de l'expression de protéine par cellule, et a augmenté la toxicité cellulaire.
3. Un jour après l'étalement cellulaire, compter le nombre de cellules de la boîte plaquée supplémentaire. Aspirerle moyen et rincer une fois avec 1 ml de 0,05% de trypsine / EDTA. Ajouter à nouveau 1 ml de trypsine à 0,05% / EDTA et on incube à 37 ° C, 5% de CO ₂ jusqu'à ce que toutes les cellules sont détachées. cellules séparées puits en utilisant un pipette de 1 ml et compter le nombre de cellules par ml.
4. Déterminer la quantité de virus nécessaire pour transduire une multiplicité d'infection (MOI) de 20-40 unités formant des plaques (PFU) de la protéine d'intérêt (POI) par cellule et 0-20 PFU par cellule d'un vecteur vide (par exemple, LacZ) d'avoir un total de 40 PFU par cellule.
5. Préparer dans une hotte stérile , un tube en plastique de 1,5 ml pour chaque condition et ajouter 400 ul de aMEM chaude à ^10%.
6. Décongeler une aliquote des virus lentement sur la glace et, si nécessaire, diluer le stock de virus afin de pipeter un volume supérieur à 1 pi pour minimiser les erreurs de pipetage.
7. Ajouter la quantité de virus calculée par condition à chaque tube en plastique de 1,5 ml contenant 400 ul de ^10% et mélanger doucement par pipetage. La place ee stock de virus immédiatement revenir à -80 ° C pour maintenir son activité.
8. Aspirer le milieu des cellules et la pipette doucement le mélange de virus goutte à goutte. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO ₂ et agiter soigneusement les plaques sous la hotte stérile chaque 15 min pendant 1 heure pour bien couvrir les cellules avec la dilution de virus. En utilisant une petite quantité de fluide facilite le contact du virus avec les cellules.
9. Pendant ce temps, préparer le mélange de transfection de siRNA selon la méthode de transfection. Si aucun siRNA est nécessaire, remplacer la quantité de siRNA par milieu sans sérum pour effectuer une transfection vide.
   1. L'exemple suivant est donné pour une concentration de siRNA finale de 50 nM et doit être adaptée à chaque protéine d'intérêt. Pour chaque adenofection, préparer un 1,5 ml tube en plastique contenant 416 nM siRNA dans 150 ul de milieu sans sérum (par exemple, 6,25 pi 20 uM siRNA + 144 ul de milieu sans sérum) et un tube de 1,5 ml en plastique containing 6,25 ul cationique réactif lipidique de transfection + 144 ul de milieu sans sérum.
   2. Mélanger le contenu de chaque tube en matière plastique par pipetage de haut en bas plusieurs fois avec une pipette de 200 pi. Combiner le contenu des deux tubes et mélanger en pipetant plusieurs fois avec une pipette de 200 pi. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
10. Après incubation avec le virus, la pipette doucement 1,8 ml aMEM ^10% à chaque plaque pour obtenir un volume total de 2,2 ml et ajouter immédiatement lentement goutte à goutte le mélange de transfection de siRNA à chaque plaque et agiter en croix. Transférer les plaques à 37 ° C, 5% de _CO2 pendant 24 heures.
11. Le lendemain, re-plaque les cellules de chaque plaque de 35 mm en quatre nouvelles plaques de 35 mm dans 2,5 ml aMEM ^10% chacun et incuber pendant une 24 heures supplémentaires à 37 ° C, 5% de CO _2.
12. Le lendemain, 48 heures après transfection de siRNA et infection par le virus, les cellules de récolte d'une plaque pour chaque condition pour la préparation dedes extraits de protéines et analyse par Western Blot afin de déterminer l'efficacité de l' effet de choc et l'expression de la protéine endogène ^15.
    NOTE: Avec les plaques restantes, procéder à la fixation des cellules, en utilisant le protocole de choix et soumettre les échantillons à l' analyse d'immunofluorescence avec les anticorps d'intérêt ^14.

5. Imagerie de cellules vivantes cellules mitotiques et l'analyse des données

1. Effectuer des expériences d'imagerie cellulaire en direct à court terme sur les cellules mitotiques avec un microscope inversé équipé d'un / chambre de thermo-régulée humidifié / 5% de CO _2.
   NOTE: Dans cette étude, un microscope confocal à disque tournant (40X, 0,75 NA) a été utilisé, équipé d'un EMCCD refroidi caméra à couplage de charge à -50 ° C.
2. Avant l'acquisition, vérifiez que la chambre a atteint la température appropriée de 37 ° C.
   NOTE: Cela peut prendre plusieurs heures selon le système microscopique.
3. Placez les boîtes de culture dans le micrchambre de oscope 1 h avant l'acquisition pour permettre une bonne équilibre du milieu et éviter la dérive due attention aux changements de température. Surveiller l'état mitotique des cellules. À ce stade, 10-15% des cellules devrait être dans les premiers stades de la mitose (prophase-prométaphase).
4. Pendant le temps d'équilibration, configurer les paramètres d'acquisition tel que déterminé dans des expériences antérieures. En général, un temps d'exposition pour les deux canaux (488 et 594) de 0,2 à 3 secondes avec une intensité de laser de 100% et une sensibilité de 121-130 sont des paramètres appropriés dans les mains.
   NOTE: Les tests d'abord devraient être faits pour déterminer le minimum l'intensité du laser et l'acquisition de temps / intervalle qui aboutissent à une résolution appropriée avec photoblanchiment minimum qui provoque des dommages cellulaires et perturbe la progression mitotique.
5. Choisissez plusieurs champs par condition d'obtenir un nombre important de cellules pour analyser sans dépasser l'intervalle d'acquisition. En utilisant un système confocal de disque filer, une configuration typique sera enClude quatre conditions différentes, 7 champs par plaque et 2 canaux de couleur (488 et 594) avec un intervalle de 1,5-2 min sur une période de 75 min-.
6. Choisissez des cellules qui sont à l'entrée en mitose, re-régler la mise au point une fois que tous les champs ont été choisis et commencer l'acquisition aussi vite que possible.
7. Surveiller la stabilité du système pendant au moins trois points de temps et re-définir le focus si nécessaire.
8. Après la première image de 75 min cellules vivantes à court terme, de nouveaux champs de cellules en mitose peuvent être choisies pour acquérir une deuxième série de films pour augmenter le nombre de cellules en cours d'analyse.
9. Déterminer des critères bien définis pour analyser les phénotypes mitose des cellules, qui dépendront des marqueurs fluorescents utilisés. Les défauts de la mitose peuvent inclure le temps passé dans la mitose prolongée (de ventilation nucléaire jusqu'à anaphase), le chromosome désalignement, broche à bascule, et le cortex bourgeonnement ^14.

6. LifeAct-TagGFP2 Adenovirus transduction dans Differentiating C2C12 myoblastes souris

NOTE: Le protocole adenofection est également applicable à des myoblastes C2C12 de souris difficiles à infecter subissant une différenciation.

1. Planche 2 x 10 ⁵ cellules C2C12 dans des boîtes de culture de 35 mm dans du milieu de croissance en matière plastique ou sur un substrat de choix.
   NOTE: La différenciation cellulaire est améliorée sur les plats gelatine- ou matrigel revêtu. Prévoyez une plaque supplémentaire pour déterminer le nombre de cellules avant la transduction du virus.
2. Le jour suivant, les cellules devrait avoir atteint 80% de confluence. Induire la différenciation des myoblastes en lavant les cellules deux fois avec du PBS chaud et en ajoutant 2 ml de milieu de différenciation (DM).
3. Le lendemain, jour appelée 1 (D1) de la différenciation, transduire des myocytes avec un adenovirus LifeAct-TagGFP2 pour visualiser le cytosquelette d'actine dans les cellules vivantes. Comptez le nombre de cellules de la plaque supplémentaire telle que décrite au point 3.2. Calculer 5 PFU / cellule de LifeAct-TagGFP2 adénovirus et 45 PFU / cellule AdLacZ suite à l'examenple décrit dans le tableau 1. La quantité totale des virus est de 50 PFU / cellule. Les virus ont été utilisés comme décrit ¹⁴
4. Préparer dans une hotte stérile un tube en plastique de 1,5 ml pour chaque état et ajouter 400 pi de DM au chaud.
5. Décongeler une aliquote des virus lentement sur la glace et, si nécessaire, diluer le stock de virus afin de pipeter un volume supérieur à 1 pi pour minimiser les erreurs de pipetage.
6. Ajouter la quantité appropriée de particules virales par condition à chaque tube en plastique de 1,5 ml contenant 400 ul DM et mélanger doucement par pipetage. Placez le stock de virus immédiatement revenir à -80 ° C pour maintenir son activité.
7. Aspirer le milieu de la vaisselle et de la pipette doucement le mélange de virus goutte à goutte. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO ₂ et agiter les plaques soigneusement sous la hotte stérile chaque 15 min pour un total de 1 heure pour bien couvrir les cellules avec le virus.
8. Après incubation, la pipette doucement 1,6 ml DM sur chaque plaque et poursuivre le incubation pendant encore 2 heures à 37 ° C, 5% de CO _2.
9. Pendant ce temps, préparer un mélange de transfection vide suivant la méthode de transfection CaPi. Calculez 200 mix pl pour chaque condition. Utilisez l'exemple suivant pour un volume total de 400 pi mélange.
   1. Dans un tube en plastique de 1,5 ml, pipette 50 pi 1 M CaCl ₂ dans 150 ul de H ₂ O stérile et mélanger par tourbillonnement. Après un tour rapide, ajouter prudemment goutte à goutte 200 ul HBS2x (NaCl 280 mM, HEPES 50 mM, 1,5 mM Na ₂ HPO _4, pH 7,01-7,05). Mélanger doucement par injection d'air à trois reprises à l'aide d'une pipette de 200 pi.
10. Laisser incuber le mélange pendant 30 min à température ambiante. Ajouter lentement goutte à goutte 200 ul du mélange de transfection à chaque plaque et agiter en croix. Transférer les plaques à 37 ° C, 5% de _CO2 pendant 16 heures.
11. Le lendemain, rincez les cellules deux fois avec 2 ml de HEPES chaudes (KCl 6,7, NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,3) et ajouter 2 ml DM. Visualisez la infection efficacité sous un microscope à fluorescence inversé à un grossissement de 20-40X (air) et l'acquisition de trois images représentatives par condition dans les deux canaux fluorescents et de transmission pour la documentation.
12. Selon la configuration de l'expérience souhaitée, suivez la différenciation en myotubes pendant plusieurs jours. Les cellules peuvent être fixées et ensuite soumis à une analyse par immunofluorescence ou des études d'imagerie des cellules peut être effectuée.

Résultats

La transfection de l' ADN du plasmide GFP en utilisant BAG3-lipides cationiques a été associée à une expression hétérogène dans des cellules HeLa, des cellules présentant des niveaux à peine détectables de la protéine et d' autres portant des niveaux de BAG3 très élevées (figure 2A). Dans ces cellules, la perte de protéine homéostasie a été mis en évidence par l' accumulation de GFP-BAG3 en agrégats périnucléaires (figure 2A,

Discussion

Ici, nous avons décrit un procédé permettant des expériences d'appauvrissement de sauvetage à effectuer, qui est applicable à l'analyse fonctionnelle des processus biologiques cellulaires qui sont particulièrement sensibles à la surexpression de protéines qui affectent la stoechiométrie et la dynamique des complexes protéiques et des structures macromoléculaires. la division cellulaire mitotique est un exemple extrême de morphodynamique cellulaires finement réglé qui implique les changements les p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C2C12 Mouse Myoblasts	ATCC	CRL-1772
Adenovirus custom design	Welgen	Custom design
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose	Thermo Fisher	11965-092
EDTA	Sigma	E5134
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
Fibronectin	Sigma	F1141
Glass bottom dishes, 35mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada		Klebig C et al. 2009
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
Horse Serum, New Zealand	Thermo Fisher	16050-122
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher	13778-150
Minimal Essential Medium  (MEM) Alpha	Wisent	310-101-CL
Minimal Essential Medium  (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides	Thermo Fisher	12000-022
Minimal Essential Medium  (MEM) Alpha without Phenol Red	Thermo Fisher	41061-029
Na2HPO4	Biobasic	S0404
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
OptiMEM	Thermo Fisher	11058-021
rAVCMV-LifeAct-TagGFP2	IBIDI	60121
siRNA duplexes	Dharmacon	Custom design
Thymidine	Sigma	T9250
Trypsine 2.5%	Thermo Fisher	15090-046