Adenofection: Un metodo per studiare il ruolo di chaperoni molecolari in Cellular Morfodinamica da esperimenti Depletion-Rescue

Riepilogo

We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.

Abstract

processi cellulari come la mitosi e la differenziazione cellulare sono regolate da cambiamenti nella forma delle cellule che in gran parte si basano su una corretta rimodellamento delle strutture del citoscheletro delle cellule. Questo prevede il montaggio-smontaggio di strutture macromolecolari ordine superiore in un dato momento e luogo, un processo che è particolarmente sensibile alle perturbazioni provocate da sovraespressione di proteine. Metodi che preservare dell'omeostasi proteica e mantenere la morfologia vicino a normale cellulare sono altamente desiderabili per determinare il contributo funzionale di una proteina di interesse in una vasta gamma di processi cellulari. Transitori esperimenti esaurimento-soccorso basate su RNA interference sono approcci potenti per analizzare le funzioni delle proteine ​​e dei requisiti strutturali. Tuttavia, reintroduzione della proteina bersaglio con deviazione minima dal suo livello fisiologico è una vera sfida. Qui si descrive un metodo denominato adenofection che è stato sviluppato per studiare il ruolo di chaperon molecolari und partner nel normale funzionamento di cellule in divisione e il rapporto con l'actina rimodellamento. cellule HeLa sono state esaurite di BAG3 con duplex siRNA mira la regione 3'UTR. proteine ​​BAG3 GFP-tagged sono stati reintrodotti simultaneamente in> 75% delle cellule utilizzando adenovirus ricombinanti accoppiati ai reagenti di trasfezione. Adenofection ha permesso di esprimere proteine ​​BAG3-GFP a livelli fisiologici vicino in cellule HeLa impoverito di BAG3, in assenza di una risposta allo stress. Nessun effetto è stato osservato sui livelli di endogeni accompagnatori heat shock protein, i principali regolatori di stress-inducibile di omeostasi delle proteine. Inoltre, aggiungendo baculoviruses guida l'espressione di marcatori fluorescenti al momento della cella di trasduzione-trasfezione, potremmo sezionare dinamiche cellulari mitotiche da time-lapse microscopica analisi con perturbazione minima di progressione mitotica normale. Adenofection è applicabile anche alle cellule di topo difficili da infettare, e adatto per analisi funzionali di mioblasti differenziazione in miotubi. Così adenofection fornisce un metodo versatile per eseguire struttura-funzione analizza delle proteine ​​coinvolte nei processi biologici sensibili che si basano sulla dinamica del citoscheletro di ordine superiore.

Introduzione

inattivazione funzionale di espressione genica in cellule di mammifero è il gold standard per sezionare le funzioni delle proteine. Tecnologie di editing del genoma basata sull'uso di nucleasi specifiche del sito, come nucleasi zinc-finger di nuova concezione e cluster regolarmente intervallati brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) / CAS9 ora permettono la generazione di linee cellulari con mirata delezione del gene e la mutazione ^1,2. Questi nuovi approcci dovrebbero rivoluzionare il modo in cui stiamo studiando la funzione delle proteine ​​e la nostra comprensione della genetica delle malattie umane. In alcuni casi, tuttavia, a lungo termine o completa knockout gene non è auspicabile e possono provocare meccanismi di compensazione cellule secondarie. La generazione di linee cellulari geneticamente modificati può anche essere limitante quando si tratta di colture cellulari primarie con capacità proliferativa limitata, o quando è richiesta proiezione di un grande insieme di mutazioni in vari tipi cellulari. Questo è spesso necessario per determinare la dipendenza di una cella bprocesso iological sui requisiti strutturali di una proteina. A tal fine, atterramento reversibile da RNA interference che consente esperimenti di deplezione-salvataggio transitori in vari ambiti di cellulari rimane ancora un approccio semplice e potente per eseguire le analisi struttura-funzione di una proteina di interesse ^3. Tuttavia, un grave inconveniente di questo approccio è la difficoltà di raggiungere silenziamento efficiente e reintrodurre la proteina di interesse o sue varianti a livelli fisiologici vicino nella maggior parte della popolazione cellulare. Ciò è essenziale per consentire studi approfonditi che tentano di correlare effetti funzionali osservati a livello delle singole cellule (fenotipo hypomorphic) con quelli osservati in saggi basati sulla popolazione di cellule, per esempio sulle interazioni proteina-proteina.

Utilizzando metodi di trasfezione classici, difficilmente si può ottenere espressione omogenea e bassa di proteine ​​esogene in una vasta popolazione di cellule. Trasduzione di cellule con virus ricombinanticome adenovirus spesso permette un'espressione più normalizzata di proteine ​​esogene. Tuttavia, l'assorbimento adenovirus è limitata dal recettore CAR, che è assente in cellule non-umane o solo debolmente espressa in alcuni tipi di cellule umane. Inoltre, l'entrata cellulare di adenovirus attiva percorsi che regolano la forma delle cellule e l'adesione ^4-6 segnalazione. Questo ovviamente non è desiderabile quando si studiano meccanismi regolatori della morfodinamica cellulari. Siamo stati di fronte a questa problematica quando abbiamo intrapreso analisi funzionali di un complesso chaperone, BAG3-HSPB8, nella divisione cellulare e le dinamiche di actina. Lavoro pionieristico aveva descritto un ruolo per questo complesso di proteine ​​chaperone controllo di qualità e l'autofagia durante lo stress ^7,8. La maggior parte di questi studi, tuttavia, invocata iperespressione della proteina, partendo dal presupposto che le accompagnatori sono normalmente sovraregolati durante lo stress. Questo ha lasciato aperta la questione se BAG3, in complesso con HSPB8, può contribuire al normale funzionamento delle cellule in divisione che esprimono °accompagnatori ESE come molti tipi di cellule di cancro ^9. In particolare, se il complesso chaperone contribuisce al rimodellamento delle strutture di actina-based che controllano la progressione mitotico è stato di grande interesse, date le connessioni emergenti tra accompagnatori HSPB e le dinamiche del citoscheletro ^10. Per risolvere questo problema, abbiamo cercato di sviluppare un metodo efficiente per gli esperimenti esaurimento-soccorso che non interferire con la progressione mitotico o morfologia cellulare, e che sarebbe conservare l'omeostasi delle proteine ​​al fine di evitare perturbazioni secondaria della dinamica dei complessi macromolecolari che regola i cambiamenti-forma delle cellule . Così idealmente, l'esaurimento-add-back del gene di interesse deve essere eseguita simultaneamente.

L'uso di complessi di adenovirus con un polimero cationico o lipidi è stata descritta per promuovere il trasferimento genico in vitro e in vivo ^11,12. Per esempio, fosfato di calcio (CAPI) sembra formare un precipitato conadenovirus che migliorano il virus vincolante-ingresso attraverso un percorso CAR-indipendenti ^13. Infatti, abbiamo scoperto che la combinazione di adenovirus-based trasduzione cellulare e trasfezione con composti cationici potrebbe migliorare l'efficienza degli esperimenti svuotamento soccorso. Ciò ha permesso di abbassare la quantità di virus da 3 a 20 volte, a seconda della linea cellulare e il gene di interesse, e beneficiare di una finestra più ampia al fine di regolare l'espressione di proteine ​​esogene a livelli vicini endogeni nella maggioranza di una popolazione di cellule con un impatto minimo sulla morfologia cellulare. In tali condizioni, si potrebbe anche ottenere un'elevata efficienza knockdown dell'espressione della proteina endogena (> 75%). Con la presente descriviamo il passaggio Metodo passo e fornire la prova che l'omeostasi delle proteine ​​non è significativamente perturbato come valutato dai livelli invariati di accompagnatori di stress-indotta della famiglia heat shock protein, rendendo il metodo adatto per le analisi funzionali della ro fisiologicoLe di chaperon molecolari per il video microscopia time-lapse. Il protocollo è suscettibile di procedure di sincronizzazione delle cellule e per l'utilizzo del baculoviruses disponibili in commercio per la co-espressione di bassi livelli di marcatori fluorescenti, con la minima interferenza con le normali dinamiche di actina-based e mandrino durante la progressione mitotico. Mostriamo ulteriormente la versatilità del metodo, applicabile a "duro" trasdurre cellule C2C12 mouse, senza alcun impatto significativo sulla differenziazione dei mioblasti in miotubi in vitro.

Protocollo

1. Preparazione del mezzo e soluzioni (tutto filtrata sterile)

1. Le cellule muscolari del mouse C2C12 (studi di differenziazione)
   1. Preparare 500 ml di crescita medio per C2C12 manutenzione coltura cellulare: DMEM alto glucosio supplementato con 10% FBS e 2 mm L-glutammina.
   2. Preparare 100 ml di differenziazione Media (DM) per la differenziazione C2C12: DMEM alto glucosio integrato con il 2% siero di cavallo.
2. Cellule HeLa (studi in cellule in mitosi)
   1. Preparare 500 ml αMEM per HeLa RFP-H2B manutenzione coltura cellulare ed esperimenti: αMEM supplementato con 10% FBS e 2 mM L-glutammina (αMEM ^10%).
   2. Preparare 500 ml αMEM-minus (senza deoxyribonucleosides / ribonucleosides) per HeLa sincronizzazione cellule RFP-H2B: αMEM-minus supplementato con 10% FBS e 2 mM L-glutammina (αMEM-meno ^10%).
   3. Preparare 20 ml αMEM senza rosso fenolo per HeLa-RFP-H2B lacquisizione delle cellule ive: αMEM senza rosso fenolo integrato con il 10% FBS e 2 mM L-glutammina.
   4. Preparare 100 mM timidina: sciogliere 24,2 mg in 1 ml di H ₂ O a 37 ° C con il vortex. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
3. soluzioni comuni
   1. Preparare 0,05% tripsina / EDTA: 0.05% tripsina, 0,625 mM EDTA in 1x tampone fosfato (PBS). Filtro sterilizzare e aliquote conservare a -20 ° C. Una volta scongelato, tenere aliquota a 4 ° C.
   2. Preparare HBS2x: 280 mm NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mm Na ₂ HPO _4. Regolare il pH esattamente tra 7,01-7,05 con 10 N NaOH. Filtro sterile e conservare a 4 ° C.

2. Rivestimento di piastre di coltura cellulare con fibronectina e placcatura di cellule HeLa-RFP-H2B

NOTA: Prima l'esperimento, ogni manipolatore dovrebbe creare le condizioni ottimali di placcatura cellulare per ottenere una corretta densità delle cellule in quanto variazioni possono OCcur tra ogni manipolatore ed ogni linea cellulare diverso.

1. Il giorno prima dell'esperimento, espandere le cellule HeLa-RFP-H2B per assicurarsi che essi siano nella fase di crescita esponenziale nel giorno della placcatura. Fare 2 successive diluizioni 1/3 in 10 piatti cm a partire da una piastra di cm 1x10 confluenti 80%.
   NOTA: Pianificare il numero di piastre per l'esperimento. Calcola ogni condizione di duplicati, uno per live-cell imaging a breve termine e una per le proteine ​​estratti per determinare l'efficacia di atterramento e di espressione della proteina esogena da analisi Western Blot. Pianificare una piastra aggiuntiva per determinare il numero di cellule prima di trasduzione del virus.
2. Prima della cella di placcatura, piatti con fondo di vetro cappotto con 10 ug / ml fibronectina. Aggiungere 1 ml di una diluizione 1: 100 di 1 mg / ml fibronectina (diluito in PBS sterile 1x) a 35 millimetri piatto per ben coprire l'intera superficie e incubare per 1 ora a 37 ° C, 5% CO _2.
3. Durante l'incubazione, αMEM pre-caldo integrata with 10% FBS (αMEM ^10%) e 0,05% tripsina / EDTA a 37 ° C.
4. Dopo 45 min di incubazione, iniziare a preparare la soluzione di cellule. Nella cappa sterile, aspirare il terreno da una piastra 10 cm lavare delicatamente due volte con 1,5 ml di 0,05% tripsina / EDTA, e lasciare 0,5 ml di tripsina / EDTA all'ultimo aspirazione.
5. Incubare le cellule per 2-3 minuti a 37 ° C, 5% CO _2. Picchiettando delicatamente la piastra e l'osservazione al microscopio, verificare che tutte le cellule sono state staccate. Aggiungere 10 ml di αMEM ^10% e pipette delicatamente più volte per separare le cellule. Contare un campione di 10 microlitri di sospensione cellulare utilizzando un emocitometro.
6. soluzione fibronectina Aspirare dai piatti fondo di vetro. Non permettere che la fibronectina si asciughi prima di placcatura delle cellule.
7. Piatto 1,5x10 ⁵ cellule per piastra da 35 mm 2 ml αMEM ^10% e incubare a 37 ° C, 5% CO _2. Verificare dopo 30-45 min al microscopio che le cellule sono ben sepavalutazione, poiché hanno la tendenza ad accumularsi nel centro della piastra.
8. Se necessario, agitare i piatti delicatamente cross-saggio di ridistribuire le cellule. Piatto una piastra 35 mm Altre al numero di condizioni per contare il numero di cellule prima della trasduzione del virus.
9. Crescere le cellule fino al giorno successivo per ottenere una densità cellulare di almeno il 50%. Una densità cellulare inferiore a 50% provoca una significativa diminuzione dell'efficienza virus trasduzione, aumentato variazioni di espressione della proteina per cellula, e aumentata tossicità cellulare.
   NOTA: Rivestimento di piatti di vetro con fibronectina migliora la crescita cellulare e la morfologia e favorisce la corretta progressione delle cellule attraverso la mitosi. Si può generalmente essere sostituito da gelatina commercialmente disponibile che è più conveniente.

3. Adenovirus trasduzione e proteina endogena Knockdown da siRNA Transfection in cellule HeLa-RFP-H2B Utilizzando CAPI precipitati

Attenzione! Lavorore con i virus richiede precauzioni speciali e un corretto smaltimento di tutto il materiale che è stato in contatto con il virus.

Attenzione! Nelle nostre mani, CAPI precipita spesso hanno effetti più indesiderati, per esempio sui processi biologici che coinvolgono il traffico di vescicole (ad esempio, autofagia). Di conseguenza si consiglia di utilizzare un reagente cationico transfezione lipidi (vedi sotto) e di attendere almeno 48 ore prima che le analisi.

NOTA: Un adenovirus di controllo trasporta un gene estraneo (cioè, LacZ) o nessun gene è utilizzato per raggiungere un minimo MOI in tutte Adenofections (10-20 pfu / cell) utilizzando la minima quantità di adenovirus ricombinante portante il gene di interesse.

NOTA: Questa procedura è stato dimostrato per aiutare espressione normalizzazione per cella in una grande popolazione di cellule.

1. Un giorno dopo la placcatura cellule, contare il numero di cellule dal piatto aggiuntivo placcato. Aspirare il medio elavare una volta con 1 ml di 0,05% tripsina / EDTA. Aggiungere nuovamente 1 ml di 0,05% tripsina / EDTA e incubare a 37 ° C, 5% CO ₂ fino a quando tutte le celle sono indipendente. Separare le cellule pozzetto usando una pipetta 1 ml e contare il numero di cellule per ml utilizzando un emocitometro.
2. Determinare la quantità di virus necessaria per trasdurre cellule ad una molteplicità di infezione (MOI) di 2 unità formanti placche (PFU) della proteina di interesse (POI) per cellula e 18 PFU per cellula di un vettore vuoto (ad esempio, LacZ) per un totale di 20 PFU per cellula. Allo stesso tempo, la trasduzione 4 PFU di ogni baculovirus (actina e αTubulin, GFP e RFP-tag, rispettivamente). Trasdurre le cellule utilizzando il seguente protocollo adenofection. I virus sono stati usati come descritto in Fuchs et al. ¹⁴
3. Preparare in una cappa sterile un tubo di plastica da 1,5 ml per ogni condizione e aggiungere 400 ml di caldo αMEM-meno ^10%.
4. Scongelare una aliquota dei virus lentamente su ghiaccio e, se necessario, diluire tegli virus magazzino al fine di pipetta un volume superiore a 1 ml per ridurre al minimo gli errori di pipettamento.
5. Aggiungere la quantità di virus calcolato per condizioni di ciascun tubo di plastica da 1,5 ml contenente 400 ml αMEM-meno ^10% e mescolare delicatamente pipettando. Posizionare lo stock di virus subito di nuovo a -80 ° C per mantenere la sua attività.
6. Aspirare il supporto dalle cellule e pipetta delicatamente goccia a goccia il mix di virus. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% di CO ₂ e agitare le piastre accuratamente sotto la cappa sterile ogni 15 min per 1 ora a coprire anche le cellule con il virus. Utilizzando una piccola quantità di mezzo facilita il contatto del virus con le cellule.
7. Dopo l'incubazione, pipettare delicatamente 1,6 ml αMEM-meno ^10% per ogni piastra per ottenere un volume totale di 2 ml, avviare la sincronizzazione cellule aggiungendo 2 mM di timidina e incubare le cellule per ulteriori 2 ore a 37 ° C, 5% CO ₂ .
8. Nel frattempo, preparare le followi mix transfezione siRNAng il metodo di trasfezione CAPI (vedi Figura 1). Se nessun siRNA è necessario sostituire la quantità di siRNA da acqua sterile per eseguire un trasfezione vuoto.
9. Calcolare 200 microlitri della miscela per ogni condizione, con conseguente 400 microlitri per duplicato. Il seguente esempio è dato per una concentrazione siRNA finale di 50 Nm e deve essere adattato per ogni proteina di interesse. In un tubo di plastica da 1,5 ml, pipetta 50 ml 1 M CaCl ₂ e 11 ml di 20 micron siRNA in 139 ml H ₂ O sterile e mescolare nel vortex. Dopo un rapido giro, aggiungere con cautela goccia a goccia 200 ml HBS2x (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mm Na ₂ HPO _4, pH 7,01-7,05).
   NOTA: Il più piccoli le gocce il più piccoli sono i precipitati, con conseguente migliore efficienza di trasfezione. Mescolare delicatamente per tre volte con iniezione di aria utilizzando un 200 pl-pipetta.
10. Incubare la miscela per 30 minuti a RT. Aggiungere lentamente goccia a goccia 200 ml di mix trasfezione per ogni piatto eagitare trasversalmente. Trasferire le piastre a 37 ° C, 5% CO ₂ per 16 ore.
11. Il giorno dopo, lavare le cellule due volte con 2 ml HEPES calde (6,7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7.3) e aggiungere 2 ml αMEM-meno ^10%. Non procedere con più di quattro piastre delle celle in un momento che le variazioni di temperatura influenzano la durata del ciclo cellulare.
12. Visualizza l'efficienza infezione sotto un microscopio a fluorescenza invertito ad un ingrandimento di 20-40x (aria) e acquisire tre immagini rappresentative per condizione in entrambi i canali fluorescenti e trasmissione di documentazione. Sette ore dopo, aggiungere 2 mM di timidina e incubare per altri 16 ore a 37 ° C, 5% CO _2.
13. Il giorno dopo, 48 ore dopo la trasfezione di siRNA e infezione da virus, lavare le cellule due volte con 2 ml calda salina tampone fosfato (PBS) e rilasciare per 7 ore in 2 ml αMEM ^10% w / o rosso fenolo per l'imaging cellulare dal vivo o con fenolo Rosso per l'estrazione di proteine.
14. Celle di raccolta per ciascuna condizione 48 ore dopo la trasfezione per la preparazione di estratti proteici e analisi Western blot per determinare l'efficienza del knockdown e l'espressione della proteina endogena ^15.
    NOTA: utilizzare gli anticorpi contro la proteina di interesse, così come gli anticorpi adeguati che servono come controlli di carico. L'efficienza di atterramento deve essere determinato caricando decrescenti quantità di lisati cellulari di controllo (trasfettate con il controllo siRNA), per fornire una curva di titolazione (ad esempio, 1, ½, ¼, ⅛).

4. Adenovirus trasduzione e proteina endogena Knockdown da siRNA Transfection in cellule HeLa Utilizzando un cationico Lipid Transfection Reagent

NOTA: Qui vi presentiamo un protocollo che è stato adattato per esperimenti che non comportano la sincronizzazione delle cellule e / o quando siRNA trasfezione non può essere eseguita con il metodo CAPI, ad esempio per evitare effetti tossici indesiderati in alcune cellule lines. Questo protocollo include anche una fase replating cella dopo adenofection per lavorare ad un'opportuna densità cellulare. Abbiamo testato solo il cationico reagente di trasfezione lipidi.

Attenzione! Lavorare con i virus richiede precauzioni speciali e un corretto smaltimento di tutto il materiale che è stato in contatto con il virus.

1. Piatto 1,75 x 10 ⁵ cellule per piastra da 35 mm di 2,5 ml αMEM ^10% e incubare a 37 ° C, 5% CO _2. Piatto una piastra 35 mm Altre al numero di condizioni per contare il numero di cellule prima della trasduzione del virus.
2. Crescere le cellule fino al giorno successivo per ottenere una densità cellulare di almeno il 50%. Una densità cellulare di meno di 50% risultati in una significativa diminuzione dell'efficienza virus trasduzione, aumentato variazioni di espressione della proteina per cellula, e aumentata tossicità cellulare.
3. Un giorno dopo la placcatura cellule, contare il numero di cellule dal piatto aggiuntivo placcato. Aspiraremedio e lavare una volta con 1 ml di 0,05% tripsina / EDTA. Aggiungere nuovamente 1 ml di 0,05% tripsina / EDTA e incubare a 37 ° C, 5% CO ₂ fino a quando tutte le celle sono indipendente. celle separate e con una pipetta 1 ml e contare il numero di cellule per ml.
4. Determinare la quantità di virus necessaria per trasdurre una molteplicità di infezione (MOI) di 20-40 unità formanti placca (PFU) della proteina di interesse (POI) per cellula e 0-20 PFU per cellula di un vettore vuoto (ad esempio, LacZ) per avere un totale di 40 PFU per cellula.
5. Preparare in una cappa sterile un tubo di plastica da 1,5 ml per ogni condizione e aggiungere 400 ml di αMEM calda ^10%.
6. Scongelare una aliquota dei virus lentamente su ghiaccio e, se necessario, diluire lo stock di virus per pipettare un volume maggiore di 1 ml per minimizzare errori di pipettamento.
7. Aggiungere la quantità di virus calcolato per condizioni di ciascun tubo di plastica da 1,5 ml contenente 400 ml αMEM ^{il 10%} e mescolare delicatamente pipettando. ° postoe virus Stock immediatamente torna a -80 ° C per mantenere la sua attività.
8. Aspirare il supporto dalle cellule e pipetta delicatamente goccia a goccia il mix di virus. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% di CO ₂ e agitare le piastre accuratamente sotto la cappa sterile ogni 15 min per 1 ora a coprire anche le cellule con la diluizione virus. Utilizzando una piccola quantità di mezzo facilita il contatto del virus con le cellule.
9. Nel frattempo, preparare la miscela di trasfezione di siRNA seguendo il metodo di trasfezione. Se non siRNA è necessario, sostituire la quantità di siRNA per mezzo senza siero per eseguire un trasfezione vuoto.
   1. Il seguente esempio è dato per una concentrazione siRNA finale di 50 Nm e deve essere adattato per ogni proteina di interesse. Per ogni adenofection, preparare uno 1,5 ml tubo di plastica contenente 416 nM di siRNA in 150 ml di media senza siero (ad esempio, 6,25 ml di 20 mM siRNA + 144 ml di media senza siero) e uno 1,5 ml tubo di plastica containing 6.25 ml cationico reagente di lipidi trasfezione + 144 ml di media senza siero.
   2. Mescolare il contenuto di ogni tubo di plastica pipettando su e giù parecchie volte con una pipetta 200 microlitri. Combinare il contenuto di entrambe le provette e mescolare pipettando su e giù parecchie volte con una pipetta 200 microlitri. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
10. Dopo incubazione con il virus, pipettare delicatamente 1,8 ml αMEM ^10% di ciascuna piastra per ottenere un volume totale di 2,2 ml e aggiungere immediatamente lentamente goccia a goccia la miscela di trasfezione siRNA per ciascuna piastra e agitare trasversalmente. Trasferire le piastre a 37 ° C, 5% CO ₂ per 24 ore.
11. Il giorno dopo, ri-piatto le cellule di ogni piatto 35 millimetri in quattro nuove piastre da 35 mm a 2,5 ml αMEM ^{il 10%} ciascuno e incubare per altre 24 ore a 37 ° C, 5% di CO _2.
12. Il giorno dopo, 48 ore dopo la trasfezione di siRNA e l'infezione del virus, le cellule raccolto da un piatto per ogni condizione per la preparazione diestratti proteici e analisi Western blot per determinare l'efficienza del knockdown e l'espressione della proteina endogena ^15.
    NOTA: Con i rimanenti piastre, procedere con la fissazione delle cellule, utilizzando il protocollo di scelta e di sottoporre i campioni per l'analisi di immunofluorescenza con gli anticorpi di interesse ^14.

5. cellulare immagini dal vivo di cellule mitotiche e analisi dei dati

1. Effettuare esperimenti di imaging cellulare dal vivo a breve termine su cellule in mitosi con un microscopio invertito dotato di un / camera di termoregolata umidificata / 5% di CO _2.
   NOTA: In questo studio, un microscopio confocale disco rotante (40X, 0,75 NA) è stato utilizzato, dotato di EMCCD raffreddato fotocamera accoppiamento di carica a -50 ° C.
2. Prima di acquisizione, verificare che la camera ha raggiunto la temperatura appropriata di 37 ° C.
   NOTA: Questa operazione potrebbe richiedere diverse ore a seconda del sistema microscopico.
3. Mettere i piatti della cultura nel MICRcamera di oscope 1 ora prima acquisizione per consentire il corretto equilibrio del mezzo ed evitare attenzione alla deriva a causa di variazioni di temperatura. Monitorare lo stato mitotico delle cellule. A questo punto, il 10-15% delle celle deve essere nelle prime fasi della mitosi (profase-prometafase).
4. Durante il tempo di equilibrio, impostare i parametri di acquisizione come determinato in esperimenti precedenti. Tipicamente, un tempo di esposizione per entrambi i canali (488 e 594) di .2-3 sec con una intensità del laser di 100% e una sensibilità di 121-130 sono parametri adatti nelle nostre mani.
   NOTA: In primo test dovrebbe essere fatto per determinare l'intensità del laser e l'acquisizione di tempo / intervallo minimo che si traducono in una risoluzione appropriata con photobleaching minima che provoca danni cellulari e perturba la progressione mitotico.
5. Scegliere diversi campi per condizione di ottenere un numero significativo di cellule per analizzare senza superare l'intervallo di acquisizione. Utilizzando un sistema confocale disco rotante, una configurazione tipica sarà include quattro condizioni differenti, 7 campi per piastra e 2 canali di colore (488 e 594), con un intervallo di 1,5-2 minuti nel corso di un periodo di min-75.
6. Scegli cellule che sono al momento dell'ingresso mitotico, re-impostare la messa a fuoco una volta che tutti i campi sono stati scelti e avviare l'acquisizione il più velocemente possibile.
7. Monitorare la stabilità del sistema per almeno tre punti di tempo e re-impostare la messa a fuoco, se necessario.
8. Dopo il primo cellule vive breve termine di 75 min, nuovi campi di cellule mitotiche possono essere scelti per acquisire una seconda serie di film da aumentare il numero di cellule in corso di analisi.
9. Stabilire criteri ben definiti per analizzare i fenotipi di cellule in mitosi, che dipenderanno i marcatori fluorescenti utilizzate. I difetti in mitosi possono includere prolungamento del tempo trascorso in mitosi (dalla ripartizione nucleare fino anaphase), cromosoma disallineamento, mandrino a dondolo, e la corteccia blebbing ^14.

6. LifeAct-TagGFP2 Adenovirus di trasduzione in Differentiating C2C12 mioblasti mouse

NOTA: Il protocollo adenofection è applicabile anche ai mioblasti topo C2C12 difficili da infettare sottoposti differenziazione.

1. Piastra 2 x 10 ⁵ cellule C2C12 in coltura 35 mm in terreno di crescita in plastica o su un substrato di scelta.
   NOTA: la differenziazione delle cellule è migliorata su piatti gelatine- o Matrigel rivestite. Pianificare una piastra aggiuntiva per determinare il numero di cellule prima di trasduzione del virus.
2. Il giorno seguente, le cellule dovrebbe aver raggiunto l'80% di confluenza. Indurre la differenziazione dei mioblasti lavando le cellule due volte con PBS calda e aggiungendo 2 ml di terreno di differenziamento (DM).
3. Il giorno successivo, etichettato come il giorno 1 (D1) di differenziazione, la trasduzione miociti con adenovirus LifeAct-TagGFP2 per visualizzare il citoscheletro di actina in cellule vive. Contare il numero di cellule dalla piastra aggiuntiva come descritto al punto 3.2. Calcolare 5 PFU / cellula di LifeAct-TagGFP2 adenovirus e AdLacZ / cella 45 PFU dopo l'esameple descritto nella Tabella 1. La quantità di virus totale è 50 PFU / cellula. I virus sono stati usati come descritto ¹⁴
4. Preparare in una cappa sterile, un tubo di plastica da 1,5 ml per ogni condizione e aggiungere 400 ml di DM caldo.
5. Scongelare una aliquota dei virus lentamente su ghiaccio e, se necessario, diluire lo stock di virus per pipettare un volume maggiore di 1 ml per minimizzare errori di pipettamento.
6. Aggiungere la giusta quantità di particelle virali per condizione di ciascun tubo di plastica da 1,5 ml contenente 400 ml di DM e mescolare delicatamente pipettando. Posizionare lo stock di virus subito di nuovo a -80 ° C per mantenere la sua attività.
7. Aspirare il supporto dai piatti e pipetta delicatamente goccia a goccia il mix di virus. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% di CO ₂ e agitare le piastre accuratamente sotto la cappa sterile ogni 15 min per un totale di 1 ora a coprire anche le cellule con il virus.
8. Dopo l'incubazione, pipettare delicatamente 1,6 ml di DM su ogni piatto e continuare l'incubation per un ulteriore 2 ore a 37 ° C, 5% di CO _2.
9. Nel frattempo, preparare una miscela di trasfezione vuoto seguendo il metodo di trasfezione CAPI. Calcola 200 mix microlitri per ogni condizione. Utilizzare il seguente esempio per un volume totale di 400 ml mix.
   1. In un tubo di plastica da 1,5 ml, pipetta 50 ml 1 M CaCl ₂ in 150 ml di H ₂ O sterile e mescolare nel vortex. Dopo un rapido giro, aggiungere con cautela goccia a goccia 200 ml HBS2x (280 mM NaCl, 50 mM HEPES, 1,5 mm Na ₂ HPO _4, pH 7,01-7,05). Mescolare delicatamente con iniezione di aria per tre volte con una pipetta 200 ml.
10. Incubare la miscela per 30 minuti a RT. Aggiungere lentamente goccia a goccia 200 ml di mix trasfezione di ogni piatto e agitare trasversalmente. Trasferire le piastre a 37 ° C, 5% CO ₂ per 16 ore.
11. Il giorno dopo, lavare le cellule due volte con 2 ml HEPES calde (6,7 mM KCl, 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7.3) e aggiungere 2 ml di DM. Visualizza la infeefficienza ction sotto un microscopio a fluorescenza invertito ad un ingrandimento di 20-40x (aria) e acquisire tre immagini rappresentative per condizione in entrambi i canali fluorescenti e trasmissione di documentazione.
12. A seconda della configurazione dell'esperimento desiderato, seguire la differenziazione in miotubi per diversi giorni. Le cellule possono essere fissati e successivamente sottoposti ad analisi di immunofluorescenza o studi di imaging cellulare dal vivo può essere eseguita.

Risultati

Trasfezione di BAG3-GFP DNA plasmidico utilizzando lipidi cationici è stata associata con l'espressione eterogenea in cellule HeLa, alcune cellule mostrano livelli malapena rilevabili di proteine ​​e altri cuscinetti livelli molto elevati BAG3 (Figura 2A). In queste cellule, perdita dell'omeostasi proteina è stata evidenziata da accumulo di BAG3-GFP in aggregati perinucleare (Figura 2A, frecce). Al contrario, la trasduzione delle cellule co...

Discussione

Qui, abbiamo descritto un metodo che consenta esperimenti svuotamento soccorso da eseguire, che è applicabile ad analisi funzionali dei processi cellulari biologici che sono particolarmente sensibili alla sovraespressione di proteine ​​che interessano la stechiometria e la dinamica di complessi proteici e strutture macromolecolari. la divisione cellulare mitotico è un esempio estremo di morfodinamica cellulari finemente sintonizzato che coinvolge i cambiamenti più drammatici e spettacolari nella struttura general...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C2C12 Mouse Myoblasts	ATCC	CRL-1772
Adenovirus custom design	Welgen	Custom design
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose	Thermo Fisher	11965-092
EDTA	Sigma	E5134
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
Fibronectin	Sigma	F1141
Glass bottom dishes, 35 mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada		Klebig C et al. 2009
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
Horse Serum, New Zealand	Thermo Fisher	16050-122
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher	13778-150
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha	Wisent	310-101-CL
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides	Thermo Fisher	12000-022
Minimal Essential Medium (MEM) Alpha without Phenol Red	Thermo Fisher	41061-029
Na2HPO4	Biobasic	S0404
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
OptiMEM	Thermo Fisher	11058-021
rAVCMV-LifeAct-TagGFP2	IBIDI	60121
siRNA duplexes	Dharmacon	Custom design
Thymidine	Sigma	T9250
Trypsine 2.5%	Thermo Fisher	15090-046