Adenofection : 고갈-구조 실험에 의해 세포 Morphodynamics 분자 샤페론의 역할을 공부하는 방법

요약

We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.

초록

이러한 유사 분열 및 세포 분화 등 세포 과정은 크게 세포 골격 구조의 적절한 리모델링에 의존하는 세포 모양의 변화에​​ 의해 지배된다. 이는 주어진 시간과 장소에서 고차 고분자 구조의 조립 분해, 단백질의 과발현에 의한 교란에 특히 민감한 방법을 포함한다. 근처 대 정상 세포 형태를 단백질 항상성을 유지하고 유지할 수있는 방법은 세포 과정의 넓은 범위에서 목적 단백질의 기능적 기여도를 결정하는 것이 매우 바람직하다. RNA 간섭에 기초하여 과도 플리 구조 실험은 단백질의 기능 및 구조적 요구를 분석하기위한 강력한 방법이다. 그러나, 생리 학적 수준의 최소 편차를 갖는 목적 단백질의 재 도입이 어려운 과제이다. 여기에서 우리는 분자 보호자의 역할을 연구하기 위해 개발 된 방법이라고 adenofection을 설명D 분열하는 세포의 정상적인 동작 파트너 액틴 개조와의 관계. HeLa 세포는 siRNA 이중 가닥의 3'UTR 영역 타겟팅 BAG3 고갈되었다. GFP-태그 BAG3 단백질은 형질 전환 시약에 결합하는 재조합 아데노 바이러스를 사용하여 세포의> 75 %로 동시에 재 도입 하였다. Adenofection는 스트레스 반응의 부재, BAG3 고갈 HeLa 세포에 가까운 생리적 수준 BAG3-GFP 단백질을 발현 할 수 있었다. 이펙트 내인성 열 쇼크 단백질 샤페론 단백질 항상성의 주요 응력 - 유도 조절기의 레벨에서 관찰되지 않았다. 또한, 세포 형질 형질시 형광 마커의 발현을 구동 배큘로 바이러스를 첨가함으로써, 시간 경과에 의해 미세한 분열 세포 역학 해부 수 정상적인 분열 진행 최소 교란으로 분석한다. Adenofection은 근육 모세포은 diff의 기능 분석을위한 하드에 감염시킬 마우스 세포에도 적용하고, 적합myotubes에 erentiation. 따라서 adenofection 구조 - 기능은 고차 세포 골격 역학에 의존하는 중요한 생물학적 과정에 관여하는 단백질의 분석을 수행하기 위해 다양한 방법을 제공한다.

서문

포유 동물 세포에서 유전자 발현의 불 활성화 작용은 단백질의 기능을 해부 금 표준이다. 새로 아연 손가락 클레아 제와 같은 특정 사이트 클레아 제의 사용을 기반으로 게놈 편집 기술을 개발하고 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR)은 / CAS9 이제 타겟 유전자 삭제 및 돌연변이 ^{1, 2와} 세포주의 생성을 할 수 있습니다. 이 새로운 접근 방식은 우리가 단백질의 기능과 인간 질병의 유전에 대한 우리의 이해를 공부하는 방법을 혁신해야합니다. 일부 경우에서, 그러나, 장기 또는 완전한 유전자 녹아웃 바람직하지 않다 이차 전지 및 보상 메커니즘을 유발할 수있다. 유전자 조작 된 세포주의 생성은 또한 제한된 증식 능력 때나 다양한 세포 유형의 돌연변이의 큰 집합의 스크리닝 받고자 일차 세포 배양 물을 처리 할 때 제한 될 수있다. 이는 종종 셀 B의 의존성을 결정하기 위해 필요한단백질의 구조적 요구 사항에 대한 학적 처리. 이를 위해 다양한 세포 배경 일시적 플리 구조 실험 있도록 RNA 간섭에 의한 가역적 최저 여전히 구조 기능 관심 ^3의 단백질 분석을 수행하는 간단하고 강력한 접근 남아있다. 그러나, 이러한 접근법의 주요 단점은 어려움 효율적인 침묵을 달성하고, 세포 집단의 대부분에 가까운 생리적 수준의 관심 또는 그의 변이체의 단백질을 재 도입하는 것이다. 이 단백질 - 단백질 상호 작용에 대한 예를 들어 세포 인구 기반 분석에서 본 것과, 단일 세포 (hypomorphic 표현형)의 수준에서 볼 기능적 효과의 상관 관계를 시도 포괄적 인 연구를 활성화하기 위해 매우 중요합니다.

고전적인 형질 전환 방법을 사용하여, 하나는 거의 세포의 큰 집단에서 외인성 단백질의 균질 낮은 발현을 달성 할 수 없다. 재조합 바이러스와 세포의 형질 도입아데노 바이러스처럼 자주 외래 단백질의 더 정규화 된 표현을 가능하게한다. 그러나 아데노 흡수는 비 - 인간 세포에서 존재하지 않거나 약하게 일부 인간 세포 유형에서 발현되는 CAR 수용체에 의해 제한된다. 또한, 아데노 바이러스의 세포 엔트리는 셀 형상 및 밀착성 ^4-6 조절 신호 전달 경로 활성화한다. 세포 morphodynamics의 규제 메커니즘을 연구 할 때 분명히 바람직하지 않다. 우리는 세포 분열과 굴지 역학에, 보호자 단지, BAG3 - HSPB8의 기능 분석에 착수 할 때 우리는이 문제에 직면했다. 개척 작업은 스트레스 ^7,8 중에 단백질 품질 관리와 자식 작용이 보호자 단지의 역할을 설명했다. 이러한 연구의 대부분은, 그러나, 일반적으로 샤페론은 스트레스를받는 동안 상향 조절되는 것으로 가정하면, 단백질의 과발현에 의존했다. 이것은 HSPB8 복잡한에 여부 BAG3의 질문에 열려있다, 일을 표현 분열하는 세포의 정상적인 작동에 기여할 수많은 암 세포 유형 ⁹ 등 ESE 샤페론. 특히, 보호자 단지는 HSPB의 보호자 및 세포 골격 역학 ⁽¹⁰⁾ 사이의 새로운 연결 주어진 큰 관심이었다 유사 분열 진행을 제어 액틴 기반 구조의 리모델링에 기여하는지 여부. 이 문제를 해결하기 위해 유사 분열 진행 또는 휴대 형태 방해하지 것이고, 셀 형상 변경을 규제 고분자 복합체의 역학 이차 교란을 방지하기 위해 단백질 항상성을 유지할 것이다 플리 구조 실험을위한 효과적인 방법을 개발하고자 하였다 . 따라서 이상적으로, 관심있는 유전자의 고갈 - 추가 백을 동시에 수행해야합니다.

양이온 성 지질 또는 중합체와 아데노 바이러스의 착물의 사용은 시험 관내 및 생체 ^11,12 유전자 전달을 촉진하기 위해 기술되었다. 예를 들어, 인산 칼슘 (CAPI)을 갖는 석출물을 보인다CAR 독립적 인 통로 ^(13)를 통해 바이러스 바인딩 항목을 강화 아데노 바이러스. 실제로, 우리는 양이온 성 화합물과 아데노 바이러스 계 형질 세포 및 형질 전환을 조합하면 플리 구조 실험의 효율을 향상시킬 수 있다는 것을 발견했다. 이것은 대부분의 근처 내인성 수준에서 외인성 단백질의 발현을 조절하기 위해 더 넓은 윈도우의 세포주 및 목적 유전자와 이익에 따라, 우리는 20 배로 -3-하여 바이러스의 양을 낮출 수 세포 형태에 미치는 영향을 최소화하여 원하는 세포 인구의. 이러한 조건 하에서, 또한 내인성 단백질의 발현 (> 75 %)의 고효율 녹다운을 얻을 수있다. 우리는 이에 생리적 소유주의 기능을 분석하는 방법이 적합 단계에 의해 방법 단계를 설명하고 열 충격 단백질 가족의 스트레스 유발 보호자의 변경 수준에 의해 평가로 단백질 항상성이 크게 교란되지 않고 있다는 증거를 제공시간 경과 비디오 현미경에 의한 분자 보호자의 제작. 이 프로토콜은 셀 동기화 절차와 유사 분열 진행 중 정상 액틴 기반 및 스핀들 역학과 최소한의 간섭 형광 마커의 낮은 수준의 공동 발현을위한 상업적으로 이용 가능한 배큘로 바이러스의 사용 의무입니다. 우리는 또한 체외에서 myotubes에 근원 세포의 분화에 유의 한 영향을 마우스 C2C12 세포를, "형질 도입하기 어렵다"에 적용 할 수있는 방법의 다양성을 보여줍니다.

프로토콜

중간 및 솔루션 1. 준비 (모든 멸균 여과)

1. 마우스 C2C12 근육 세포 (분화 연구)
   1. C2C12 세포 배양 유지 성장 중간 500ml의 준비 : 10 % FBS 및 2mM의 글루타민으로 보충 된 DMEM 고 글루코오스한다.
   2. C2C12 차별화 100 ml의 차별화 중간 (DM)를 준비 : 2 % 말 혈청 DMEM 높은 포도당을.
2. 헬라 세포 (유사 분열 세포 연구)
   1. 준비 500ml의 αMEM 헬라 RFP-H2B 세포 배양 유지 실험 : 10 % FBS와 2 mM L 글루타민 (αMEM ^{10 %)으로} 보충 αMEM.
   2. 헬라 RFP-H2B 셀 동기화 (데 옥시 리보 뉴 클레오 시드 / 리보 뉴 클레오없이) 500 ml의 αMEM 마이너스를 준비 : 10 % FBS와 2 mM의 L 글루타민 (αMEM 마이너스 ^{10 %)로} 보충 αMEM 마이너스를.
   3. 헬라 - RFP-H2B 리터에 대한 페놀 레드없이 20 ㎖를 αMEM 준비필자 셀 획득 : αMEM 페놀 레드가없는 10 % FBS와 2 mM L 글루타민.
   4. 100 MM의 티미 딘을 준비합니다 텍싱에 의해 37 ° C에서 1 ML의 H ₂ O에서 24.2 mg의 용해. 필터 소독과 4 ° C에서 보관하십시오.
3. 일반적인 솔루션
   1. 0.05 % 트립신 / EDTA 준비 : 0.05 % 트립신, 0.625 mM의 EDTA를 1 배 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에서. 필터는 살균 및 저장 분취 량을 -20 ℃에서. 일단 4 ° C에서 나누어 보관, 해동.
   2. HBS2x 준비 : 280 밀리미터의 NaCl, 50 mM의 HEPES, 1.5 mM의 나 ₂ HPO _4. 10 N NaOH로 pH를 정확히 사이 7.01-7.05를 조정합니다. 살균 필터 및 4 ℃에서 보관하십시오.

헬라 - RFP-H2B 세포의 피브로넥틴 및 도금와 세포 배양 플레이트 2. 코팅

주 :이 실험에 앞서, 각각의 조작기가 변형 OC 수 ​​있기 때문에, 세포의 적절한 농도를 달성하기 위해 최적의 셀 도금 조건을 설정해야각 조작 각각 다른 세포주 사이 CUR.

1. 실험 전날, 그들은 도금의 날에 성장 지수 상 내에 있는지 확인 헬라 - RFP-H2B 세포를 확장합니다. 80 % 합류 1 × 센티미터 판부터 10cm 플레이트에서 2 연속 1/3 희석합니다.
   참고 : 실험 판의 수를 계획합니다. 중복, 단백질 단기 라이브 세포 이미징을위한 하나 하나의 웨스턴 블롯 분석에 의해 최저 및 외래 단백질 발현의 효능을 결정하기 위해 추출하여 각 조건을 계산합니다. 바이러스 형질 도입 이전에 세포 수를 결정하기 위해 하나의 부가 플레이트를 계획한다.
2. 10 μg의 / ㎖ 피브로넥틴과 함께, 도금 코팅 유리 바닥 요리를 세포에 앞서. 물론 전체 표면을 커버하고 37 ° C, 5 % CO _2에서 1 시간 동안 품어 1 ㎎ / ㎖ 피브로넥틴 (멸균 1X PBS에 희석) 35mm 당 접시 (100) 희석 : 1의 1 ML을 추가합니다.
3. 배양하는 동안, 미리 따뜻한 αMEM은 위스콘신 보충37 ° C에서 10 % FBS (αMEM ^{10 %)와} 0.05 % 트립신 / EDTA 번째.
4. 인큐베이션 45 분 후, 세포 용액을 제조 시작한다. 멸균 후드에서, 10 센티미터 판에서 매체를 대기음 1.5 ml의 0.05 % 트립신 / EDTA로 두 번 부드럽게 씻어, 마지막 열망에 트립신 / EDTA 0.5 ml를 둡니다.
5. 37 ℃에서 2-3 분 동안 세포를 인큐베이션, 5 % CO _2. 부드럽게 현미경 판과 관찰을 눌러 모든 세포가 분리되었는지 확인합니다. 세포를 분리하는 αMEM ^{10 %} 피펫 부드럽게 여러 번 10 ML을 추가합니다. 혈구 계를 사용하여 세포 현탁액 10 μL 샘플 카운트.
6. 유리 바닥 요리에서 대기음 피브로넥틴 솔루션입니다. 피브로넥틴 셀 도금하기 전에 건조하는 것을 허용하지 않습니다.
7. 플레이트 1.5 × ⁵ 2 ml의 αMEM ^{10 %에서} 35mm 접시 당 세포와 37 ° C, 5 % CO ₂ 부화. 세포가 잘 SEPA 것을 현미경 30-45 분 후에 확인그들은 플레이트의 중심에 축적하는 경향을 갖기 때문에, 평가.
8. 필요한 경우, 세포를 재배포 부드럽게 교차 현명한 판을 선동. 바이러스 형질 도입 이전에 세포 수를 계산하기 위해 조건의 수에 추가 한 접시 35mm 접시.
9. 적어도 50 %의 세포 밀도를 달성하기 위해 다음 날까지 세포 성장. 세포 밀도는 바이러스 형질 도입 효율의 상당한 감소를 50 % 미만의 결과는 세포 당 단백질의 발현 변화를 증가하고 세포 독성을 증가.
   참고 : 피브로넥틴와 유리 접시의 코팅은 세포의 성장과 형태를 개선하고 유사 분열을 통해 세포의 적절한 진행을 촉진한다. 이것은 일반적으로 저렴 시판 젤라틴으로 대체 될 수있다.

3. 아데노 바이러스 형질 도입 및 CAPI 침전물을 사용하여 헬라 - RFP-H2B 세포에 siRNA를 형질에 의해 최저 내인성 단백질

주의! 작업바이러스에 보내고하는 것은 특별한주의와 바이러스와 접촉 한 모든 재료의 적절한 처리가 필요합니다.

주의! 우리의 손에, CAPI는 종종 (예를 들어, 자식 작용) 소포 인신 매매를 포함하는 생물학적 과정에 예를 들어, 더 바람직하지 않은 영향을 침전. 따라서 (아래 참조) 및 분석하기 전에 적어도 48 시간을 기다려야 양이온 성 지질 형질 전환 시약을 사용하는 것이 좋습니다.

참고 : 관련이없는 유전자 (즉, LacZ를) 또는 전혀 유전자를 운반하는 제어 아데노 바이러스는 관심의 유전자를 운반하는 재조합 아데노 바이러스의 가장 낮은 금액을 사용하는 모든 Adenofections에서 최소한의 MOI (10 ~ 20 PFU / 셀)에 도달하는 데 사용됩니다.

주 :이 절차는 많은 세포 집단에서 세포 당 정규화 표현 있도록 도시하고있다.

1. 하루 셀 도금 후, 추가 도금 접시에서 세포의 수를 계산. 매체를 기음과1 ml의 0.05 % 트립신 / EDTA로 한번 씻어. 0.05 % 트립신 / EDTA의 다시 1 ML을 추가하고 모든 세포가 분리 될 때까지 37 ° C, 5 % CO ₂ 부화. 웰 1 ㎖ 피펫을 사용하여 세포를 분리하여 혈구 계를 사용하여 용액 당 세포의 수를 계산.
2. 감염의 다수의 셀 당이자 (POI)의 단백질이 플라크 형성 단위 (PFU)와 빈 벡터의 세포 당 18 PFU의 (MOI)에서 세포를 형질 도입에 필요한 바이러스의 양을 결정합니다 (예를 들어, LacZ를) 셀 당 20 PFU의 총을 가지고 있습니다. 동시에 각 배큘로 바이러스 (액틴과 αTubulin, GFP 및 RFP-태그 각각)의 4 PFU를 형질 도입. 다음 adenofection 프로토콜을 사용하여 세포를 형질 도입. Fuchs의 외에 기재된 바이러스를 사용 하였다. ¹⁴
3. 각 조건에 대한 멸균 후드에서 1.5 ML의 플라스틱 튜브를 준비하고 따뜻한 αMEM 마이너스 ^{10 %의} 400 μl를 추가합니다.
4. 필요한 경우 t을 희석, 얼음에 천천히 바이러스의 나누어지는을 해동하고피펫 오류를 최소화하기 위해 볼륨을 1보다 큰 μl를 피펫하기 위해 그는 바이러스 재고.
5. 400 μL의 αMEM 마이너스 ^{10 %를} 포함하는 각 1.5 ml의 플라스틱 튜브에 조건에 따라 계산 된 바이러스의 양을 추가하고 피펫으로 가볍게 섞는다. 활동을 유지하는 즉시 다시 -80 ° C에서 바이러스 주식을 놓습니다.
6. 세포에서 매체를 대기음 부드럽게 바이러스 믹스 드롭 현명한 피펫. 37 ° C, 5 % CO _2에서 인큐베이션하고 세포를 웰 바이러스와 세포를 덮도록 1 시간 동안 무균 후드하에 신중 각각 15 분 동안 플레이트를 교반. 매체의 소량을 사용하면 세포와 바이러스의 접촉을 용이하게한다.
7. 배양 후, 부드럽게 2 ml의 총 부피를 얻기 위하여 각 플레이트에 1.6 mL의 αMEM 마이너스 ^{10 %} 피펫 2 mM의 티미 딘을 첨가함으로써 셀 동기화를 시작하고 37 ° C, 5 % CO _2에서 추가로 2 시간 동안 세포를 배양한다 .
8. 한편, siRNA를 형질 믹스 followi 준비CAPI 형질 방법 겨 (도 1 참조). siRNA를 더 필요 없으면 빈 트랜 스펙 션을 수행하는 멸균하여 siRNA의 양을 대체.
9. 중복 당 400 μL의 결과로 각 조건에서 200 μL 믹스를 계산한다. 다음의 예에서는, 50 nm의 최종 siRNA의 농도에 대해 부여하고 관심있는 각각의 단백질에 적합해야한다. 1.5 ml의 플라스틱 튜브에 139 ㎕의 멸균 H ₂ O 50 μL 피펫 1 M 염화칼슘 ₂ ㎕의 20 μM 11의 siRNA 및 텍싱하여 혼합한다. 빠른 스핀 후, 드롭 현명한 200 μL HBS2x (280 mM의 염화나트륨, 50 mM의 HEPES, 1.5 mM의 나 ₂ HPO _4, pH가 7.01-7.05)을 조심스럽게 추가합니다.
   주 : 작은 작은 방울 더 형질 전환 효율이, 석출물이다. 부드럽게 200 μL 피펫을 사용하여 공기 주입에 의해 세 번 섞는다.
10. RT에서 30 분 동안 혼합을 부화. 드롭 현명한 천천히 추가 형질 믹스 200 μl를 각 플레이트와크로스 현명한 선동. 16 시간 동안 37 ℃로, 5 % CO _2의 접시를 전송합니다.
11. 다음 날, 2 ml의 따뜻한 HEPES (6.7 밀리미터의 KCl, 150 mM의 염화나트륨, 10 mM의 HEPES, pH를 7.3)로 두 번 세포를 씻어 ¹⁰ 2 ml의 αMEM 마이너스 ^{%를 추가합니다.} 온도 변화가 세포주기의 길이를 결정하므로 한번에 개 이상의 셀 플레이트를 진행하지 않는다.
12. 20-40x (공기)의 배율에서 거꾸로 형광 현미경으로 감염 효율을 시각화하고 문서를 모두 형광 및 전송 채널의 상태에 따라 세 가지 대표 이미지를 수집. 7 시간 후, 37 ° C, 5 % CO _2에서 추가로 16 시간 동안 2 MM의 티미 딘을 추가하고 품어.
13. 다음 날, siRNA를 형질 감염 및 바이러스 감염 후 48 시간 2 ml의 따뜻한 인산 완충 식염수 (PBS)로 두 번 세포를 씻어 라이브 세포 이미징 또는 페놀과 / 페놀 오 레드 승 2 ml의 αMEM ^{10 %에서} 7 시간 동안 해제 단백질 추출을위한 레드.
14. 단백질 추출물의 준비와 웨스턴 블롯 분석을위한 각 조건에 48 시간 포스트 형질 전환을위한 수확 세포는 최저의 효율성과 내인성 단백질 ^15의 발현을 확인합니다.
    참고 : 관심의 단백질뿐만 아니라 로딩 컨트롤로서 적절한 항체에 대한 항체를 사용합니다. 최저 효율이 적정 곡선을 제공하기 위해 (대조군 siRNA를 형질) 대조군 세포 용 해물의 저하 량을로드하여 결정되어야한다 (즉, 1, ½, ¼, ⅛).

양이온 성 지질 형질 시약을 사용하여 헬라 세포에 siRNA를 형질에 의해 최저 4 아데노 바이러스 형질 도입과 내인성 단백질

주 : 여기에서는 셀 동기화를 수반하지 않는 실험에 적합 하였다 프로토콜을 제시 및 / siRNA를 형질 감염은 CAPI 방법에 의해 수행 될 수없는 경우, 예를 들어 일부 셀 LIN 바람직하지 않은 독성 효과를 피하거나에스. 이 프로토콜은 또한 적절한 세포 밀도에서 일하기 위해 adenofection 후 셀 replating 단계를 포함한다. 우리는 양이온 성 지질 형질 전환 시약을 테스트했습니다.

주의! 바이러스에 작업하는 것은 특별한주의와 바이러스와 접촉 한 모든 재료의 적절한 처리가 필요합니다.

1. 플레이트 1.75 × 10 ⁵ 2.5 ml의 αMEM ^{10 %에서} 35mm 접시 당 세포와 37 ° C에서 품어, 5 % CO _2. 바이러스 형질 도입 이전에 세포 수를 계산하기 위해 조건의 수에 추가 한 접시 35mm 접시.
2. 적어도 50 %의 세포 밀도를 달성하기 위해 다음 날까지 세포 성장. 바이러스 형질 도입 효율의 상당한 감소를 50 % 미만의 결과의 셀 밀도는 세포 당 단백질의 발현 변화를 증가하고 세포 독성을 증가.
3. 하루 셀 도금 후, 추가 도금 접시에서 세포의 수를 계산. 대기음매체는 1 ml를 0.05 % 트립신 / EDTA로 한번 씻어. 0.05 % 트립신 / EDTA의 다시 1 ML을 추가하고 모든 세포가 분리 될 때까지 37 ° C, 5 % CO ₂ 부화. 분리 된 세포를 웰 1 mL를 피펫을 이용하여 용액 당 세포의 수를 계산.
4. 예를 들어 (감염 다중 셀 당이자 (POI)의 단백질의 20 ~ 40 플라크 형성 단위 (PFU)와 빈 벡터의 세포 당 0-20 PFU의 (MOI)를 형질 도입에 필요한 바이러스의 양을 결정, LacZ를)는 셀 당 40 PFU의 총을 가지고 있습니다.
5. 각 조건에 대한 멸균 후드에서 1.5 ML의 플라스틱 튜브를 준비하고 따뜻한 αMEM ^{10 %의} 400 μl를 추가합니다.
6. , 피펫 팅의 오차를 최소화하기 위해 볼륨을 초과 한 μL 피펫을 위해 바이러스 스톡을 희석 필요한 경우 얼음에 서서히 바이러스 분취 액을 해동하고.
7. 400 ㎕를 αMEM ^{10 %를} 포함하는 각 1.5 ml의 플라스틱 튜브에 조건에 따라 계산 된 바이러스의 양을 추가하고 피펫으로 가볍게 섞는다. 장소 일즉시 다시 -80 ° C에서 전자 바이러스 주가는 활동을 유지합니다.
8. 세포에서 매체를 대기음 부드럽게 바이러스 믹스 드롭 현명한 피펫. 37 ° C, 5 % CO _2에서 인큐베이션하고 세포를 잘 바이러스 희석 셀을 덮도록 1 시간 동안 무균 후드하에 신중 각각 15 분 동안 플레이트를 교반. 매체의 소량을 사용하면 세포와 바이러스의 접촉을 용이하게한다.
9. 한편, 형질 전환 방법은 다음 siRNA를 형질 믹스를 준비합니다. siRNA를 더 필요 없으면 빈 트랜 스펙 션을 수행하는 혈청없는 배지에서의 siRNA의 양을 대체.
   1. 다음의 예에서는, 50 nm의 최종 siRNA의 농도에 대해 부여하고 관심있는 각각의 단백질에 적합해야한다. 각 adenofection 들어, 혈청없이 150 ㎕의 매질에서 (예를 들면, 20 ㎕의 6.25 μM siRNA를 + 혈청이없는 배지 144 μL) 및 한 1.5 mL의 플라스틱 튜브 containi을 416 nM의 siRNA를 함유 한 1.5 mL의 플라스틱 관을 준비혈청없이 NG는 6.25 μl의 양이온 성 지질 형질 전환 시약 + 144 μL 매체.
   2. 최대 피펫 팅 200 μL 피펫 여러 번 각각 아래의 플라스틱 튜브의 함유량을 혼합한다. 두 튜브의 내용을 결합하여 최대 피펫 팅하여 200 μL 피펫 수회 다운 혼합한다. RT에서 5 분 동안 인큐베이션.
10. 바이러스와 항온 배양 한 후, 부드럽게 2.2 ml의 총 부피를 얻기 위하여 각 플레이트에 1.8 mL의 αMEM ^{10 %} 피펫 즉시 적가 siRNA를 형질 감염 혼합물을 각 플레이트에 천천히 부가 교차 - 방향을 교반. 24 시간 동안 37 ℃로, 5 % CO _2의 접시를 전송합니다.
11. 다음 날, 다시 판 37 ° C에서 추가로 24 시간 동안 2.5 ml의 αMEM ^{10 %에} 네 개의 새로운 35mm 판에 각각 35mm 판에서 세포를 각각 배양, 5 % CO _2.
12. 다음 날, siRNA를 형질 감염 및 바이러스 감염의 준비를위한 각 조건에 대해 하나의 플레이트에서 수확 세포 후 48 시간단백질 추출 및 웨스턴 블롯 분석은 최저 효율 및 내인성 단백질 ^15의 발현을 확인한다.
    참고 : 나머지 판으로, 세포 고정을 진행 선택의 프로토콜을 사용하여 관심 ^(14)의 항체와 면역 형광 분석 샘플을 대상.

유사 분열 세포 및 데이터 분석 5. 라이브 셀 이미징

1. A / 5 가습 %의 CO ₂ / 온도 조절 챔버가 장착 된 거꾸로 현미경과 유사 분열 세포에 단기 라이브 세포 이미징 실험을 수행합니다.
   참고 : 본 연구에서는 회전 디스크 공 초점 레이저 주사 현미경 (40X, NA 0.75)를 사용하고, EMCCD 구비 -50 ℃에서 전하 결합 카메라를 냉각시켰다.
2. 인수에 앞서, 챔버는 37 ° C의 적정 온도에 도달 한 것을 확인합니다.
   참고 :이 현미경 시스템에 따라 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.
3. MICR의 배양 접시를 놓습니다oscope 챔버 취득 전에 1 시간은 매체의 적절한 균형을 사용하고 온도 변화에 의한 드리프트 집중을 방지한다. 세포의 유사 분열 상태를 모니터링합니다. 이 시점에서, 세포 10-15 %가 유사 분열 (의향-prometaphase)의 초기 단계에 있어야한다.
4. 이전의 실험에서 결정된 바와 같이 평형 기간 동안 획득 매개 변수를 설정. 일반적으로, 100 %의 레이저 강도 및 121-130의 감도 0.2-3 초, 두 채널 (488 및 594)에 대한 노출 시간은 우리 손에 적합 파라미터이다.
   참고 : 첫 번째 테스트는 세포 손상의 원인과 유사 분열 진행을 교란 최소 광표백에 적절한 해상도가 발생할 최소 레이저 강도 및 수집 시간 / 간격을 결정해야한다.
5. 획득 구간을 초과하지 않고 분석하는 셀들의 많은 수를 구하는 조건에 따라 여러 필드를 선택. 일반적인 설정은에서와 것 회전하는 디스크 공 촛점 시스템을 사용하여네 가지 조건, 접시 당 7 필드와 75 분-기간 동안 1.5 분 간격으로 두 색상 채널 (488 및 594)을 clude.
6. 유사 분열 항목에있는 세포, 한 번에 모든 필드가 선택되었습니다 초점을 다시 설정하고 가능한 한 빨리 획득을 시작을 선택합니다.
7. 적어도 세 번째 점 시스템의 안정성을 모니터링하고 필요에 초점을 다시 설정.
8. 75 분의 제 단기 생균 촬상 후, 세포 분열의 새로운 필드가 분석되고 세포의 수를 증가시키는 영화의 제 2 세트를 획득하기 위해 선택 될 수있다.
9. 형광 마커에 따라 달라집니다 세포의 유사 분열 표현형이 사용되는 분석하는 잘 정의 된 기준을 결정합니다. 유사 분열에 결함 ^(14)에 blebbing, 염색체의 어긋남, 스핀들 락 및 피질 (핵 anaphase (핵분열 말기)까지 고장에서) 유사 분열에 소요되는 시간을 연장 포함 할 수있다.

Differentiatin 6. LifeAct-TagGFP2 아데노 바이러스 형질 도입g C2C12 마우스 근육 아세포

주 : adenofection 프로토콜도 분화를 진행하기 어려운 감염시킬 마우스 C2C12 근육 아세포에 적용 가능하다.

1. 플라스틱 판 또는 원하는 기판 상에 성장 배지에서 35mm 배양 접시에 2 × ¹⁰⁵ C2C12 세포.
   참고 : 세포 분화는 gelatine- 또는 마트 리겔 코팅 요리에 개선된다. 바이러스 형질 도입 이전에 세포 수를 결정하기 위해 하나의 부가 플레이트를 계획한다.
2. 다음 날, 세포가 포화 상태의 80 %에 도달해야합니다. 따뜻한 PBS로 두 번 세포를 씻어 분화 배지 (DM) 2 ㎖를 첨가하여 근원 세포의 분화를 유도한다.
3. 다음 날, 분화 1 일 (D1)으로 분류하여, 살아있는 세포의 액틴 세포 골격을 시각화하는 아데노 바이러스 LifeAct-TagGFP2와 근육 세포를 형질 도입. 3.2에 기재된 바와 같이 추가 플레이트에서 세포 수를 계산. 시험 5 LifeAct-TagGFP2 아데노 바이러스의 PFU / 셀 45 PFU / 셀 AdLacZ을 계산PLE는 표 1에 기재된. 총 바이러스 량이 50 PFU / 세포이다. ¹⁴ 바와 같은 바이러스를 사용 하였다
4. 각 조건에 대한 멸균 후드에서 1.5 ML의 플라스틱 튜브를 준비하고 따뜻한 DM 400 μl를 추가합니다.
5. , 피펫 팅의 오차를 최소화하기 위해 볼륨을 초과 한 μL 피펫을 위해 바이러스 스톡을 희석 필요한 경우 얼음에 서서히 바이러스 분취 액을 해동하고.
6. 400 μL의 DM을 포함하는 각 1.5 ml의 플라스틱 튜브에 조건에 따라 바이러스 입자의 적절한 금액을 추가하고 피펫으로 가볍게 섞는다. 활동을 유지하는 즉시 다시 -80 ° C에서 바이러스 주식을 놓습니다.
7. 요리에서 매체를 대기음 부드럽게 바이러스 믹스 드롭 현명한 피펫. 37 ° C, 5 % CO _2에서 인큐베이션하고 세포를 웰 바이러스와 세포를 포함하는 1 시간의 총 멸균 후드 신중 각각 15 분 동안 플레이트를 교반.
8. 배양 후, 부드럽게 각각의 접시에 1.6 ml의 DM을 피펫하고 i를 계속37 ℃에서 추가로 2 시간 동안 ncubation, 5 % CO _2.
9. 한편, CAPI의 형질 전환 방법에 따라 빈 형질 믹스를 준비합니다. 각 조건에 대한 200 μl의 혼합을 계산합니다. 400 ㎕를 혼합의 전체 볼륨에 대해 다음 예제를 사용합니다.
   1. 1.5 ml의 플라스틱 튜브에 피펫 50 ㎕의 1 M _CaCl2를 150 ㎕의 멸균 수로 H ₂ O 및 텍싱하여 혼합한다. 빠른 스핀 후, 드롭 현명한 200 μL HBS2x (280 mM의 염화나트륨, 50 mM의 HEPES, 1.5 mM의 나 ₂ HPO _4, pH가 7.01-7.05)을 조심스럽게 추가합니다. 부드럽게 200 μL 피펫을 사용하여 공기 주입에 의해 세 번 섞는다.
10. RT에서 30 분 동안 혼합을 부화. 드롭 현명한 형질 믹스 200 μl를 각 판에 천천히 추가하고 상호 지혜를 선동. 16 시간 동안 37 ℃로, 5 % CO _2의 접시를 전송합니다.
11. 다음 날, 2 ml의 따뜻한 HEPES (6.7 밀리미터의 KCl, 150 mM의 염화나트륨, 10 mM의 HEPES, pH를 7.3)로 두 번 세포를 씻어 2 ML의 DM을 추가합니다. infe을 시각화ction의 20-40X (공기)의 배율에서 거꾸로 형광 현미경의 효율성과 문서를 모두 형광 및 전송 채널의 상태에 따라 세 가지 대표 이미지를 수집.
12. 원하는 실험 설정에 따라 며칠 동안 myotubes로 차별화를 따릅니다. 세포를 고정하고이어서 행할 수 면역 분석 또는 살아있는 세포 영상 검사를 실시 할 수있다.

결과

양이온 성 지질을 사용하여 BAG3-GFP 플라스미드 DNA의 형질이 HeLa 세포에서 이종 발현과 관련이 매우 높은 BAG3 수준을 (그림 2A)를 베어링 거의 검출 단백질의 수준 등을 보여주는 몇 가지 세포. 이러한 세포에서 단백질 항상성의 손실은 핵 주변 집계 (그림 2A, 화살표)에 BAG3-GFP의 축적에 의해 입증되었다. 반면, BAG3-GFP를 운반하는 아데노 바이러스와 ?...

토론

여기서는 화학량 론 및 단백질 복합체 및 거대 구조 역학에 영향을 미치는 단백질의 과발현에 특히 민감한 세포 생물학적 과정의 기능적 분석에 적용 가능하다 플리 구조 실험이 수행 될 수 있도록하는 방법을 설명했다. 유사 분열 세포 분열은 세포의 전체 구조에서 가장 극적이고 아름다운 변화를 포함 미세 조정 세포 morphodynamics의 극단적 인 예입니다. 세포 이미징을위한 굴지 및 tubulin의 마커?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
C2C12 Mouse Myoblasts	ATCC	CRL-1772
Adenovirus custom design	Welgen	Custom design
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose	Thermo Fisher	11965-092
EDTA	Sigma	E5134
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
Fibronectin	Sigma	F1141
Glass bottom dishes, 35mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada		Klebig C et al. 2009
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
Horse Serum, New Zealand	Thermo Fisher	16050-122
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher	13778-150
Minimal Essential Medium  (MEM) Alpha	Wisent	310-101-CL
Minimal Essential Medium  (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides	Thermo Fisher	12000-022
Minimal Essential Medium  (MEM) Alpha without Phenol Red	Thermo Fisher	41061-029
Na2HPO4	Biobasic	S0404
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
OptiMEM	Thermo Fisher	11058-021
rAVCMV-LifeAct-TagGFP2	IBIDI	60121
siRNA duplexes	Dharmacon	Custom design
Thymidine	Sigma	T9250
Trypsine 2.5%	Thermo Fisher	15090-046