Adenofection: tükenmesi-Kurtarma Experiments Hücresel Morphodynamics Moleküler şaperonlar Rolü incelenmesi için Bir Yöntem

Özet

We describe a method for depletion-rescue experiments that preserves cellular integrity and protein homeostasis. Adenofection enables functional analyses of proteins within biological processes that rely on finely tuned actin-based dynamics, such as mitotic cell division and myogenesis, at the single-cell level.

Özet

Böyle mitoz ve hücre farklılaşması gibi hücresel süreçleri büyük ölçüde hücre iskelet yapılarının doğru yeniden güvenmek hücre şekli değişiklikleri ile yönetilmektedir. Bu, belirli bir zaman ve yerde daha yüksek dereceden moleküler yapıların bağlanma-çözülme, proteinlerin aşırı ifadesi ile neden olduğu düzensizlikler, özellikle hassas olan bir işlemi içerir. yakın--normal hücre morfolojisi, protein homeostazını koruyan ve korumak yöntemler hücresel süreçlerin çeşitli ilgi konusu bir proteinin fonksiyonel katkı belirlenmesi yüksek ölçüde istenebilecektir. RNA müdahalesi dayalı geçici baskılanma-kurtarma deneyleri, protein fonksiyonları ve yapısal gereksinimlerini analiz güçlü yaklaşımlardır. Ancak, fizyolojik seviyesinden en az sapma ile hedef proteinin reintroduction gerçek bir mücadeledir. Burada moleküler şaperonlar rolünü incelemek için geliştirilmiş bir yöntem olarak adlandırılan adenofection açıklayan bird bölünen hücrelerin normal çalışma ortakları ve aktin biçimlenme ile ilişkisi. HeLa hücreleri siRNA dubleksler 3'UTR bölgeyi hedefliyor ile BAG3 tükenmiş bulundu. GFP etiketli BAG3 proteinleri transfeksiyon reaktifleri bağlanmış rekombinant adenovirüsler kullanarak hücrelerin>% 75 içine eş zamanlı olarak yeniden dahil edilmiştir. Adenofection stres yanıt verilmemesi halinde, BAG3 yoksun HeLa hücrelerinde yakın fizyolojik seviyede BAG3 GFP proteinleri ifade etmek için etkin. Etkisiz endojen ısı şoklu protein şaperonlar protein homeostazı ana stresle uyarılabilir düzenleyiciler düzeyde gözlenmiştir. Ayrıca, hücre iletimi-transfeksiyon sırasında floresan belirteçlerin ifadesini süren bakulovirüsleri ekleyerek, biz time-lapse mikroskobik tarafından mitotik hücre dinamiklerini incelemek olabilir, normal mitotik ilerlemesi minimum pertürbasyon ile analiz eder. Adenofection myoblast fark fonksiyonel analiz için zor enfekte fare hücreleri de uygulanabilir ve uygunmyotubes farklılık yaratmak. Böylece adenofection yapı-fonksiyon üst düzey iskelet dinamikleri güveniyor hassas biyolojik süreçlerde yer proteinlerin analizi gerçekleştirmek için çok yönlü bir yöntem sağlar.

Giriş

Memeli hücrelerinde gen ifadesinin fonksiyonel inaktivasyonu proteinlerin fonksiyonları incelemek için altın standarttır. Yeni tür Çinko parmak nükleazlara gibi site-spesifik nükleazların kullanımına dayanan genom düzenleme teknolojileri geliştirmiş ve kümelenmiş düzenli interspaced kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) / CAS9 şimdi hedeflenen gen silme ve mutasyon ^1,2 ile hücre hatlarının üretilmesini sağlar. Bu yeni yaklaşımlar biz protein fonksiyonu ve insan hastalıklarının genetik anlayışımızı okuyan yol devrim olmalıdır. Bazı durumlarda ise, uzun vadeli veya tam gen nakavt arzu edilmez ve sekonder hücre telafi mekanizmaları provoke edebilir. Genetik olarak tadil edilmiş hücre çizgilerinin üretimi de sınırlı bir proliferasyon kapasitesi, ya da farklı hücre tiplerinde mutasyonların büyük bir set tarama aranan primer hücre kültürleri ile uğraşırken sınırlayıcı olabilir. Bu genellikle, bir hücre b bağımlılığı belirlemek için gereklidirbir proteinin yapısal gereksinimleri malarla proses. Bu amaçla, çeşitli hücresel geçmişleri geçici tükenmesi-kurtarma deneyleri sağlayan RNA müdahalesi ile geri dönüşümlü demonte hala yapı-işlev ilgi ^3'ün bir protein analizleri gerçekleştirmek için basit ve güçlü bir yaklaşım olmaya devam etmektedir. Ancak, bu yaklaşımın önemli bir dezavantajı zorluk verimli susturulması elde etmek ve hücre popülasyonunun bir çoğunluğu yakın fizyolojik düzeyde ilgi ya da türevleri protein reintroduce etmektir. Bu protein-protein etkileşimleri ile ilgili, örneğin hücre popülasyonu bazlı deneylerde görülen, tek hücreler (hypomorphic fenotipi) seviyesinde görülen işlevsel etkileri ilişkili girişimi kapsamlı çalışmalar sağlamak için çok önemlidir.

Klasik transfeksiyon yöntemleri kullanarak, bir güçlükle hücrelerin büyük bir nüfus eksojen proteinlerin homojen ve düşük ifadesini elde edebilirsiniz. Rekombinant virüs hücrelerin İletimiadenovirüsler gibi genellikle eksojen proteinin daha normal ifadesini sağlar. Bununla birlikte, adenovirüs alımı insan olmayan hücrelerde mevcut değildir veya sadece zayıf bir insan hücre tiplerinde ifade edilir ARAÇ reseptörü ile sınırlıdır. Ayrıca, adenovirüsler hücreye girişi hücre şekli ve yapışma ^4-6 düzenleyen sinyal yollarının aktive eder. Hücre morphodynamics düzenleyici mekanizmaları okuyan bu besbelli istenmemektedir. Biz hücre bölünmesi ve aktin dinamikleri, bir koruyucuya kompleksi, BAG3-HSPB8 fonksiyonel analizleri üstlendi zaman biz bu sorunlu bakan. Öncü iş stresi ^7,8 sırasında protein kalite kontrol ve otofaji bu hastabakıcı kompleksi için bir rol tarif etmişti. Bu çalışmaların çoğu, ancak, chaperones normalde stres sırasında düzenlenen varsayarak, protein aşırı ekspresyonu dayanıyordu. Bu HSPB8 ile kompleks içinde, ister BAG3 sorusunu açık bıraktı, th ifade bölünen hücrelerin normal çalışmasına katkıda bulunabilirBirçok kanser hücre tipleri ⁹ gibi ese şaperonlar. Özellikle, hastabakıcı kompleksi HspB'dir şaperonlar ve iskelet dinamikleri ¹⁰ arasında ortaya çıkan bağlantıları verilen büyük ilgi oldu mitoz ilerlemesini kontrol aktin-tabanlı yapıların yeniden bir katkısı olup olmadığını. Bu sorunu gidermek için, biz mitoz ilerlemesi veya hücresel morfoloji müdahale olmaz ve hücre şekil değişiklikleri düzenleyen makromoleküler kompleksleri dinamikleri ikincil pertürbasyon önlemek için, protein homeostazisini korumak hangi tükenmesi-kurtarma deneyler için etkili bir yöntem geliştirmeyi aramaktadır . Bu nedenle, ideal olarak söz konusu genin tükenmesi ekleyin geri eş zamanlı olarak yapılmalıdır.

Bir katyonik polimer veya lipidler ile adenovirüs komplekslerinin kullanımı, in vitro ve in vivo ^11,12 gen transferini teşvik etmek için tarif edilmiştir. Örneğin, kalsiyum fosfat (Capi) sahip bir çökelti oluşturmak için görünürBir CAR-bağımsız yolunun ¹³ üzerinden virüs bağlayıcı girişi geliştirmek adenovirüs. Gerçekten de, katyonik bileşikler ile adenovirüs bazlı hücre transdüksiyonu ve transfeksiyon birleştiren tükenmesi kurtarma deneyler etkinliğini arttırabildiği bulunmuştur. Bu çoğunda yakınındaki endojen seviyelerde ekzojen proteinlerin ekspresyonunu ayarlamak için daha geniş bir pencere hücre hattı ve ilgi dahilindeki gen ve yarar bağlı olarak, US 20-kat 3- virüsün miktarını düşürmek için izin hücresel morfoloji üzerinde asgari etki ile ilgi bir hücre popülasyonunun. Bu koşullar altında, daha da endojen protein ekspresyonu (>% 75) yüksek verimli demonte elde edebiliriz. Biz burada fizyolojik ro fonksiyonel analizler için yöntem uygun hale adım yöntem adım tarif ve Isı Şoku Protein ailesinin stres kaynaklı chaperones değişmeden seviyeleri ile değerlendirilen protein homeostazı önemli ölçüde tedirgin olmadığını kanıttime-lapse video mikroskobu ile moleküler şaperonlar le. Protokol hücre senkronizasyon prosedürlere ve mitotik ilerlemesi sırasında, normal aktin bazlı ve mil dinamikleriyle en az müdahale ile flüoresan işaretlerin düşük seviyelerde, ko-ekspresyonu için ticari olarak temin edilebilir bakulovirüslerin kullanımı elverişlidir. Biz daha in vitro myotubes myoblast farklılaşma üzerinde önemli bir etkiye sahip fare C2C12 hücreleri, "uyum sağlamak zor" uygulanabilir yöntem çok yönlülüğünü gösteriyor.

Protokol

Orta ve Çözümleri 1. Hazırlama (bütün steril süzülmüş)

1. C2C12 fare kas hücreleri (farklılaşma çalışmaları)
   1. C2C12 hücre kültür bakım için büyüme ortamı 500 ml hazırlanması:% 10 FBS ve 2 mM L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM yüksek glikoz ihtiva eder.
   2. C2C12 farklılaşması için 100 mi farklılaştırma ortamı (DM) hazırlayın:% 2 at serumu ile desteklenmiş DMEM yüksek glikoz ihtiva eder.
2. HeLa hücreleri (mitotik hücrelerde çalışmaları)
   1. Hazırlama 500 mi αMEM HeLa RFP H2B hücre kültür bakım ve deneyler için:% 10 FBS ve 2 mM L-Glutamin ^{(αMEM% 10)} ile takviye edilmiş αMEM.
   2. HeLa RFP H2B hücre senkronizasyonu için (deoksiribonükleositler / ribonükleositlerin olmadan) 500 mi αMEM eksi hazırlanması:% 10 FBS ve 2 mM L-glutamin (αMEM ^{eksi% 10)} ile takviye edilmiş αMEM eksi.
   3. HeLa-RFP-H2B l Fenol Kırmızısı olmadan 20 ml αMEM hazırlayınive hücre elde etme: αMEM fenol kırmızısı olmaksızın,% 10 FBS ve 2 mM L-glutamin ile takviye edilmiştir.
   4. 100 mM timidin hazırlayın: vorteks ile 37 ° C 'de, 1 _{ml, H2O} 24.2 mg çözülür. Filtre sterilize ve 4 ° C'de tutun.
3. ortak çözümler
   1. % 0.05 tripsin / EDTA Hazırlama:% 0.05 tripsin, 0.625 mM EDTA 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içinde. Filtre ile sterilize ve mağaza alikotları -20 ° C'de ilave edildi. Bir kez, 4 ° C'de kısım tutmak çözülmüş.
   2. HBS2x hazırlayın: 280 mM NaCI, 50 mM HEPES, 1.5 mM Na ₂ HPO _4. 10 N NaOH ile pH tam arasındaki 7,01-7,05 ayarlayın. steril filtre edildi ve 4 ° C'de tutun.

HeLa-RFP-H2B Hücrelerinin FİBRONEKTİN ve Kaplama ile Hücre Kültürü Plakaların 2. Kaplama

NOT: Deneyden önce, her manipülatör varyasyonları OC olabilir çünkü hücrelerin uygun bir yoğunluğu elde etmek için optimum hücre kaplama koşulları kurmak gerekirHer manipülatör ve her biri farklı hücre çizgisi arasındaki cur.

1. Deneyden bir gün önce, onlar kaplama gününde büyüme üstel faz içinde olduğundan emin olmak için HeLa-RFP H2B hücreleri genişletin. % 80 birleşen 1x10 cm plaka itibaren 10 cm plakalar 2 ardışık 1/3 dilüsyonları olun.
   NOT: deney için plakaların sayısını planlayın. çiftleri, protein kısa süreli canlı hücre görüntüleme için diğeri Western Blot analizi ile demonte ve eksojen protein ifade etkinliğini belirlemek için ayıklar her koşul hesaplayın. Virüs transdüksiyon öncesinde hücre sayısını belirlemek için bir ek plaka planlayın.
2. 10 ug / ml fibronektin ile, kaplama kat cam alt yemekleri hücre önce. Hem de tüm yüzeyini kaplayan ve 37 ° C'de,% 5 _CO2 seviyesinde 1 saat boyunca inkübasyona 1 mg / ml fibronektin (steril 1 x PBS içinde seyreltilmiş) 35 mm başına çanağı 100 seyreltme: 1 ile 1 ml ilave edilir.
3. İnkübasyon sırasında, ön-sıcak αMEM Wi takviye37 ° C'de% 10 FBS ^{(αMEM% 10)} ve% 0.05 tripsin / EDTA Th.
4. inkübasyon 45 dakika sonra, hücre çözeltisinin hazırlanması başlar. steril bir muhafaza içinde, 10 cm plaka ortamı aspire 1.5 mi% 0.05 tripsin / EDTA ile iki defa hafifçe durulama ve son aspirasyon tripsin / EDTA 0.5 ml bırakın.
5. 37 ° C'de 2-3 dakika boyunca inkübe hücreleri,% 5 _CO2. nazikçe mikroskop altında plaka ve gözlem dokunarak, tüm hücreler müstakil doğrulayın. Hücreleri ayırmak için ^{αMEM% 10} ve pipet yavaşça birkaç kez 10 ml. bir hemositometre kullanılarak, hücre süspansiyonunun bir 10 ul örnek sayısı.
6. cam alt yemekleri aspire fibronektin çözüm. fibronektin hücre kaplama önce kurumasına izin vermeyin.
7. Plaka 1.5x10 ⁵ 2 ml ^{αMEM% 10} 35 mm tabak başına hücre ve 37 ° C'de,% 5 _CO2 inkübe edilir. Hücreler, SEPA olduğu mikroskop altında 30-45 dakika sonra doğrulamabunlar plakasının merkezinde birikme eğilimi olduğundan, nominal.
8. Gerekirse, hücreleri yeniden dağıtmak için hafifçe çapraz bilge plakaları çalkalayın. Virüs transdüksiyon öncesinde hücre sayısını saymak için koşulların sayısına ilave plaka bir 35 mm levha.
9. en az% 50 değerinde bir hücre yoğunluğu elde etmek için bir sonraki güne kadar hücreleri büyütün. Hücre yoğunluğu, virüs transdüksiyon verimliliği önemli bir azalma daha düşük% 50 sonuç, hücre başına protein ekspresyonu varyasyonları artış ve hücre toksisitesinin artmıştır.
   NOT: fibronektin cam yemekleri Kaplama hücre büyümesini ve morfolojisi artırır ve mitoz yoluyla hücrelerin düzgün ilerlemesini teşvik eder. Bu genellikle daha ucuzdur ticari olarak temin edilebilir jelatin ile ikame edilmiş olabilir.

3. Adenovirüs İletimi ve CAPI çökeltileri kullanma HeLa-RFP-H2B Hücreleri siRNA Transfeksiyon tarafından devirme Endojen protein

Dikkat! Çalışmavirüslerle ing özel önlemler ve virüs ile temas halinde olmuştur tüm materyalin uygun bertaraf edilmelidir.

Dikkat! Bizim ellerde, CAPI sık sık (örneğin, otofaji) vezikül kaçakçılığı biyolojik süreçler üzerinde örneğin, daha fazla istenmeyen etkilere sahip çöker. Buna göre, (aşağıya bakınız) ve analizler yapılmadan önce en az 48 saat beklemek bir katyonik lipid transfeksiyon reaktifi kullanılması tavsiye edilir.

Not: ilişkisiz bir gen (örneğin, LacZ) ya da herhangi bir geni taşıyan bir kontrol adenovirüs ilgili geni taşıyan rekombinant adenovirüsün en miktarda kullanarak, tüm Adenofections minimal MOI (10-20 PFU / hücre) ulaşmak için kullanılır.

Not: Bu işlem büyük bir hücre popülasyonunda hücre başına normalize ifade yardımcı gösterilmiştir.

1. Bir gün hücre sonra kaplama, ek kaplama çanak hücrelerin sayısını. orta aspire ve1 mi,% 0.05 tripsin / EDTA ile bir kez yıkayın. % 0.05 tripsin / EDTA daha 1 ml ilave edilir ve tüm hücreler müstakil kadar 37 ° C,% 5 _CO2 inkübe edilir. iyi bir 1ml pipet kullanarak hücrelerin ayırın ve bir hemositometre kullanılarak ml başına hücre sayısını saymak.
2. Enfeksiyon çokluğu hücre başına (POI) proteinin 2 plak oluşturucu birim (pfu) ve boş vektör hücre başına 18 PFU'nun (MOI) hücreleri nakletmek için gerekli virüs miktarı belirlemek (ör LacZ) hücre başına 20 PFU'nun toplam sahip. Aynı zamanda her bir bakülovirüs (aktin ve αTubulin, GFP ve RFP-etiketli, sırasıyla) 4 PFU transdüksiyonu. Aşağıdaki adenofection protokolü kullanarak hücrelerin transdüksiyonu. Fuchs ve diğerleri de tarif edildiği gibi virüsler kullanılmıştır. ¹⁴
3. Her durum için, steril bir başlık içindeki bir 1.5 ml'lik plastik tüp hazırlanır ve sıcak αMEM ^{eksi% 10} 400 ul ekle.
4. Gerekirse t, seyreltik, buz üzerinde yavaş virüsler bir kısım çözülme vepipetleme hataları en aza indirmek için bir sesini 1'den büyük ul pipetlemeyin için o virüs stoku.
5. 400 ul ^{αMEM-eksi% 10} içeren her 1.5 ml plastik tüp koşulu başına hesaplanan virüs miktarını ekleyin ve pipetleme hafifçe karıştırın. faaliyetini tutmak için hemen geri -80 ° C'de virüs stok yerleştirin.
6. hücrelerden orta aspire ve yavaşça virüs karışımı damla damla pipetle. 37 ° C'de,% 5 _CO2 de hücreleri inkübe ve de virüs hücreleri kapsayacak şekilde 1 saat boyunca steril başlık altında dikkatli bir şekilde, her 15 dakikada bir tabak çalkalayın. ortamın bir miktar kullanılarak hücrelerin virüsün teması kolaylaştırır.
7. İnkübasyondan sonra, yavaşça, 2 ml 'lik bir toplam hacim elde etmek için her plakaya 1.6 ml αMEM ^{eksi% 10} pipetle 2 mM timidin eklenerek hücre senkronizasyonu başlar ve 37 ° C,% 5 _CO2 seviyesinde ilave bir 2 saat daha hücrelerin inkübe .
8. Bu arada, siRNA transfeksiyon karışımı followi hazırlanmasıCapi transfeksiyon yöntemi ng (Şekil 1). Resim siRNA gerekli ise, boş bir transfeksiyon gerçekleştirmek için, steril su ile siRNA'nın miktarının yerini.
9. kopya 400 ul ile sonuçlanan, her durum için, 200 ul karışımı hesaplayın. Aşağıdaki Örnek 50 nM nihai siRNA konsantrasyon için verilir ve ilgi her protein için adapte edilmesi gerekmektedir. 1.5 ml plastik tüp içinde, 139 | il steril _H2O içine pipetle 50 ul 1 M _CaCl2 ve ul 20 uM 11 siRNA ve vorteks ile karıştırın. Hızlı bir dönüş sonrası, damla damla 200 ul HBS2x (280 mM NaCI, 50 mM HEPES, 1.5 mM Na ₂ HPO _4, pH 7,01-7,05) dikkatli ekleyin.
   Not: küçük küçük damlalar iyi transfeksiyon verimi ile sonuçlanır çökeltiler bulunmaktadır. Yavaşça 200 ul-pipet kullanılarak hava enjeksiyonu ile üç kez karıştırılır.
10. Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile bir karışım inkübe edin. damla damla yavaşça ekle transfeksiyon karışımı 200 ul her plaka veenlemesine çalkalayın. 16 saat 37 ° C'de,% 5 _CO2 plakalar aktarın.
11. Bir sonraki gün, 2 mi, sıcak HEPES (6.7 mM KCI, 150 mM NaCI, 10 mM HEPES, pH 7.3) ile iki kez hücreleri yıkayın ve ¹⁰ 2 mi αMEM ^eksi% ekleyin. sıcaklık değişimleri hücre döngüsü uzunluğunu etkileyebilir çünkü her seferinde en fazla dört hücre plakaları ile devam etmeyin.
12. 20-40x (hava) bir büyütmede bir ters flüoresan mikroskop altında enfeksiyon etkinliğini görselleştirme ve dokümantasyon için hem fluoresan hem de iletim kanallarında durum için üç Örnek görüntüler elde. Yedi gün sonra, 37 ° C'de,% 5 _CO2 seviyesinde ilave bir 16 saat boyunca 2 mM timidin ekleme ve inkübe edilir.
13. Ertesi gün, siRNA transfeksiyon ve virüs enfeksiyonu 48 saat sonra, 2 ml ılık fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile iki kez hücreleri yıkayın ve canlı hücre görüntüleme için veya fenol / o fenol kırmızı w 2 mi ^{αMEM% 10} 7 saat bırakın protein ekstraksiyonu için kırmızı.
14. Protein ekstrelerinin hazırlanması, Batı benek analizi için, her bir durum 48 saat sonra-transfeksiyon için Hasat hücreleri demonte etkinliğini ve endojen protein ¹⁵ ekspresyonunu belirlemek için.
    NOT: ilgi protein yanı sıra yükleme kontrolleri olarak hizmet veren, uygun antikorlar karşı antikorlar kullanın. Nakavt etkinliği bir titrasyon eğrisini sağlar (kontrol siRNA ile transfekte edilmiş) kontrol hücre lizatları azalan miktarlarda yükleme belirlenir (yani, 1, ½ ¼ ⅛).

Bir Katyonik Lipid Transfeksiyon Reaktif Kullanımı HeLa Hücrelerinde siRNA Transfeksiyon tarafından demonte 4. Adenovirüs İletimi ve Endojen Protein

NOT: Burada hücre senkronizasyonu içermeyen deneyler için uyarlanmış bir protokol mevcut ve / siRNA transfeksiyon capi yöntemiyle yapılamaz zaman, örneğin bazı hücrede lin istenmeyen toksik etkilerden kaçınmak için ya daes. Bu protokol, aynı zamanda, uygun bir hücre yoğunluğunda çalışmak için adenofection sonra hücre şarjı adımını içerir. Biz sadece katyonik lipid transfeksiyon reaktifi test ettik.

Dikkat! Virüsler ile çalışma özel önlemler ve virüs ile temas halinde olmuştur tüm materyalin uygun bertaraf edilmelidir.

1. Plaka 1.75 x 10 ⁵ 2.5 mi ^{αMEM% 10} 35 mm tabak başına hücre ve 37 ° C'de inkübe,% 5 _CO2. Virüs transdüksiyon öncesinde hücre sayısını saymak için koşulların sayısına ilave plaka bir 35 mm levha.
2. en az% 50 değerinde bir hücre yoğunluğu elde etmek için bir sonraki güne kadar hücreleri büyütün. Virüs transdüksiyon verimliliği önemli bir azalma en az% 50 sonuçlarının bir hücre yoğunluğu, hücre başına protein ekspresyonu varyasyonları artış ve hücre toksisitesinin artmıştır.
3. Bir gün hücre sonra kaplama, ek kaplama çanak hücrelerin sayısını. solukluortam 1 ml% 0.05 tripsin / EDTA ile bir kez yıkayın ve. % 0.05 tripsin / EDTA daha 1 ml ilave edilir ve tüm hücreler müstakil kadar 37 ° C,% 5 _CO2 inkübe edilir. Ayrı hücreler, 1 ml pipet kullanılarak ve ml başına hücre sayısı.
4. Örneğin (enfeksiyon çokluğu hücre başına (POI) proteinin 20-40 plak oluşturucu birim (pfu) ve boş vektör hücre başına 0-20 PFU (MOI) transdüksiyonu için gerekli virüs miktarı belirlemek, LacZ) hücre başına 40 PFU'nun toplam sahip.
5. Her durum için, steril bir başlık içindeki bir 1.5 ml'lik plastik tüp hazırlanır ve sıcak ^{αMEM% 10} 400 ul ekle.
6. , Pipetleme hataları en aza indirmek için bir sesini 1'den büyük ul pipetlemeyin için virüs stoku sulandırmak gerekirse, buz üzerinde yavaş yavaş virüslerin bir kısım Çözülme ve.
7. 400 ul ^{αMEM% 10} içeren her 1.5 ml plastik tüp koşulu başına hesaplanan virüs miktarını ekleyin ve pipetleme hafifçe karıştırın. Yeri inciHemen geri -80 ° C'de e virüs stok faaliyetlerini tutmak için.
8. hücrelerden orta aspire ve yavaşça virüs karışımı damla damla pipetle. 37 ° C'de,% 5 _CO2 de hücreleri inkübe ve de virüs seyreltme hücreleri kapsayan, 1 saat boyunca steril başlık altında dikkatli bir şekilde, her 15 dakikada bir tabak çalkalayın. ortamın bir miktar kullanılarak hücrelerin virüsün teması kolaylaştırır.
9. Bu arada, transfeksiyon yöntemi izlenerek siRNA transfeksiyon karışımı hazırlayın. Resim siRNA gerekli ise, boş bir transfeksiyon gerçekleştirmek için serumsuz aracı madde ile siRNA'nın miktarının yerini.
   1. Aşağıdaki Örnek 50 nM nihai siRNA konsantrasyon için verilir ve ilgi her protein için adapte edilmesi gerekmektedir. Her adenofection için, serum olmadan 150 ul ortamda (örneğin, 6.25 ul 20 uM SiRNA + serum olmadan 144 ul orta) ve bir 1.5 ml plastik tüp containi 416 nM siRNA içeren bir 1.5 ml plastik tüp hazırlamakserumsuz ng 6.25 ul katyonik lipid transfeksiyon reaktifi + 144 ul ortam.
   2. yukarı pipetleme ve 200 ul pipet ile birkaç kez aşağı her plastik tüp içeriği karıştırın. Her iki tüpe içeriğini birleştirin ve yukarı pipetleme ve 200 ul pipet ile birkaç kez aşağı karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
10. Virüs ile inkübe edildikten sonra, yavaşça 2.2 ml toplam hacim elde etmek için her plakaya 1.8 ml ^{αMEM% 10} pipetle hemen damla damla siRNA transfeksiyon karışımı her plaka yavaş yavaş ve enlemesine çalkalayın. 24 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 _CO2 plakalar aktarın.
11. Sonraki gün, yeniden plaka 37 ° C'de ilave bir 24 saat boyunca 2.5 mi ^{αMEM% 10} dört yeni 35 mm tabak içine, her 35 mm levha gelen hücreler her ve inkübe,% 5 _CO2.
12. Sonraki gün, siRNA transfeksiyon ve virüs enfeksiyonu, hazırlanması için, her durum için bir plaka hasat hücrelerinin 48 saat sonraprotein özleri ve Western blot analizi, demonte etkinliğini ve endojen protein ¹⁵ ekspresyonunu belirlemek için.
    Not: Kalan plakaları ile, hücrenin sabit devam tercih protokolü kullanılarak ve ilgi ¹⁴ antikorları ile immünofloresan analiz için numune maruz.

Mitotik Hücre ve Veri Analizi 5. Canlı Hücre Görüntüleme

1. Bir / 5 nemlendirilmiş% CO ₂ / termo-regüle odası ile donatılmış bir inverted mikroskop ile mitotik hücreler üzerinde kısa vadeli canlı hücre görüntüleme deneyleri.
   NOT: Bu çalışmada, dönen bir disk konfokal mikroskop (40X, 0.75 NA) kullanıldı, bir EMCCD ile donatılmış -50 ° C'de şarj çiftli kamera soğutuldu.
2. alımı öncesinde, bölme 37 ° C uygun sıcaklığa ulaştığını doğrulayın.
   NOT: Bu mikroskobik sistemine bağlı olarak birkaç saat sürebilir.
3. MICR kültür yemekleri yerleştirinOscope odası edinme önce 1 saat orta uygun dengeyi sağlamak ve sıcaklık değişikliklerine bağlı olarak sürüklenen odak önlemek için. hücrelerin mitoz durumunu izleyin. Bu noktada, hücreler% 10-15 mitoz (profaz-prometafaz) erken aşamalarında olmalıdır.
4. Önceki deneylerde tespit edildiği üzere bir dengeleme sırasında, alıcı parametrelerini ayarlamak. Tipik olarak,% 100'lük bir lazer yoğunluğu ve 121-130 hassasiyet ile 0,2-3 sn iki kanal (488 ve 594) için bir maruziyet süresi bizim elimizde uygun parametrelerdir.
   NOT: İlk testler hücre hasarları neden olur ve mitoz ilerlemesini bozan asgari photobleaching uygun bir çözünürlük neden asgari lazer yoğunluğu ve satın alma zamanı / aralığını belirlemek için yapılmalıdır.
5. iktisap aralığını aşmadan analiz etmek için hücrelerin önemli sayıda elde etmek için koşul başına birkaç alanları seçin. Tipik bir kurulum içinde olacak bir dönen disk konfokal sistemi kullanarakDört farklı koşullar, plaka başına 7 alanları ve 75 dakika-bir süre boyunca 1.5-2 dakika arayla 2 renk kanallarını (488 ve 594) ihtimal.
6. mitotik girişinde olan hücreler, bir kez tüm alanları seçilmiştir odağı yeniden ayarlamak ve mümkün olduğunca hızlı alımı başlatabilirsiniz seçin.
7. en az üç kez puan için sistemin istikrarı izlenmesi ve gerekirse odak erme.
8. 75 dakika ilk kısa süreli canlı hücre görüntüleme sonra mitotik hücre yeni alanlar hücreleri analiz edilen sayısını artırmak için film ikinci bir dizi elde etmek için seçilebilir.
9. floresan belirteçler bağlıdır hücrelerin mitoz fenotipleri, kullanılan analiz etmek iyi tanımlanmış kriterleri belirleyin. Mitoz kusurlar ¹⁴ blebbing, kromozom hiza, iğ sallanan ve korteks (nükleer anafaz kadar yıkımı) mitoz harcanan zaman uzamış içerebilir.

Differentiatin 6. LifeAct-TagGFP2 Adenovirüs İletimig C2C12 Fare miyoblastları

NOT: adenofection protokolü de farklılaşma geçiren zor enfekte fare C2C12 iskelet hücreleri uygulanabilir.

1. Plaka plastik ya da tercih edilen bir alt-tabaka üzerine büyüme ortamında 35 mm kültür çanakları 2 x 10 ⁵ C2C12 hücreleri.
   Not: Hücre farklılaşması gelatine- ya Matrigel kaplı kaplar üzerinde geliştirilmiştir. Virüs transdüksiyon öncesinde hücre sayısını belirlemek için bir ek plaka planlayın.
2. Sonraki gün, hücreler birleşecek% 80 ulaşmış olmalıdır. sıcak PBS ile iki kez hücreleri yıkanması ve farklılaşma ortamında (DM) 2 ml ekleyerek miyoblast farklılaşma neden.
3. Ertesi gün, farklılaşma gün 1 (D1) olarak etiketlenmiş, canlı hücreleri aktin hücre iskeleti görselleştirmek için adenovirüs LifeAct-TagGFP2 ile miyositleri transduce. 3.2 altında açıklandığı gibi ek plaka hücre sayısını sayın. sınavı takip eden 5 LifeAct-TagGFP2 adenovirüs PFU / hücre ve 45 PFU / hücre AdLacZ hesaplayınPLE Tablo 1 'de tarif edilen. toplam virüs miktarı 50 PFU / hücre. ¹⁴ tarif edildiği gibi virüsler kullanılmıştır
4. Her durum için steril bir kaput içinde 1.5 ml plastik tüp hazırlayın ve sıcak DM 400 ul ekleyin.
5. , Pipetleme hataları en aza indirmek için bir sesini 1'den büyük ul pipetlemeyin için virüs stoku sulandırmak gerekirse, buz üzerinde yavaş yavaş virüslerin bir kısım Çözülme ve.
6. 400 ul DM içeren her 1.5 ml plastik tüp koşulu başına virüs parçacıklarının uygun miktarda ekleyin ve pipetleme hafifçe karıştırın. faaliyetini tutmak için hemen geri -80 ° C'de virüs stok yerleştirin.
7. yemekleri orta aspire ve yavaşça virüs karışımı damla damla pipetle. 37 ° C'de,% 5 _CO2 de hücreleri inkübe ve de virüs hücreleri kapsayacak şekilde 1 saat bir toplam steril bir başlık altında dikkatli bir şekilde, her 15 dakikada bir tabak çalkalayın.
8. inkübasyondan sonra, yavaşça her tabağa 1.6 ml DM pipet ve i devam37 ° C'de ilave bir 2 saat boyunca ncubation,% 5 _CO2.
9. Bu arada, Capi transfeksiyon yöntemi izlenerek boş transfeksiyon karışımı hazırlayın. Her durum için 200 ul karışımı hesaplayın. 400 ul karışımı toplam hacmi için, aşağıdaki örnek kullanın.
   1. 1.5 ml'lik plastik tüp, pipet 50 ul 1 M _CaCl2 150 içine ul steril _H2O ve vorteks ile karıştırın. Hızlı bir dönüş sonrası, damla damla 200 ul HBS2x (280 mM NaCI, 50 mM HEPES, 1.5 mM Na ₂ HPO _4, pH 7,01-7,05) dikkatli ekleyin. Yavaşça 200 ul pipet kullanarak hava enjeksiyonu ile üç kez karıştırın.
10. Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile bir karışım inkübe edin. damla damla transfeksiyon karışımı 200 ul her plaka yavaş yavaş ekleyin ve çapraz bilge çalkalayın. 16 saat 37 ° C'de,% 5 _CO2 plakalar aktarın.
11. Bir sonraki gün, 2 mi, sıcak HEPES (6.7 mM KCI, 150 mM NaCI, 10 mM HEPES, pH 7.3) ile iki kez hücreleri yıkayın ve 2 ml DM ekleyin. INFE görselleştirmekction 20-40X (hava) bir büyütmede bir ters flüoresan mikroskop altında verimlilik ve dokümantasyon için hem fluoresan hem de iletim kanallarında durum için üç Örnek görüntüler elde.
12. İstenilen deney kurulumuna bağlı olarak, birkaç gün boyunca myotubes farklılaşma izleyin. Hücreler, sabit ve daha sonra gerçekleştirilebilir immünoflüoresans analizi veya canlı hücre görüntüleme çalışmaları tabi tutulabilir.

Sonuçlar

Katyonik lipidler ile BAG3-gfp plazmit DNA'sı transfeksiyonu HeLa hücrelerinde heterojen ekspresyonu ile bağlantılı, çok yüksek BAG3 seviyeleri (Şekil 2A) taşıyan zor tespit protein seviyelerini ve diğerleri gösteren bazı hücreler. Bu hücrelerde protein homeostazı kaybı perinükleer agregatları (Şekil 2A, oklar) içine BAG3-GFP birikmesi ile kanıtlanmıştır. Bunun aksine, BAG3-GFP taşıyan adenovirüsler hücre transdüksiyonu ...

Tartışmalar

Burada, stokiyometri ve protein kompleksleri ve moleküler yapıların dinamiklerini etki proteinlerin aşın özellikle hassas olan hücre biyolojik süreçlerin işlevsel analizleri için de geçerlidir tükenmesi kurtarma deneyler için sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Mitoz hücre bölünmesi, bir hücrenin genel yapısı içinde en dramatik ve muhteşem değişiklikleri içeren ince ayarlı hücre morphodynamics aşırı bir örnektir. hücre görüntüleme için aktin ve tubulin belirteçlerin düşük am...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
C2C12 Mouse Myoblasts	ATCC	CRL-1772
Adenovirus custom design	Welgen	Custom design
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
CellLight® Actin-GFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10582
CellLight® Tubulin-RFP, BacMam 2.0	Thermo Fisher	C10614
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), High Glucose	Thermo Fisher	11965-092
EDTA	Sigma	E5134
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher	12483-020
Fibronectin	Sigma	F1141
Glass bottom dishes, 35mm	MatTek Corperation	P35G-1.5-20-C Case
HeLa-RFP-H2B	Kind gift of Dr Sabine Elowe, Québec, Canada		Klebig C et al. 2009
HEPES	Fisher Scientific	BP310-1
Horse Serum, New Zealand	Thermo Fisher	16050-122
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
L-Glutamine	Thermo Fisher	25030081
Lipofectamine® RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher	13778-150
Minimal Essential Medium  (MEM) Alpha	Wisent	310-101-CL
Minimal Essential Medium  (MEM) Alpha without Desoxyribonuleosides/Ribonucleosides	Thermo Fisher	12000-022
Minimal Essential Medium  (MEM) Alpha without Phenol Red	Thermo Fisher	41061-029
Na2HPO4	Biobasic	S0404
NaCl	Fisher Scientific	BP358-10
OptiMEM	Thermo Fisher	11058-021
rAVCMV-LifeAct-TagGFP2	IBIDI	60121
siRNA duplexes	Dharmacon	Custom design
Thymidine	Sigma	T9250
Trypsine 2.5%	Thermo Fisher	15090-046