פרוטוקול אופטימיזציה עבור Assay Shift ניידות Electrophoretic שימוש פלורסנט אינפרא אדום Oligonucleotides דיי שכותרתו

Summary

אנו מתארים כאן פרוטוקול אופטימיזציה של מבחני Electrophoretic פלורסנט Shift הניידות (fEMSA) באמצעות חלבוני SOX-2 מטוהר יחד עם בדיקות DNA שכותרתו צבע פלואורסצנטי אינפרא אדומות כמקרה מבחן כדי להתמודד עם שאלה ביולוגית חשובה.

Abstract

מבחני Electrophoretic Shift ניידות (Emsa) הם כלי אינסטרומנטלי לאפיין אינטראקציות בין חלבונים ורצפי DNA היעד שלהם. רדיואקטיביות כבר השיטה השלטת של תיוג DNA ב EMSAs. עם זאת, התקדמות צבעי ניאון שיטות סריקה יש הנחיות שימוש תיוג פלורסנט של DNA כחלופת רדיואקטיביות עבור היתרונות של טיפול קל, תוך חיסכון בזמן, הפחתת עלויות, ושיפור בטיחות. השתמשנו Emsa פלורסנט לאחרונה (fEMSA) כדי לטפל שאלה ביולוגית חשובה בהצלחה. ניתוח fEMSA שלנו מספק תובנה מכניסטית לתוך השפעת מוטציה missense, G73E, ב SOX-2 גורם שעתוק HMG שמור ביותר על פיזור סוג נוירון חוש הריח. מצאנו כי מוטצית SOX-2 חלבון ^G73E משנת פעילות מחייב DNA הספציפי, ובכך לגרום שינוי זהות נוירון חוש ריח. כאן, אנו מציגים אופטימיזציה וחסכוניים צעד-אחר-צעד פרוטוקולעבור fEMSA באמצעות oligonucleotides צבען שכותרתו ניאון אדום המכיל את LIM-4 / SOX-2 אתרי היעד סמוכים מטוהרים SOX-2 חלבונים (WT ו מוטנטים SOX-2 חלבוני ^G73E) כדוגמא ביולוגית.

Introduction

EMSAs משמש לנתח אינטראקציות בין דנ"א וחלבונים באמצעות אלקטרופורזה polyacrylamide ג'ל ילידים (עמוד) כדי לפתור תערובת של חלבון של עניין בדיקת DNA שכותרתו המכיל אתרי יעד פוטנציאליים של החלבון ^1. בדיקת DNA קשרה עם חלבון יהגר לעומת איטית עם בדיקת DNA חופשית, ולכן הוא מפגר הגירה שלה באמצעות מטריצת polyacrylamide. Radiolabeling של DNA ב ^-32 P כבר השיטה השלטת לגילוי ב EMSAs. על אף שהבקשה של radiolabeling במחקר ביוכימי הועילה, שיטות תיוג DNA אלטרנטיבה ברגישות דומה שמתבצעות מועסקים בשל סיכוני בריאות ובטיחות הקשורים בטיפול רדיואקטיביות. שיטות חלופיות אלה כוללים נטיה של DNA עם ביוטין ² או digoxigenin (DIG) ³ (אשר שניהם נלכד על ידי מערכות chemiluminescent), מכתים ירוק SYBR של הג'לים עמוד ^4,או זיהוי ישיר של conjugates צבען פלורסנט DNA על ידי סריקת ^5,6 ג'ל.

הג'לים נפתרו של EMSAs באמצעות בדיקות DNA שכותרתו רדיואקטיבית דורשים עיבוד postrun באמצעות סרטי autoradiography או מערכת phosphorimager לזהות אותות רדיואקטיבי ^1,7. ג'לים של EMSAs באמצעות biotin- ² או DIG-מצומדות ³ בדיקות DNA חייב גם להיות מעובד ומועבר על קרום מתאים ולאחר מכן זוהה על ידי chemiluminescence ^6. SYBR מכתים ירוק של הג'ל דורש מכתים ג'ל postrun וסורק פלורסנט ^4. מאז צעדים ג'ל עיבוד postrun נדרשים עבור EMSAs שימוש בטכניקות תיוג DNA אלה, הג'ל נפתרה ניתן assayed רק פעם אחת. לעומת זאת, בדיקות DNA שכותרתו עם fluorophores ניתן לאתר ישירות בתוך הג'ל בתוך לוחות זכוכית על ידי סורק. לכן, אינטראקציות חלבון ה- DNA ניתן לנטר assayed מספר פעמים בנקודות זמן שונות במהלך הריצה, אשרמקטין את זמן ועלות משמעותית. Conjugates צבע פלואורסצנטי-דנ"א שימשו במשך EMSAs כוללים Cy3 ^6,8, Cy5 ^6,8, והעמסת ^9, ו צבעי ניאון אדום ^4-6.

תקנת תעתיק דורשת אינטראקציות חלבון-דנ"א של גורמי שעתוק גני היעד שלהם. תיאום של אינטראקציות אלה מייצר סוגי תאים מגוונים מתוך אב משותף במהלך ההתפתחות של בעלי חיים. מסך גנטי קדימה משוחד זיהה מוטצית missense, G73E, ב HMG השמור ביותר DNA מחייבת המושלם של SOX-2 גורם שעתוק elegans Caenorhabditis. תוצאות מוטצית שינוי זהות תא של הנוירונים הרחת AWB לתוך הנוירונים הרחת AWC ברמות מולקולריות, מורפולוגיים, ופונקציונליות ^5,10. SOX-2 מסדיר את בידול המסוף דיפרנציאלי של נוירונים AWB ו AWC על ידי אינטראקציה עם גורמי שעתוק השותף בהקשר תלוי בהתאמהאתרי יעד DNA ^5,10. SOX-2 שותפים עם LIM-4 (LHX) ב בידול עצבי מסוף AWB, בעוד SOX-2 שותפים עם 36 CEH (OTX / OTD) ב בידול עצבי מסוף AWC. מבחני כתב בלוציפראז מראים כי SOX-2 ו מוטצית SOX-2 חלבונים ^G73E יש אינטראקציות שיתוף פעולה עם קו-פקטורים תעתיק LIM-4 ו CEH-36 כדי להפעיל האמרגן הביע בנוירונים AWB ו AWC. עם זאת, SOX-2 ו ^G73E SOX-2 מוטציה מוצגת מאפייני הפעלת הפרש של האמרגן. כדי לחקור את הבסיס המולקולרי של פעילויות מחייב DNA הפרש של SOX-2 ו- SOX-2 ^G73E, fEMSAs בוצע עם חלבונים אלה ואתרי היעד הפוטנציאליים שלהם.

ראשית, גישה ביואינפורמטיקה נלקחה לזהות את ה- DNA הרלוונטי הביולוגי מחייב רצפים בתוך אזור אמרגן 1 kb בשימוש assay בלוציפראז. מאז SOX-2 אתרי קישור פוטנציאל מרובים נכחו לאורך האמרגן, התמקדנועל חזה SOX-2 אתרי קישור סמוכים המשוער CEH-36 או LIM-4 אתרי מחייב שמורים באבולוציה בין מיני נמטודות שונים. רצפים אלה נמחקו או מוטציה, ולאחר מכן נבדק in vivo לפעילותם להביע transgenes הכתב GFP בנוירונים AWB או AWC. באמצעות גישה זו, זיהינו אתרי יעד סמוכים פוטנציאל LIM-4 / SOX-2 ו CEH-36 / SOX-2 כי נדרשים במיוחד עבור הביטוי של GFP בנוירונים AWB ו AWC, בהתאמה ^5. חקרנו את הפרשים פוטנציאליים ב- DNA המחייב של SOX-2 ו- SOX-2 ^G73E באמצעות fEMSA עם LIM-4 / SOX-2 זיהו CEH-36 / SOX-2 אתרי מטרה סמוכים. ניתוח Emsa שלנו הראו כי ^G73E SOX-2 לא להיקשר החללית DNA המכיל את LIM-4 / SOX-2 אתרי היעד הסמוך (חובה עבור ביטוי גנים AWB) בצורה יעילה ככל WT SOX-2 עשה. עם זאת, SOX-2 ו- SOX-2 ^G73E לא היה הבדל מחייב בדיקת DNA המכילה את CEH-36 / SOX-2אתר היעד djacent (חובה עבור ביטוי גנים AWC) ^5,10. FEMSA שלנו מנתחת לספק תובנה מכניסטית לתוך הטבע של המוטציה ^G73E SOX-2 לפגוע בפעילות מחייב DNA ספציפיים עבור טרנספורמציה תא זהות פנוטיפ AWB ל-AWC. כאן אנו מתארים פרוטוקול אופטימיזציה של fEMSA באמצעות 6xHis-סוקס 2 מטוהרים או 6xHis-סוקס 2 ^G73E יחד עם בדיקות DNA שכותרתו צבע פלואורסצנטי אינפרא אדום המכיל באתרי היעד LIM-4 / SOX-2 הסמוך כמקרה מבחן כדי להתמודד שאלה ביולוגית חשובה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: EMSAs באמצעות בדיקות DNA שכותרתו fluorescently או צורות אחרות של DNA שכותרתו לשתף את הפרוטוקולים זהים עבור חלבון או תא תמצית הכנה, חלבון-דנ"א תגובה מחייבת, ואת עמוד ג'ל הכנה והפעלה (איור 1 א). ההבדלים העיקריים הם הליכי תיוג DNA, מדרגות עיבוד ג'ל שלאחר הפעלה ולאחר שיטות זיהוי.

1. הכנת ג'ל

1. הכן ג'ל polyacrylamide יליד 5% המכיל TBE 0.5x (45 מ"מ טריס-Borate, 1 mM EDTA) ו -2.5% גליצרול, באמצעות מערכת ג'ל חלבון מיני (x רוחב 8.3 ס"מ עובי 7.3 ס"מ אורך x 0.75 מ"מ).
   1. כדי להכין 30 מ"ל של תמיסת ג'ל 4 ג'לים, לערבב 5 מ"ל של 30% Acrylamide / Bis (37.5: 1), 3 מ"ל של TBE 5x (0.45 M טריס-Borate, 10 mM EDTA), 1.5 מ"ל של 50% גליצרול, 300 μL של 10% אמוניום persulfate, 15 μL של TEMED, ו -20.2 מ"ל של DDH ₂ O ביסודיות.
      הערה: Acrylamide הוא מזיקים רעיל, להתמודד עם ציוד מגן אישי מתאים.
2. עופרת הפתרון ג'ל מיד. לאחר פילמור, לעטוף את הג'לים בניילון נצמד ברור מראש רטוב עם TBE 0.5x ולאחסן אותם ב 4 ° C.

2. הכנת פלורסנט אינפרא אדום צבען שכותרתו בדיקות

הערה: שמור את oligonucleotides שכותרתו צבע פלואורסצנטי אינפרא האדום במרחק של אור ככל האפשר במהלך הכנה, אחסון, וניסויים.

1. oligonucleotides עיצוב וסדר.
   1. עיצוב oligonucleotide להתגעגע ~ 51-מרס.
      הערה: רצף oligonucleotide הארוך של חללית LIM-4 / SOX-2 הוא TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. oligonucleotides הארוכה אינה דורשת עמוד או טיהור HPLC.
   2. עיצוב oligonucleotides קצר משלים ~ 14-מרס עם שינוי צבע פלואורסצנטי אינפרא אדום ב 5 התחנה הסופית "(5'Dye) ואת טמפרטורת ההתכה מעל 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: רצף oligonucleotide הקצר של LIM-4 / SOX-בדיקה 2 היא 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG. סולם סינתזת המינימום של oligonucleotides הקצר שכותרתו 5'Dye הוא 100 ננומטר. לכן, oligonucleotides דורש טיהור HPLC.
2. oligonucleotides Resuspend במאגר 1x טריס-EDTA (TE: 10 מ"מ טריס- HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA) לריכוז סופי של 100 מיקרומטר.
3. קצר לחשל (5'Dye) ו oligonucleotides הארוכה.
   1. מערבבים 0.6 μL של אוליגו 5'Dye-קצר (100 מיקרומטר), 1.2 μL של אוליגו ארוך (100 מיקרומטר), ו -28.2 μL של נתרן כלוריד-טריס-EDTA חיץ (STE: 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA) בצינור מ"ל 1.5.
   2. מניחים את הצינור במים רותחים במשך 5 דקות. כבה את מקור החום ולתת את המים עם oligos annealed מגניב O / N בחושך.
4. מלא את סככות '5 של annealed 5'Dye-קצר / ארוך oligos עם פולימראז Klenow DNA לעשות בדיקות DNA גדילים כפולות.
   1. הכן את התגובה על ידי ערבוב30 μL של oligos קצר / ארוך annealed עם תג 5'Dye, 8.5 μL של 10x חיץ Klenow, 1.7 μL של 10 מ"מ dNTPs, 1.7 μL של Klenow (3 '-> 5' exo-) (5 U / μL), ו 43.1 μL של DDH ₂ O בתוך שפופרת 0.2 מ"ל PCR.
   2. דגירה 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס במכונה PCR.
   3. להוסיף 3.4 μL 0.5 M EDTA כדי לעצור את התגובה ו להשבית חום 75 ​​מעלות צלזיוס במשך 20 דקות בתוך המכונה PCR.
5. לדלל בדיקות מלאות ב- (0.7 מיקרומטר) ב STE עבור ריכוז סופי של 0.1 מיקרומטר.
6. oligos חנות ב -20 ° C בחושך עד מוכן לשימוש. Oligos ניתן לאחסן עד שנה במצב הזה.
   הערה: כדי ליצור בדיקות דנ"א עם אתרי קישור מוטציה, גרסות מוטציה של oligonucleotides הארוך הן annealed עם oligonucleotides הקצר שכותרתו 5'Dye, ואחריו מילוי-ב 5 'מסוכך עם Klenow. הוכח כי החללית עם גדיל אחד מתויגת עם פלורסנט אינפרא אדוםיש לצבוע רק 30% עוצמים החללית עם שני הגדילים שכותרתו עם הצבע. אם עוצמת האות צריכה להתחזק, oligos ארוכה של גדילי הן מסומנים עם צבעי ניאון אינפרא אדום ב 5 'טרמיני annealed לעשות פלורסנט אינפרא אדום בדיקות שכותרתו לצבוע.

3. הכנת בדיקות ללא תווית / קר (מתחרים)

הערה: oligonucleotides הארוך של רצפים משלימים (לונג LongR) היה annealed לעשות בדיקות ללא תווית לניתוח תחרות עם בדיקות צבען שכותרתו פלורסנט אינפרא האדומה.

1. מערבבים 20 μL של 100 מיקרומטר ארוך, 20 μL של 100 מיקרומטר LongR oligonucleotides, ו -60 μL של STE בתוך שפופרת מ"ל 1.5.
2. מניחים את הצינור במים רותחים במשך 5 דקות, לכבות את מקור החום ולתת את המים עם oligos annealed לקרר לילה.

4. תגובה מחייבת ו אלקטרופורזה

1. הכן 1 מ"ל של חיץ מחייב 5x ידי ערבוב 50 μL60; של 1 M טריס- HCl, pH 7.5; 10 μL של 5 M NaCl; 200 μL של 1 M KCl, 5 μL של 1 M MgCl _2, 10 μL של 0.5 M EDTA, pH 8.0; 5 μL של 1 M DTT; 25 μL של 10 מ"ג / מ"ל BSA, ו 695 μL של DDH ₂ O.
   הערה: הצפת עקידת 5x ניתן aliquoted ומאוחסנת ב -20 מעלות צלזיוס. נקודה נוספת שיש לקחת בחשבון היא כי גורמי תעתוק שונים יהיו שינויים שונים למאגר המחייב.
2. ממש לפני הקמת תגובות מחייב, טרום להפעיל את הג'ל polyacrylamide יליד 5% ב TBE 0.5x + 2.5% גליצרול כדי להסיר כל עקבות של persulfate אמוניום ב 80 V עבור 30 - 60 דקות, או עד הנוכחי כבר לא משתנה עם הזמן.
3. הגדר את התגובה מחייבת בנפח סופי של 20 μL.
   1. מערבבים 4 μL של חיץ מחייב 5x, 80 - 200 ng פרוטאין טהור (ב 50% גליצרול, כלומר, SOX-2), 1 μL של 0.1 מיקרומטר צבען מצומדות בדיקה (קונצרט כלשהו הסופיentration: 5 ננומטר), ו DDH ₂ O.
   2. אופציונאלי: כאשר מתחרי חללית קרים נדרשים, להוסיף בריכוזים שונים (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, וכו ') של בדיקות קרות.
   3. אופציונלי: כאשר האינטראקציה בין החלבונים A ו- B (כלומר, SOX-2 ו LIM-4) הוא נבדק, להוסיף 80 - 200 ng B חלבונים מטוהרים (גליצרול 50%, כלומר, LIM-4).
   4. אופציונאלי: כאשר הכין תמצית גרעינית משמש ספציפי מחייב של חלבון הוא לקבל אישור, להוסיף נוגדן ספציפי לחלבון (כלומר, אנטי 6xHis, אנטי-FLAG, וכו ').
   5. לדגור על R / T בחושך במשך 15 דקות.
4. לטעון את כל התגובה מחייב על ג'ל ולהפעיל את הג'ל על 10 V / ס"מ עד למרחק הרצוי.

הדמיה 5.

הערה: ג'ל נסרק ישירות צלחות הזכוכית עם מערכת הדמיית אינפרא אדומה מתקדמת. לכן, את הג'ל ניתן לפתור נוסף וסקר שוב ושוב (1C הדמוי 2). מערכת דימות פלואורסצנטי האינפרה-אדום קרובה בעיקר כתמים מערביים נבדקה גם לסרוק את הג'ל, אלא רק את מערכת הדמיית אינפרא האדומה המתקדמת הייתה מסוגלת לסרוק את הג'ל עם רזולוציה טובה. המתודולוגיה המתוארת היא ספציפית תוכנת הדמיה אינפרא אדום מסוימת, אם כי חבילות תוכנה אחרות ניתן להשתמש.

1. נקו את המיטה של הסורק עם DDH ₂ O ולייבש היטב לפני הסריקה. נגבה לייבוש לוחות הזכוכית של הג'ל ומניח את הצלחות המכילות את הג'ל על מיטת הסורק.
2. פתח את תוכנת הדמיה אינפרא אדום עבור לכרטיסייה 'רוכשת'. כשהצלחת מדלל (1 מ"מ) מושם על משטח הסורק, להשתמש בהגדרות של ערוץ: 700, עוצמה: Auto, רזולוציה: 169 מיקרומטר, איכות: בינוני, ומיקוד אופסט: 1.5 מ"מ. כשהצלחת עבה (3 מ"מ) מושם על משטח הסורק, להשתמש בהגדרות של ערוץ: 700, עוצמה: Auto, רזולוציה: 84 מיקרומטר, איכות: בינוני, ומיקוד אופסט: 3.5 מ"מ. פוקוס הקיזוז תלויעובי של צלחת זכוכית.
3. בחר את האזור כי ג'ל תופסת על הסורק. לחץ "התחל" כדי להתחיל בסריקה.
4. חזור על אלקטרופורזה ולסרוק גם לפי הצורך.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

לצבוע טעינת אורנג G (6x: 0.12 גר 'אורנג' G ב 100 מ"ל 30% גליצרול) ניתן להוסיף התגובה מחייב לפני טעינת לדמיין את ההתקדמות של אלקטרופורזה. צבעי טעינת אחרים כולל כחול bromophenol יזוהו במהלך הסריקה ולכן להפריע ניתוח התמונה (איור 1B).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

fEMSAs מהווים כלי יעיל לחקור אינטראקציות חלבון-דנ"א, והם אלטרנטיבה הסימון הרדיואקטיבי של DNA. צבעי ניאון כגון צבעי אינפרא אדומים זמינים מסחרי, ולספק שיטה בטוחה יותר ויותר ידידותית לסביבה לעומת תיוג DNA רדיואקטיבי. EMSAs באמצעות oligonucleotides אינפרא אדום הניאון שכותרתו לצבוע א?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	Bio-Rad	1610158	Acrylamide is harmful and toxic.
6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700-labeled DNA Oligos	Integrated DNA Technologies	Custom DNA oligo	These are referred to as "5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100 μM scale synthesis and HPLC purification.
Klenow Fragment (3'-->5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell	Bio-Rad	1658000FC	This is referred to as a 'mini protein gel system' in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size.
Odyssey CLx Infrared Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey CLx Infrared Imagng System	This is referred to as an 'advanced infrared imaging system' in the manuscript.
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System	This is referred as a 'near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots' in the manuscript.
Image Studio software (version 4.0)	LI-COR Biotechnology	Image Studio software	This is referred to as a 'particular imaging software' in the manuscript.
Orange G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Orange loading dye			0.25% Orange G; 30% Glycerol
0.5x TBE			45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
5x Binding Buffer			50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μg/mL BSA