Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol

Özet

Biz burada önemli bir biyolojik soruyu çözmek için bir vaka çalışması olarak kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte saflaştırılmış SOX-2 proteinleri kullanılarak floresan Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Tahliller (FEMSA) optimize edilmiş bir protokol açıklar.

Özet

Elektroforetik hareket kayma deneyleri (EMSA) proteinler ve hedef DNA dizileri arasındaki etkileşimi karakterize eden bir aracı bir araçtır. Radyoaktivite EMSA DNA etiketleme baskın yöntem olmuştur. Ancak, floresan boyalar ve tarama yöntemleri son gelişmeler, zaman tasarrufu maliyetini azaltarak ve güvenliğini geliştirmek, kolay kullanım avantajları için radyoaktivite alternatif olarak DNA floresan etiketleme kullanımı teşvik etmiştir. Biz son zamanlarda başarıyla önemli bir biyolojik soruyu ele almak için floresan EMSA (FEMSA) kullandık. Bizim FEMSA analizi yüksek derecede korunmuş HMG transkripsiyon faktörü SOX-2 koku nöron tipi çeşitlendirilmesi üzerinde, bir missense mutasyon, G73E yürürlüğe mekanik görmemizi sağlar. Mutantını SOX-2 ^G73E proteini ve böylece koku nöron kimlik dönüşümü neden spesifik DNA bağlanma aktivitesi değiştirir bulundu. Burada, mevcut olan bir iyileştirilmiş ve adım adım protokolü maliyetliFEMSA biyolojik örnek olarak LIM-4 / SOX-2 bitişik hedef sitesi ve saflaştırılmış SOX-2 proteinleri (WT ve mutant SOX-2 ^G73E proteinler) içeren kızıl ötesi floresan boya etiketli oligonükleotidler kullanılarak.

Giriş

EMSA ilgi konusu bir protein ve protein ¹ potansiyel hedef sitesi ihtiva eden bir işaretli DNA sondası bir karışımını çözmek için yerel poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) kullanılarak DNA ve protein arasındaki etkileşimi analiz etmek için kullanılır. protein ile bağlı bir DNA probu yavaş serbest DNA probu ile karşılaştırılır ve bir poliakrilamit matris boyunca, geçiş nedenle geciktirilir değiştirecektir. ³² P DNA Radyo-etiketlenmesi EMSA tespiti için baskın bir yöntem olmuştur. biyokimyasal araştırmalarda radyo sınıflandırılmasıyla uygulama yararlı olmasına rağmen, benzer hassasiyetle alternatif DNA etiketleme yöntemleri nedeniyle radyoaktivite taşıma ile ilgili sağlık ve güvenlik risklerine istihdam edilmektedir. Bu alternatif yöntemler, biyotin ² veya digoksijenin (DIG) ³ (her ikisi de daha sonra kimyasal olarak ışık veren sistemler tarafından tespit edilir) olan DNA konjügasyon PAGE jelleri ⁴ SYBR yeşil boyama dahilya da jel ^5,6 tarayarak DNA floresan boya konjügatlarının doğrudan tespiti.

Radyoaktif olarak etiketlenmiş DNA sondaları kullanılarak EMSA çözülmesi jeller postrun otoradyografi filmler içinden işleme veya radyoaktif sinyaller ^1,7 tespit etmek için, bir Phosphorimager sistemi gerektirmektedir. ^Biotin-2 veya DIG-konjuge ³ DNA sondaları kullanılarak EMSA ve jeller de işlenebilir ve uygun bir membran üzerine aktarıldı ve kemiluminesans ⁶ tarafından tespit edilmelidir. Jelin SYBR yeşil boyama postrun jel boyama ve floresan tarayıcı ⁴ gerektirir. postrun jel işlem adımları, bu DNA etiketleme teknikleri kullanılarak EMSA için gerekli olması nedeniyle, giderilmiş jel bir kez analiz edilebilir. Bunun aksine, floroforlar ile etiketlenmiş DNA probları Bir tarayıcıdan cam plakalar içindeki jelde tespit edilebilir. Böylece, DNA-protein etkileşimleri izlenebilir ve çalışma sırasında farklı zaman noktalarında birkaç kez deneye tabi olanönemli ölçüde zaman ve maliyeti azaltır. EMSA kullanılmaktadır DNA fluoresan boya konjügatları Cy3 ^6,8, Cy5 ^6,8, fluoresein ⁹ ve kızıl ötesi floresan boyalar ^4-6 içerir.

Transkripsiyonal düzenleme transkripsiyon faktörleri ve hedef genlerin protein-DNA etkileşim gerektirir. Bu etkileşimlerin Koordinasyon hayvan gelişimi sırasında ortak bir progenitör gelen farklı hücre tipleri oluşturur. Tarafsız bir ileri genetik ekranı Caenorhabditis elegans transkripsiyon faktörü SOX-2 yüksek derecede korunmuş HMG DNA-bağlama etki, yanlış anlamlı bir mutasyon, G73E tespit edilmiştir. , Moleküler morfolojik ve fonksiyonel düzeyde ^5,10 at AWC koku nöronlar içine AWB koku nöronların hücre kimliği dönüşümünde mutasyon sonuçları. SOX-2 farklı şekilde bağlam-bağımlı ortak transkripsiyon faktörlerinin ve ilgili etkileşerek AWB ve AWC nöronların terminal farklılaşmasını düzenleyenDNA hedef site ^5,10. SOX-2 terminali AWB nöronal farklılaşma LIM-4 (LHX) işbirliği, SOX-2 terminali AWC nöron farklılaşma CEH-36 (OTX / OTD) ile işbirliği yapmaktadır. Lusiferaz raportör testleri gösterirken bu SOX-2 ve mutant SOX-2 ^G73E proteinleri AWB ve AWC nöronlarda ifade edilen bir promotör etkinleştirmek için transkripsiyonel kofaktörler LIM-4 ve CEH-36 ile işbirliği etkileşimleri vardır. Bununla birlikte, SOX-2 ve mutant SOX-2 ^G73E promoteri ayırıcı etkinleştirme özelliklerine gösterilir. SOX-2 ve SOX-2 ^G73E ayırıcı bir DNA bağlama aktivitesi moleküler temelini araştırmak için, fEMSAs bu proteinlerin ve olası hedef alanlan ile yapıldı.

İlk olarak, biyoenformatik yaklaşımı lusiferaz tahlilde kullanılan 1 kb promoter bölgesi içinde bağlama dizileri biyolojik ilgili DNA tespit alındı. Birden fazla potansiyel SOX-2 bağlayıcı siteler promotör boyunca mevcut olduğundan, biz odaklıfarazi CEH-36 ya da LIM-4 bağlanma yerleri bitişik ve evrimsel çeşitli nematod türlerinin arasında korunan tahmin SOX-2 bağlayıcı sitelerde. Bu diziler, silinmiş ya da mutasyona uğramış, ve daha sonra AWB veya AWC nöronlarda GFP raportör transgenleri ifade etme aktivitesi için in vivo olarak test edilmiştir. Bu yaklaşım sayesinde, özellikle AWB ve AWC nöronlar, sırasıyla, ⁵ GFP ekspresyonu için gerekli olan LIM-4 / SOX-2 potansiyeli ve CEH-36 / SOX-2 bitişik hedef sitesi belirlenmiştir. Biz SOX-2 ve SOX-2 LIM-4 / SOX-2 tespit ve CEH-36 / SOX-2 bitişik hedef siteleri ile FEMSA kullanarak ^G73E bağlayıcı DNA potansiyel farklılıkları araştırıldı. Bizim EMSA analizi SOX-2 ^G73E kadar etkin WT SOX-2 gibi (AWB gen ifadesi için gerekli olan) LIM-4 / SOX-2 bitişik hedef sitesi ihtiva eden DNA probu bağlamak olmadığını gösterdi. Bununla birlikte, SOX-2 ve SOX-2 ^G73E içeren DNA probu bağlama fark vardı CEH-36 / SOX-2^5,10 (AWC gen ifadesi için gerekli olan) djacent hedef bölge. Bizim FEMSA AWB-to-AWC hücre kimlik dönüşümü fenotip için spesifik DNA bağlama aktivitesini etkileyen SOX-2 ^G73E mutasyonunun doğaya mekanik bilgiler sağlayabilir analiz eder. Burada, saflaştırılmış 6xHis-SOX-2 veya 6xHis-SOX-2 çözmek için bir vaka çalışması olarak LIM-4 / SOX-2 bitişik hedef siteleri içeren kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte ^G73E kullanarak FEMSA optimize edilmiş bir protokol tarif önemli bir biyolojik bir soru.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Not: fosforla etiketlenmiş DNA sondaları veya işaretlenmiş DNA diğer formları kullanarak EMSA protein ya da hücre özü hazırlanması, protein-DNA bağlanma reaksiyonu ve PAGE jel hazırlanmasında ve yürütülmesinde (Şekil 1A) için aynı protokol paylaşır. önemli farklılıklar DNA etiketleme prosedürleri, post-run jel işleme aşamaları ve algılama yöntemleridir.

1. Jel Hazırlanması

1. mini protein jel sistemi (8.3 cm genişlik x 7.3 cm uzunluk x 0.75 mm kalınlık) kullanılarak, 0.5x TBE (45 mM Tris-Borate, 1mM EDTA) ve% 2.5 gliserol içeren% 5 yerli poliakrilamid jel hazırlayın.
   1. Akrilamid / Bis 4 jeller için jel çözeltisi, 30 mL hazırlanması% 30 5 mL karıştırın (37.5: 1), 3 5x TBE (0.45 M Tris-borat, 10 mM EDTA),% 50, 1.5 mL gliserol mL, % 10 amonyum persülfat 300 uL, TEMED 15 uL ve iyice GKD ₂ O 20.2 mi.
      NOT: Akrilamid zararlı ve toksik uygun kişisel koruyucu ekipman ile anlaştım.
2. hemen jel çözümü Cast. Polimerizasyon sonra, şeffaf plastik wrap 0.5x TBE önceden ıslatılmış jeller sarın ve 4 ° C'de saklayın.

Kızılötesi floresan boya işaretli problar 2. hazırlanması

Not: hazırlama, depolama, ve deneyler sırasında uzak mümkün olduğu kadar hafif kızılötesi fluoresan boya etiketli oligonükleotidler tutun.

1. Tasarım ve sipariş oligonükleotidler.
   1. ~ 51-mers uzun oligonükleotidi tasarlayın.
      Not: LIM-4 / SOX-2 sonda uzun oligonükleotid dizisi TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC olup. Uzun oligonükleotidler SAYFA veya HPLC saflaştırma gerekmez.
   2. 5 'ucunda (5'Dye) ve 37 ° C'nin üzerinde bir erime sıcaklığı, kızılötesi floresan boya modifikasyonuna ~ 14-mer tamamlayıcı kısa oligonükleotidlerin tasarımlanması.
      NOT: Kısa oligonükleotid dizisi LIM-4 / SOX-2 prob 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG olduğunu. 5'Dye etiketli Kısa oligonükleotitlerin asgari sentezi ölçeği 100 nM'dir. Bu nedenle, oligonükleotidler, HPLC saflaştırma gerektirir.
2. 100 uM nihai konsantrasyona kadar; (1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCI, pH 8.0 TE) 1x Tris-EDTA tampon maddesi içinde yeniden süspanse oligonükleotitler.
3. Tavlama Kısa (5'Dye) ve Uzun oligonükleotidler.
   1. 0.6 5'Dye-Kısa bir oligo (100 uM) uL, uzun oligo (100 uM), 1.2 ul, sodyum 28.2 uL klorür-tris-EDTA tampon maddesi (karıştırın STE: 100 mM NaCI, 10 mM Tris-HCI, pH 8.0; 1 mM EDTA), bir 1.5 ml bir tüp içinde.
   2. 5 dakika boyunca kaynayan suda tüp yerleştirin. ısı kaynağı kapatın ve tavlı oligos karanlıkta O / N serin suyu sağlar.
4. iki şeritli DNA probları yapmak için Klenow DNA polimeraz ile tavlanmış 5'Dye-kısa / uzun oligo 5 'çıkıntısını doldurmak.
   1. karıştırılarak reaksiyon hazırlanması5'Dye etiketiyle tavlanmış uzun / kısa oligo 30 uL, 8.5 uL 10x Klenow tamponu, 10 mM dNTP 1.7 ul, 1.7 Klenow uL (3 '-> 5' ekso-) (5 u / uL) ve 0.2 ml PCR tüpünde GKD ₂ O 43.1 ul.
   2. PCR makinesi içerisinde 37 ° C'de 60 dakika kuluçkalayın.
   3. PCR makinesi içinde 20 dakika süreyle 75 ° C'de reaksiyona ısı devre dışı bırak durdurmak için 3.4 mcL 0.5 M EDTA ekleyin.
5. 0.1 uM nihai konsantrasyon için STE doldurulmuş sondalar (0.7 uM) ile seyreltilir.
6. hazır olana kadar karanlıkta -20 ° C'de saklayın oligos kullanmak için. Oligo Bu durumda, bir yıla kadar depolanabilir.
   NOT: Mutant bağlayıcı siteleri ile DNA probları oluşturmak için, uzun oligonükleotitlerin mutant sürümleri Klenow ile 5 'çıkıntılar dolgu-in ardından 5'Dye etiketli kısa oligonükleotid ile tavlanır. Bir iplikçik prob kızılötesi floresan ile etiketlenmiş olduğu gösterilmiştirboya boya ile işaretlenmiş, her iki şerit prob sadece% 30 yoğunluğa sahiptir. Sinyal yoğunluğu güçlendirilmelidir, her iki şerit uzun oligo 5 'termini, kızılötesi floresan boyalar ile etiketlenmiş ve kızıl ötesi floresan boya etiketli problar yapmak için tavlanır.

Etiketsiz / Soğuk Sondalar 3. Hazırlama (Yarışmacı)

Not: tamamlayıcı diziler (Uzun ve Longr) Uzun oligonükleotidler kızılötesi floresan boya etiketli problar ile rekabet analizi için etiketsiz probları yapmak tavlanmıştır.

1. 1.5 ml bir tüp içinde, 100 mikron uzunluğunda 20 uL, 100 uM Longr oligonükleotid 20 uL ve STE 60 uL karıştırın.
2. 5 dakika kaynar suda tüp yerleştirin ısı kaynağını kapatın ve tavlanmış oligos gece boyunca soğumaya suyu sağlar.

4. Bağlanma reaksiyonu ve elektroforez

1. 50 uL karıştırılarak 5x bağlama tamponu, 1 mL hazırlanması60 ° C; 1 M Tris-HCl, pH 7,5; 5 M NaCI, 10 uL; 1 M KCl, _MgCl2 1 M 5 uL 200 _uL, 0.5 M EDTA, 10 uL, pH 8.0; 1 M DTT 5 uL; GKD ₂ O 25, 10 mg / ml BSA uL ve 695 uL
   Not: 5x bağlama tamponu bölünüp -20 ° C'de saklanabilir. Dikkate alınması gereken diğer bir nokta, farklı transkripsiyon faktörleri bağlama tamponu farklı modifikasyonlara sahip olmasıdır.
2. Sağ bağlama reaksiyonları kurmadan önce, 30 80 V amonyum persülfat tüm izlerini silmek için +% 2.5 gliserol 0.5x TBE% 5 yerli poliakrilamid jel önceden işletilen - 60 dk veya geçerli artık zamanla değişir kadar.
3. 20 uL nihai hacimde bağlanma reaksiyonuna ayarlayın.
   1. 4 5x bağlama tamponu uL, 80 karıştırın - saflaştırılmış protein A 200 ng (örneğin,% 50 gliserol, SOX-2), 0.1 uM Boya ile konjüge edilmiş prob 1 pL (son konsentration: 5 nM) ve GKD ₂ O
   2. İsteğe bağlı: Soğuk sonda rakipler gerektiğinde, çeşitli konsantrasyonlarda soğuk prob (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, vs.) ekleyin.
   3. İsteğe bağlı: proteinler, A ve B arasındaki etkileşimi (örneğin, SOX-2 ve LIM-4) test edildiğinde, 80 ekleyin - saflaştırılmış protein B 200 ng (yani,% 50 gliserol içinde, LIM-4).
   4. İsteğe bağlı: nükleer ekstre hazırlanması kullanılan doğrulanması için protein A spesifik bağlanma ise, protein A (örneğin, bir anti-6xHis, anti-FLAG, vs.) özel antikor ekleyin.
   5. 15 dakika süreyle karanlıkta R / T'de bir gece inkübe edin.
4. jel üzerine bağlanma reaksiyonunun tüm yük ve istenen mesafeye 10 V / cm jel üzerinde çalıştırıldı.

5. Görüntüleme

NOT: Jel gelişmiş kızılötesi görüntüleme sistemi ile cam plakalar doğrudan tarandı. Bu nedenle, jel daha çözülebilir ve tekrar tekrar taranan (Şekil 1C ve 2). öncelikle Western lekeleme için yakın kızılötesi floresan görüntüleme sistemi de jel taramak için test edilmiştir, ancak gelişmiş kızılötesi görüntüleme sistemi iyi çözünürlüğe sahip jel tarama başardı. diğer yazılım paketleri kullanılabilir, ancak tarif edilen yöntem, belirli bir kızılötesi görüntüleme yazılımı özgüdür.

1. GKD ₂ O ile tarayıcı yatağı temizleyin ve taramadan önce iyice kurutun. jel cam plakalar silerek kurutun ve tarayıcı yatağı üzerinde jel içeren plakalar yerleştirin.
2. kızılötesi görüntüleme yazılımını açın ve 'Edinme' sekmesine gidin. ince plaka (1 mm) tarayıcı yatağına yerleştirildiğinde, Kanal ayarları kullanmak: 700, Yoğunluk: Otomatik, Çözünürlük: 169 um, Kalite: Orta ve Odak Ofset: 1.5 mm. kalın levha (3 mm) tarayıcı yatağına yerleştirildiğinde, Kanal ayarları kullanmak: 700, Yoğunluk: Otomatik, Çözünürlük: 84 um, Kalite: Orta ve Odak Ofset: 3,5 mm. ofset odak bağlıdırcam levha kalınlığı.
3. Jel tarayıcıya kapladığı alanı seçin. Taramayı başlatmak için 'Başlat' düğmesine tıklayın.
4. elektroforez tekrarlayın ve ayrıca gerektiğinde tarayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Portakal Rengi G yükleme boyası (6x 100 mL% 30 gliserol içinde 0.12 g turuncu G) Electrophoresis ilerlemesini görselleştirmek için yükleme öncesi bağlanma reaksiyona ilave edilebilir. Bromofenol mavisi gibi diğer yükleme boyalar tarama sırasında tespit edilir ve bu nedenle görüntü analizi (Şekil 1B) müdahale edilir.

EMSA Bazı durumlarda, nükleer ekstre hazırlanması kullanılan, özellikle...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

fEMSAs protein-DNA etkileşimlerini araştırmak için etkili bir araçtır ve DNA radyoaktif etiketleme bir alternatiftir. kızıl ötesi boyalar gibi floresan boyalar ticari olarak temin edilebilir, ve radyoaktif bir DNA etiketleme kıyasla çevre dostu daha güvenli ve daha yöntem sağlar. Kızılötesi floresan boya etiketli oligonükleotidler kullanılarak EMSA postrun jel işleme adımlar gerektirir ve bu nedenle diğer DNA etiketleme teknikleri ile karşılaştırıldığında zaman ve maliyet tasarrufu yoktur. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	Bio-Rad	1610158	Acrylamide is harmful and toxic.
6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700-labeled DNA Oligos	Integrated DNA Technologies	Custom DNA oligo	These are referred to as "5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100 μM scale synthesis and HPLC purification.
Klenow Fragment (3'-->5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell	Bio-Rad	1658000FC	This is referred to as a 'mini protein gel system' in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size.
Odyssey CLx Infrared Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey CLx Infrared Imagng System	This is referred to as an 'advanced infrared imaging system' in the manuscript.
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System	This is referred as a 'near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots' in the manuscript.
Image Studio software (version 4.0)	LI-COR Biotechnology	Image Studio software	This is referred to as a 'particular imaging software' in the manuscript.
Orange G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Orange loading dye			0.25% Orange G; 30% Glycerol
0.5x TBE			45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
5x Binding Buffer			50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μg/mL BSA