적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

요약

우리는 여기서 중요한 생물학적 문제를 해결하기 위해 사례 연구와 같은 적외선 형광 염료 표지 DNA 프로브와 함께 정제 된 SOX-2 단백질을 사용하여 형광 전기 영동 이동성 이동 분석 (fEMSA)의 최적화 된 프로토콜을 설명합니다.

초록

전기 영동 이동성 이동 분석 (EMSA)는 단백질과 타겟 DNA 서열 사이의 상호 작용을 특성화하기위한 수단 도구입니다. 방사능은 EMSAs의 DNA 라벨의 주된 방법이었다. 그러나, 형광 염료 및 검사 방법의 최근 발전은, 시간을 절약 비용을 절감하고, 안전성을 향상 취급 용이성의 이점에 대한 방사능의 대안으로 DNA의 형광 태그의 사용을 자극했다. 우리는 최근 성공적으로 중요한 생물학적 문제를 해결하기 위해 형광 EMSA (fEMSA)을 사용했다. 우리 fEMSA 분석은 매우 보존 HMG 전사 인자의 SOX-2 후각 신경 세포 유형의 다양 화에에서는, 과오 돌연변이, G73E의 효과에 기계적인 통찰력을 제공합니다. 우리는 돌연변이 SOX-2 ^{G73E 단백질함으로써} 후각 신경 세포 정체성 변환을 일으키는 특정 DNA 결합 활성을 변경 한 것으로 나타났습니다. 여기서는 현재 최적화 단계별 프로토콜 경제적fEMSA 생물학적 예와 LIM-4 / SOX -2- 인접한 타겟 사이트 정제 SOX-2 단백질 (WT 및 돌연변이 SOX ^{G73E-2 단백질)을} 함유하는 적외 형광 염료 - 표지 된 올리고 뉴클레오티드를 사용.

서문

EMSAs은 목적 단백질과 단백질의 ^하나의 잠재적 표적 부위를 함유하는 표지 된 DNA 프로브의 혼합물을 해결하기 위해 폴리 아크릴 아미드 젤 전기 영동 네이티브 (PAGE)을 이용하여 DNA와 단백질 사이의 상호 작용을 분석하는데 사용된다. 단백질과 결합 된 DNA 프로브는 느린 무료 DNA 프로브와 비교하고, 폴리 아크릴 아미드 매트릭스를 통해 자사의 이동에 따라서 지각 마이그레이션합니다. ⁽³²⁾ P에 의해 DNA의 방사성 표지는 EMSAs의 검출을위한 주된 방법이었다. 생화학 적 연구에서의 방사선의 적용이 유용 하였지만, 유사한 감도 대안 DNA 라벨링 방법 인해 방사선 처리와 연관된 건강 및 안전 위험에 채용되고있다. 이러한 대안적인 방법은 ^{바이오틴이} 나 디그 옥시 제닌 (DIG) ³ (둘 다음 화학 발광 시스템에 의해 검출된다)와 DNA의 결합은 PAGE 겔 ^(4)의 SYBR 그린 염색법 포함또는 겔 ^5,6-를 스캔하여 DNA 형광 염료 접합체 직접 검출.

방사성 표지 된 DNA 프로브를 사용 EMSAs의 해결 겔 postrun자가 방사선 필름을 통해 처리 또는 방사성 ^{1,7- 신호를} 검출하는은 phosphorimager 시스템을 필요로한다. 바이오틴 ² DIG-복합 ³ DNA 프로브를 사용하여 EMSAs의 젤도 처리하고 적절한 막에 전사 한 후 화학 발광 ^(6)에 의해 감지해야합니다. 겔의 SYBR 녹색 염색 postrun 젤 염색 및 형광 스캐너 ^{(4)이 필요합니다.} postrun 겔 처리 단계가 이러한 DNA 라벨링 기술을 사용 EMSAs 필요하기 때문에, 겔을 해결 한 번만 분석 될 수있다. 대조적으로, 형광 표지 DNA 프로브에 직접 스캐너에 의해 유리판 내부 겔에서 검출 될 수있다. 따라서, DNA - 단백질 상호 작용을 모니터링 할 수 있고, 실행시에 다른 시점에서 여러 번 분석하는크게 시간과 비용을 줄일 수 있습니다. EMSAs에 사용 된 DNA 형광 염료 접합체를 Cy3 ^{6,8-, 6,8-} Cy5에, 형광 ⁹ 및 적외 형광 염료 ^{4-6을 포함한다.}

전사 조절은 전사 인자와 그 표적 유전자의 단백질 DNA 상호 작용을 필요로한다. 이러한 상호 작용의 조정 동물 개발하는 동안 공통 조상에서 다양한 세포 유형을 생성합니다. 순방향 바이어스되지 유전 화면 Caenorhabditis 엘레 간스 전사 인자 SOX-2의 고도로 보존 된 HMG-DNA 결합 도메인, 과오 돌연변이 G73E 식별. 분자 형태 및 기능 수준 ^{5, 10에} AWC 후각 신경 세포에 AWB 후각 신경 세포의 정체성 변화의 돌연변이 결과. SOX-2 차동 문맥 의존적 파트너 전사 인자와 함께 각각 상호 작용하여 AWB 및 AWC 뉴런의 말단 분화를 조절DNA의 표적 부위 ^5,10. SOX-2 터미널 AWB 신경 세포 분화에 LIM-4 (LHX) 파트너, SOX-2 터미널 AWC 신경 세포 분화에 CEH-36 (OTX / OTD)와 파트너. 루시 페라 제 기자의 분석은 표시하면서 그 SOX-2 및 돌연변이 SOX-2 ^{G73E 단백질은} AWB 및 AWC 신경 세포에서 발현 프로모터를 활성화하는 전사 보조 인자 LIM-4 및 CEH-36와 협력의 상호 작용을 가지고있다. 그러나, SOX-2 및 돌연변이 SOX-2 ^G73E는 프로모터의 차동 활성화 속성을 표시. SOX-2 및 SOX-2 ^G73E의 차동 DNA 바인딩 활동의 분자 기초를 조사하기 위해, fEMSAs이 단백질과 잠재적 인 대상 사이트와 수행 하였다.

먼저, 생물 정보학 방법은 루시퍼 라제 분석에 사용 1킬로바이트 프로모터 영역 내의 서열 결합 생물학적 관련 DNA를 식별 하였다. 여러 잠재적 인 SOX-2 결합 부위가 프로모터에 걸쳐 존재하기 때문에, 우리는 집중추정 CEH-36 또는 LIM-4 결합 부위에 인접 진화 다양한 선충 종 사이 보존 예측 SOX-2 결합 부위에. 이 시퀀스는 삭제 또는 돌연변이, 이후 AWB 또는 AWC 뉴런에 GFP 리포터 유전자를 표현하는 그들의 활동에 대한 생체 내에서 시험 하였다. 이 방법을 통해, 우리는 구체적으로 AWB 및 AWC 뉴런, 각각 ⁵ GFP의 발현에 필요한 LIM-4 / SOX-2 전위와 CEH-36 / SOX-2 인접한 타겟 사이트를 확인했다. 우리는 SOX-2 및 SOX-2 LIM-4 / SOX-2 식별 CEH-36 / SOX-2 인접한 타겟 사이트와 fEMSA를 사용 ^G73E의 결합 DNA의 잠재적 인 차이를 조사 하였다. 우리 EMSA 분석 SOX -2- ^G73E가 효율적 WT SOX-2처럼 (AWB의 유전자 발현에 필요한)를 LIM-4 / SOX -2- 인접한 표적 부위를 포함하는 DNA 프로브에 결합하지 않았 음을 보여 주었다. 그러나, SOX-2, SOX-2 ^G73E가 포함 된 DNA 프로브를 바인딩에 차이가 있었다없는 CEH-36 / SOX-2^{5, 10} (AWC의 유전자 발현에 필요) djacent 대상 사이트. 우리 fEMSA는 AWB - 투 - AWC 세포의 정체성 변환 표현형에 대한 특정 DNA 결합 활성에 영향을 미치는의 SOX-2 ^{G73E 돌연변이의} 성격에 기계적인 통찰력을 제공 분석한다. 여기, 우리는 정제 6xHis-SOX-2 또는 6xHis-SOX-2 해결하기 위해 사례 연구로 LIM-4 / SOX-2 인접 대상 사이트를 포함하는 적외선 형광 염료 표지 DNA 프로브와 함께 ^G73E를 사용 fEMSA의 최적화 된 프로토콜을 설명 중요한 생물학적 질문입니다.

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프로토콜

주 : 형광 표지 된 DNA 프로브 또는 표지 된 DNA의 다른 형태를 사용 EMSAs 단백질 또는 세포 추출물 제제, 단백질 DNA 결합 반응, 및 PAGE 겔 제제 및 실행 (도 1a)에 대해 동일한 프로토콜을 공유한다. 키 차이는 DNA 라벨 절차 후 실행 겔 처리 단계, 및 검출 방법이다.

1. 젤 준비

1. 미니 단백질 겔 시스템 (8.3 cm 폭 X 7.3 cm 길이 X 0.75 mm 두께)를 사용하여, 0.5 배의 TBE (45 mM 트리스 - 보레이트, 1 mM의 EDTA) 2.5 % 글리세롤을 함유하는 5 %의 천연 폴리 아크릴 아미드 겔을 제조.
   1. 아크릴 아미드 / 비스 4 겔에 대한 겔 용액 30 ㎖를 제조 30 % 5 mL를 혼합하는 (37.5 : 1), 3 배 TBE (0.45 M 트리스 - 보레이트, 10 mM의 EDTA), 50 %, 1.5 mL의 글리세롤 ㎖, 10 % 황산 암모늄 300 μL, TEMED 15 μL, 철저하게 DDH ₂ O의 20.2 mL를.
      참고 : 아크릴 아미드는 유해 및 독성, 적절한 개인 보호 장비를 처리합니다.
2. 즉시 겔 용액 캐스트. 중합 후, 투명한 플라스틱 랩 0.5 배의 TBE에 미리 적셔에 젤을 포장하고 4 ℃에서 저장합니다.

적외선 형광 염료 표지 된 프로브 2. 준비

참고 : 준비, 저장 및 실험하는 동안 멀리 가능한 한 많은 빛의 적외선 형광 염료 표지 올리고 뉴클레오티드를 유지합니다.

1. 디자인 및 주문 올리고 뉴클레오티드.
   1. ~ 51 머 위해 긴 올리고 뉴클레오티드를 디자인합니다.
      참고 : LIM-4 / SOX-2 프로브의 긴 올리고 뉴클레오티드 시퀀스는 TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC입니다. 긴 올리고 뉴클레오티드는 페이지 또는 HPLC 정화가 필요하지 않습니다.
   2. 5 '말단 (5'Dye) 37 ℃ 이상의 용융 온도에서 적외선 형광 염료 변형 ~ 14 머에 대해 상보적인 짧은 올리고 뉴클레오티드를 설계한다.
      참고 :의 짧은 올리고 뉴클레오티드 서열 LIM-4 / SOX-이 프로브는 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG이다. 5'Dye 표지 짧은 올리고 뉴클레오티드의 최소 합성 규모는 100 ㎚이다. 따라서, 올리고 뉴클레오티드는 HPLC 정화를 필요로한다.
2. 100 μM의 최종 농도; (1 mM의 EDTA 10 mM 트리스 - 염산, pH가 8.0 TE) 1X 트리스 - EDTA 버퍼에 재현 탁 올리고 뉴클레오티드.
3. 어닐링 짧은 (5'Dye) 및 긴 올리고 뉴클레오티드.
   1. 0.6 5'Dye - 짧은 올리고 (100 μM)의 μL, 긴 올리고 (100 μM)의 1.2 μL, 나트륨의 28.2 μL 염화 트리스 - EDTA 버퍼를 (혼합 STE : 100 mM의 NaCl을 10 mM 트리스 - 염산, pH를 8.0, 1 mM의 EDTA) 1.5 mL의 관이다.
   2. 5 분 동안 끓는 물에 튜브를 놓습니다. 열원을 끄고 어닐링 올리고 어둠 속에서 O / N를 냉각과 물을 수 있습니다.
4. 이중 가닥 DNA 프로브를 만들기 위해 클레 나우 DNA 중합 효소와 어닐링 5'Dye - 짧은 / 긴 올리고의 5 '오버행를 입력합니다.
   1. 혼합하여 반응 준비5'Dye 태그 어닐링 짧은 / 긴 올리고 30 μL, 8.5 μL의 10 배 클레 나우 버퍼, 10 밀리미터의 dNTPs 1.7 μL, 1.7 클레 나우의 μL (3 '-> 5'엑소) (5 U / μL), 및 0.2 ㎖의 PCR 용 튜브의 DDH ₂ O 43.1 μL.
   2. PCR의 기계에서 37 ° C에서 60 분을 품어.
   3. PCR의 기계에서 20 분 동안 75 ° C에서 반응과 열을 비활성화를 중지 3.4 μL 0.5 M EDTA를 추가합니다.
5. 0.1 μM의 최종 농도 인트 기입 된 프로브 (0.7 μM)를 희석.
6. 준비가 될 때까지 어둠 속에서 -20 ° C에서 보관 올리고는 사용할 수 있습니다. 올리고이 조건에서 최대 1 년 동안 저장 될 수있다.
   참고 : 돌연변이 결합 부위와 DNA 프로브를 생성하기는 긴 올리고 뉴클레오티드의 돌연변이 버전은 클레 나우 5 '오버행의 필인 다음 5'Dye 표지 짧은 올리고 뉴클레오티드로 어닐링된다. 하나의 가닥 프로브 적외선 형광 표지 것으로 밝혀졌다염료는 염료로 표지 된 두 가닥 프로브의 30 %의 강도를 갖는다. 신호 강도가 강화 될 필요가 있다면, 두 가닥의 긴 올리고 5 '말단에서 적외 형광 염료로 표지 및 적외 형광 염료 - 표지 된 탐침을 만들기 위해 어닐링된다.

레이블이없는 / 콜드 프로브 3. 준비 (경쟁자)

주 : 상보 시퀀스 (길고 LongR)의 긴 올리고 뉴클레오티드 적외 형광 염료가 표지 된 프로브와의 경쟁 분석을위한 표지 된 프로브를 만들기 위해 어닐링 하였다.

1. 1.5 mL의 튜브에 100 μM 긴 20 μL, 100 μM LongR 올리고 뉴클레오티드의 20 μL 및 STE의 60 μL를 섞는다.
2. 5 분 동안 끓는 물에 튜브를 배치 열원을 끄고 어닐링 된 올리고 밤새 냉각하여 물을 보자.

4. 바인딩 반응 및 전기 영동

1. 50 μL를 혼합하여 5 배 결합 완충액 1 mL의 준비60, 1 M 트리스 염산, pH가 7.5; 5 M NaCl을 10 μL; 1 M KCl을, 1 M의 MgCl _2의 5 μL, 200 _μL, 0.5 M EDTA 10 μL, 8.0의 pH; 1 M DTT의 5 μL; DDH ₂ O. 25 10 ㎎ / ㎖의 BSA의 μL 및 695 μL
   주 : 배 결합 완충액을 분취하고 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 고려해야 할 또 다른 점은 다른 전사 인자가 결합 버퍼에 다른 수정을 것입니다.
2. 오른쪽 결합 반응을 설정하기 전에, 30, 80 V에서 황산 암모늄의 흔적을 제거하기 위해 + 2.5 % 글리세롤 0.5 배의 TBE에서 5 % 네이티브 폴리 아크릴 아미드 겔을 미리 실행되지 - 60 분 또는 전류는 더 이상 시간에 따라 변화 할 때까지.
3. 20 μL의 최종 부피의 결합 반응을 설정합니다.
   1. 4 배의 결합 완충액 μL 80 믹스 - 정제 된 단백질 A를 ng를 200 (즉, 50 % 글리세롤 SOX-2), 0.1 μM 염료 공액 프로브 1 μL (최종 농entration : 5 ㎚), 및 DDH ₂ O.
   2. 선택 사항 : 차가운 프로브 경쟁이 필요한 경우, 다양한 농도 감기 프로브 (배, 10 배, 25 배, 50 배, 100 배, 등)를 추가합니다.
   3. 선택적 : 단백질 A와 B 사이의 상호 작용 (즉, SOX-2 및 LIM-4)를 시험 할 때 80 추가 - 정제 된 단백질 B 겨 (200) (즉, 50 % 글리세롤, LIM-4).
   4. 옵션 : 핵 추출물 준비를 사용하고 유효성을 검사 할 수있다 단백질 A의 특이 적 결합하면 단백질 A (즉, 안티 6xHis, 안티 - FLAG 등)에 대한 특이 항체를 추가합니다.
   5. 15 분 동안 어둠 속에서 R / T에 품어.
4. 겔에 결합 반응 모두를로드하고 원하는 거리 10 V / cm에서 젤을 실행합니다.

5. 이미지

주 : 겔 진보 적외선 이미징 시스템을 유리판에 직접 주사 하였다. 따라서, 상기 겔이 해결 될 수 있고 반복적으로 스캔 (도 1C 및 2). 주로 웨스턴 블랏을위한 근 적외 형광 영상 시스템은 또한 겔을 검사하기 위해 테스트 하였다 있지만 고급 적외선 이미징 시스템은 양호한 해상도를 갖는 겔을 검사 할 수 있었다. 다른 소프트웨어 패키지가 이용 될 수 있지만, 기술 된 방법은 특정 적외선 이미지 소프트웨어에 고유하다.

1. DDH ₂ O와 스캐너의 침대를 청소하고 스캔하기 전에 잘 건조. 겔의 유리판을 건조 닦아 스캐너 침대에 젤을 포함하는 판을 배치합니다.
2. 적외선 이미징 소프트웨어를 열고 '획득'탭으로 이동합니다. 얇은 판 (1 mm)가 스캐너 침대에 배치되면, 채널의 설정을 사용 : 700, 밝기 : 자동, 해상도 : 169 μm의 품질 : 중간, 그리고 초점 오프셋 (offset) : 1.5 mm입니다. 두꺼운 판 (3 mm)가 스캐너 침대에 배치되면, 채널의 설정을 사용 : 700, 밝기 : 자동, 해상도 : 84 μm의 품질 : 중간, 그리고 초점 오프셋 (offset) : 3.5 mm. 오프셋 초점은에 따라 달라집니다유리판의 두께.
3. 젤 스캐너에 차지하는 영역을 선택합니다. 스캔을 시작하려면 '시작'을 클릭합니다.
4. 전기 영동을 반복하고 추가로 필요한 검사합니다.

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결과

오렌지 G 로딩 염료 (6 배 : 100 mL의 30 % 글리세롤에서 0.12 g 오렌지 G)는 전기의 진행 상황을 시각화로드되기 전에 결합 반응에 추가 할 수 있습니다. 브로 모 페놀 블루 등 기타 적재 염료 스캔 중에 감지하기 때문에 이미지 분석 (그림 1B)에 방해가됩니다.

EMSAs 일부 예들에서, 핵 추출물 제제가 사용되는 경우 특히 ?...

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토론

fEMSAs 단백질-DNA의 상호 작용을 조사 할 수있는 효율적인 수단이고, DNA의 방사성 표지에 대한 대안이다. 적외선 염료, 형광 염료는 시판되고 있으며, 방사성 표지 DNA와 비교하여 친환경 안전하고 방법을 제공한다. 적외 형광 염료 - 표지 된 올리고 뉴클레오티드를 사용 EMSAs는 postrun 겔 공정 단계를 필요로하므로 다른 DNA 라벨링 기술에 비해 시간과 비용을 저장하지 않는다. 시간은 방사성 EMSAs을 사?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	Bio-Rad	1610158	Acrylamide is harmful and toxic.
6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700-labeled DNA Oligos	Integrated DNA Technologies	Custom DNA oligo	These are referred to as "5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100 μM scale synthesis and HPLC purification.
Klenow Fragment (3'-->5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell	Bio-Rad	1658000FC	This is referred to as a 'mini protein gel system' in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size.
Odyssey CLx Infrared Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey CLx Infrared Imagng System	This is referred to as an 'advanced infrared imaging system' in the manuscript.
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System	This is referred as a 'near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots' in the manuscript.
Image Studio software (version 4.0)	LI-COR Biotechnology	Image Studio software	This is referred to as a 'particular imaging software' in the manuscript.
Orange G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Orange loading dye			0.25% Orange G; 30% Glycerol
0.5x TBE			45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
5x Binding Buffer			50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μg/mL BSA