Un protocole optimisé pour la mobilité électrophorétique Maj Assay utilisant Oligonucleotides infrarouge Fluorescent Dye marqués

Résumé

Nous décrivons ici un protocole optimisé de électrophorétiques Assays Mobility Shift fluorescentes (FEMSA) en utilisant SOX-2 protéines purifiées avec infrarouges fluorescentes sondes d'ADN marquées par un colorant comme une étude de cas pour aborder une question biologique importante.

Résumé

Les analyses électrophorétiques de décalage de mobilité (EMSA) sont un outil instrumental pour caractériser les interactions entre les protéines et leurs séquences d'ADN cibles. Radioactivité a été la principale méthode de marquage d'ADN dans EMSA. Cependant, les progrès récents dans les colorants fluorescents et les méthodes d'analyse ont conduit à l'utilisation d'un marquage fluorescent de l'ADN comme une alternative à la radioactivité pour les avantages de la facilité de manipulation, un gain de temps, ce qui réduit le coût et en améliorant la sécurité. Nous avons récemment utilisé EMSA fluorescent (FEMSA) pour traiter avec succès une question biologique importante. Notre analyse FEMSA fournit une approche mécanistique dans l'effet d'une mutation faux-sens, G73E, dans le HMG facteur de transcription SOX-2 hautement conservée sur la diversification du type de neurone olfactif. Nous avons constaté que mutantes SOX-2 protéines ^G73E modifie l' activité de liaison spécifique de l' ADN, provoquant ainsi olfactive transformation identitaire des neurones. Ici, nous présentons un optimisé et rentable, étape par étape protocolepour FEMSA en utilisant des oligonucléotides marqués par un colorant fluorescent infrarouge contenant les LIM-4 / SOX-2 sites cibles adjacents et purifiés SOX-2 protéines (WT et mutantes SOX-2 protéines ^G73E) comme un exemple biologique.

Introduction

EMSA sont utilisés pour analyser les interactions entre l' ADN et les protéines en utilisant l' électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (PAGE) pour résoudre un mélange d'une protéine d'intérêt et une sonde d'ADN marquée contenant des sites cibles potentiels de la protéine ^1. Une sonde d'ADN liée à la protéine migre plus lentement par rapport à une sonde d'ADN libre, et est donc retardé dans sa migration à travers une matrice de polyacrylamide. Le marquage radioactif de l' ADN par ^32P a été la principale méthode pour la détection dans EMSA. Bien que l'application de radiomarquage dans la recherche biochimique a été bénéfique, les méthodes de remplacement marquage d'ADN avec une sensibilité comparable sont employés en raison des risques pour la santé et la sécurité associés à la radioactivité de manutention. Ces méthodes comprennent la conjugaison de l' ADN avec de la biotine ou la digoxigénine ² (DIG) ³ (dont les deux sont ensuite détectés par des systèmes de chimioluminescence), SYBR coloration verte des gels PAGE ^4,ou la détection directe des conjugués colorant ADN fluorescent en scannant le ^5,6 gel.

Les gels de résolus EMSA en utilisant des sondes d'ADN radiomarquées nécessitent un traitement postrun à travers des films d'autoradiographie ou un système Phosphorimager pour détecter des signaux radioactifs ^1,7. Gels de ² EMSA à l' aide de biotine ou DIG-conjugués sondes d'ADN ³ doivent également être traitées et transférées sur une membrane appropriée et ensuite détectés par chimioluminescence ^6. SYBR coloration verte du gel nécessite une coloration de gel postrun et un scanner fluorescent ^4. Etant donné que les étapes de traitement de gel de postrun sont nécessaires pour EMSA à l'aide des techniques de marquage d'ADN, le gel peut être résolu doser une seule fois. En revanche, les sondes d'ADN marquées avec des fluorophores peuvent être directement détectés dans le gel à l'intérieur des plaques de verre par un scanner. Par conséquent, les interactions ADN-protéines peuvent être surveillés et analysés plusieurs fois à différents moments pendant la course, quiréduit considérablement le temps et le coût. Les conjugués de colorant d' ADN fluorescent qui ont été utilisés pour EMSA comprennent ^6,8 Cy3, Cy5 ^{6,8, 9} fluorescéine, et des colorants fluorescents infrarouges ^4-6.

la régulation transcriptionnelle nécessite des interactions protéine-ADN des facteurs de transcription et de leurs gènes cibles. La coordination de ces interactions génère divers types de cellules à partir d'un ancêtre commun au cours du développement des animaux. Un écran avant génétique impartiale a identifié une mutation faux - sens, G73E, dans le domaine HMG liaison à l' ADN hautement conservée du Caenorhabditis elegans facteur de transcription SOX-2. Les résultats de mutation dans une transformation d'identité de cellule de AWB neurones olfactifs dans AWC neurones olfactifs aux niveaux moléculaires, morphologiques et fonctionnels ^5,10. SOX-2 régule de façon différentielle la différenciation terminale des neurones AWB et AWC en interagissant avec des facteurs de transcription partenaire dépendant du contexte et respectiveDes sites cibles d'ADN. ^5,10 SOX-2 partenaires avec LIM-4 (LHX) dans le terminal AWB différenciation neuronale, tandis que SOX-2 partenaires avec CEH-36 (OTX / OTD) dans le terminal AWC différenciation neuronale. Dosages de rapporteur luciférase montrent que SOX-2 et mutantes SOX-2 protéines ^G73E ont des interactions de coopération avec des cofacteurs de transcription LIM-4 et CEH-36 pour activer un promoteur exprimé dans les neurones AWB et AWC. Cependant, SOX-2 et mutant SOX-2 ^G73E affichent des propriétés d'activation différentielle du promoteur. Pour étudier la base moléculaire des activités de liaison d'ADN dérivées de SOX-2 et SOX-2 ^G73E, fEMSAs ont été réalisées avec ces protéines et leurs sites cibles potentiels.

En premier lieu, une approche de la bio-informatique a été d'identifier les séquences de liaison au sein de la région promotrice de 1 kb utilisée dans le dosage de la luciférase ADN biologiquement pertinent. Depuis plusieurs SOX-2 sites de liaison potentiels étaient présents tout au long du promoteur, nous nous sommes concentréssur SOX-2 sites de liaison prévus adjacents aux sites de liaison putative CEH-36 ou LIM-4 et évolutivement conservées entre les différentes espèces de nématodes. Ces séquences ont été supprimés ou mutés, et ensuite testés in vivo pour leur activité pour exprimer GFP transgènes rapporteurs dans les neurones AWB ou AWC. Grâce à cette approche, nous avons identifié 2-SOX sites cibles potentiels LIM-4 / SOX-2 et CEH-36 / adjacents qui sont spécifiquement nécessaires à l'expression de la GFP dans AWB et AWC neurones, respectivement ^5. Nous avons étudié les différences possibles dans la liaison à l' ADN de SOX-2 et SOX-2 ^G73E utilisant FEMSA avec les CEH-36 / SOX-2 sites cibles adjacents identifiés LIM-4 / SOX-2 et. Notre analyse EMSA a montré que SOX-2 ^G73E ne se lie pas la sonde d'ADN contenant les LIM-4 / SOX-2 sites cibles adjacents (requis pour l' expression génique dans AWB) aussi efficacement que WT SOX-2 ont fait. Cependant, SOX-2 et SOX-2 ^G73E avait pas de différence dans la liaison de la sonde d'ADN contenant le CEH-36 / SOX-2 adjacent site cible (requis pour l' expression génique dans AWC) ^5,10. Notre analyse FEMSA donner un aperçu mécaniste de la nature de la mutation ^G73E SOX-2 affecter l' activité spécifique de liaison à l' ADN de l'identité cellulaire phénotype de transformation AWB à AWC. Ici, nous décrivons un protocole optimisé de FEMSA utilisant 6xHis-SOX-2 purifiés ou 6xHis-SOX-2 ^G73E avec fluorescentes infrarouge sondes d'ADN marquées par un colorant contenant les LIM-4 / SOX-2 sites cibles adjacents comme une étude de cas pour faire face une question biologique importante.

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Protocole

REMARQUE: Les EMSA en utilisant des sondes d'ADN marquées par fluorescence ou d' autres formes d'ADN marqué partagent les mêmes protocoles pour une protéine ou d'une préparation d'extrait cellulaire, la réaction de liaison protéine-ADN, et la préparation du gel PAGE et l' exécution (figure 1A). Les principales différences sont des procédures d'ADN d'étiquetage, post-exécution des étapes de traitement de gel, et les méthodes de détection.

1. Préparation du gel

1. Préparer 5% de gel de Polyacrylamide natif contenant 0,5 x TBE (45 mM de Tris-borate, 1 mM EDTA) et 2,5% de glycerol, en utilisant un système de gel de protéine mini-(8,3 cm de largeur x 7,3 cm d'épaisseur longueur x 0,75 mm).
   1. Afin de préparer 30 ml de solution de gel pour 4 gels, mélanger 5 ml de 30% d'acrylamide / bis (37,5: 1), 3 ml de 5 x TBE (0,45 M de Tris-borate, 10 mM d'EDTA), 1,5 ml de glycerol à 50%, 300 pi de 10% persulfate d' ammonium, 15 pi de TEMED et 20,2 ml de O ₂ ddH soigneusement.
      NOTE: Acrylamide est nocif et toxique, à manipuler avec un équipement de protection individuelle approprié.
2. Jeter immédiatement la solution de gel. Après polymérisation, envelopper les gels dans une pellicule de plastique transparent pré-humidifié avec 0,5x TBE et de les stocker à 4 ° C.

2. Préparation des sondes infrarouge Fluorescent Dye marqués

REMARQUE: Conservez les oligonucléotides marqués par un colorant fluorescent infrarouge loin de la lumière autant que possible au cours de la préparation, le stockage et les expériences.

1. Conception et commande oligonucléotides.
   1. Conception à long oligonucléotide pour ~ 51-mers.
      NOTE: La séquence de la / SOX-2 sonde LIM-4 oligonucléotide longue est TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. oligonucléotides longs ne nécessitent pas PAGE ou une purification par HPLC.
   2. Concevoir des oligonucleotides courts complémentaires pour ~ 14 monomères avec une modification du colorant fluorescent infrarouge à l'extrémité 5 '(5'Dye) et une température de fusion supérieure à 37 ° C.
      NOTE: La séquence d'oligonucléotide courte de la LIM-4 / SOX-2 sonde est 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG. L'échelle de synthèse minimale d'oligonucléotides courts 5'Dye marqués est de 100 nM. Par conséquent, les oligonucléotides nécessitent une purification par HPLC.
2. oligonucléotides Remettre en suspension dans 1 x tampon de Tris-EDTA (TE: 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM) jusqu'à une concentration finale de 100 uM.
3. Recuire (Short 5'Dye) et des oligonucléotides longs.
   1. Mélanger 0,6 pi de 5'Dye-Short oligo (100 uM), 1,2 ul d'oligo long (100 uM) et 28,2 ul de tampon chlorure de sodium-EDTA-Tris (STE: 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM d'EDTA) dans un tube de 1,5 ml.
   2. Placer le tube dans l'eau bouillante pendant 5 min. Eteignez la source de chaleur et de laisser l'eau avec les oligos annelés refroidissent O / N dans l'obscurité.
4. Remplissez surplombs 5 'des recuits longs oligos 5'Dye-Court / avec l'ADN polymérase Klenow pour rendre doubles sondes ADN simple brin.
   1. Préparer la réaction en mélangeant30 pi de recuits courts longs oligos / avec 5'Dye tag, 8,5 pi de 10x tampon Klenow, 1,7 pi de mM dNTP 10, 1,7 pi de Klenow (3 '-> 5' exo) (5 u / ul), et 43,1 ul de ddH ₂ O dans un tube de 0,2 ml PCR.
   2. Incuber 60 min à 37 ° C dans une machine de PCR.
   3. Ajouter 3,4 ul d'EDTA 0,5 M pour arrêter la réaction et inactivent de chaleur à 75 ° C pendant 20 min dans une machine PCR.
5. Les sondes diluées remplis à 0,7 pm (STE) à la concentration finale de 0,1 uM.
6. oligos Conserver à -20 ° C dans l'obscurité jusqu'à l'utilisation. Oligos peuvent être stockés pendant jusqu'à un an dans cet état.
   REMARQUE: Pour générer des sondes d'ADN avec des sites de liaison de mutants, les versions mutantes de longs oligonucléotides sont annelés avec des oligonucléotides courts 5'Dye marqués, suivie de fill-in de 5 'surplombs avec Klenow. Il a été démontré que la sonde avec un brin marqué par une fluorescence infrarougele colorant a seulement 30% de l'intensité de la sonde avec les deux brins marqués avec le colorant. Si l'intensité du signal doit être renforcé, de longues oligos des deux brins sont étiquetés avec des colorants fluorescents infrarouges à extrémités 5 'et recuites pour faire des sondes marquées par un colorant fluorescent infrarouge.

3. Préparation du Unlabeled froid / Sondes (concurrents)

Remarque: Longs oligonucléotides de séquences complémentaires (Long et LongR) ont été annelés pour faire des sondes non marquées pour l'analyse de la concurrence avec des sondes marquées par un colorant fluorescent infrarouge.

1. Mélanger 20 pi de 100 uM Long, 20 pl de 100 uM LongR oligonucléotides, et 60 pi de STE dans un tube de 1,5 ml.
2. Placer le tube dans l'eau bouillante pendant 5 minutes, éteignez la source de chaleur et de laisser l'eau avec les oligos annelés refroidir pendant une nuit.

4. Réaction Binding et Électrophorèse

1. Préparer 1 ml de tampon de liaison 5 fois en mélangeant 50 ul60, de 1 M de Tris-HCl, pH 7,5; 10 pl de 5 M de NaCl; 200 pi de KCl 1 M, 5 pl de 1 M de _MgCl2, 10 pl de 0,5 M d' EDTA, pH 8,0; 5 ul de 1 M DTT; 25 ul de 10 mg / ml de BSA et 695 ul de ddH ₂ O.
   NOTE: Le 5x Binding Buffer peut être aliquote et stocké à -20 ° C. Un autre point à considérer est que les différents facteurs de transcription auront différentes modifications du tampon de liaison.
2. Juste avant la mise en place des réactions de liaison, pré-exécuter le gel de polyacrylamide natif de 5% de 0,5x TBE + 2,5% de glycérol pour éliminer toute trace de persulfate d'ammonium à 80 V pour 30 - 60 min, ou jusqu'à ce que le courant ne varie avec le temps.
3. Mettre en place la réaction de liaison dans un volume final de 20 ul.
   1. Mélanger 4 pi de tampon de liaison 5x, 80-200 ng de protéine purifiée A (50% de glycerol, à savoir, SOX-2), 1 ul de 0,1 uM de colorant sonde conjuguée (concntration: 5 nM), et ddH ₂ O.
   2. Facultatif: Lorsque les concurrents de sondes froides sont nécessaires, ajouter différentes concentrations (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, etc.) des sondes froides.
   3. Facultatif: Lorsque l'interaction entre les protéines A et B ( à savoir, SOX 2 et MFR-4) est testé, ajouter 80-200 ng de protéine purifiée B (50% de glycerol, à savoir MFR-4).
   4. Facultatif: Une fois la préparation d'extrait nucléaire est utilisé et la liaison spécifique de la protéine A est à valider, ajouter un anticorps spécifique à la protéine A (ie, anti-6xHis, anti-FLAG, etc.).
   5. Incuber à R / T dans l'obscurité pendant 15 min.
4. Chargez tout de la réaction de liaison sur le gel et exécuter le gel à 10 V / cm à la distance souhaitée.

5. Imaging

REMARQUE: Le gel a été balayée directement dans les plaques de verre avec un système d'imagerie infrarouge avancé. Par conséquent, le gel peut être résolu de façon répétée et numérisé en outre (figures 1C et 2). Un système d'imagerie fluorescente proche infrarouge principalement pour Western blots a également été testé pour analyser le gel, mais seul le système d'imagerie infrarouge de pointe est capable de scanner le gel avec une bonne résolution. La méthodologie décrite est spécifique à un logiciel particulier d'imagerie infrarouge, bien que d'autres logiciels peuvent être utilisés.

1. Nettoyer le lit du scanner avec ddH ₂ O et séchez bien avant la numérisation. Essuyez les plaques de verre du gel et placer les plaques contenant le gel sur la vitre du scanner.
2. Ouvrez le logiciel d'imagerie infrarouge et passez à l'onglet «Acquire». Lorsque la plaque mince (1 mm) est placé sur la vitre du scanner, utilisez les paramètres de canal: 700, Intensité: Auto, Résolution: 169 um, Qualité: moyenne, et Focus offset: 1,5 mm. Lorsque la plaque plus épaisse (3 mm) est placé sur la vitre du scanner, utilisez les paramètres de canal: 700, Intensité: Auto, Résolution: 84 pm, Qualité: moyenne, et Focus offset: 3,5 mm. décalage de focalisation dépend de lal'épaisseur de la plaque de verre.
3. Sélectionnez la zone que le gel occupe sur le scanner. Cliquez sur 'Start' pour lancer la numérisation.
4. Répétez l'électrophorèse et de numérisation en outre, si nécessaire.

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Résultats

Orange G colorant de chargement (6x: 0,12 g d'orange G dans 100 ml de glycerol à 30%) peut être ajouté à la réaction de liaison avant le chargement de visualiser la progression de l'électrophorèse. D' autres colorants de chargement , y compris le bleu de bromophénol seront détectés lors de la numérisation et donc interférer avec l' analyse d'image (figure 1B).

Dans certains cas ...

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Discussion

fEMSAs sont un outil efficace pour étudier les interactions protéine-ADN, et sont une alternative à un marquage radioactif de l'ADN. Les colorants fluorescents tels que les colorants infrarouges sont disponibles dans le commerce, et de fournir une méthode plus sûre et plus respectueuse de l'environnement par rapport à l'étiquetage radioactif de l'ADN. EMSA utilisant fluorescentes infrarouge oligonucléotides marqués par un colorant ne nécessitent pas d'étapes postrun de traitement de gel, e...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	Bio-Rad	1610158	Acrylamide is harmful and toxic.
6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700-labeled DNA Oligos	Integrated DNA Technologies	Custom DNA oligo	These are referred to as "5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100 μM scale synthesis and HPLC purification.
Klenow Fragment (3'-->5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell	Bio-Rad	1658000FC	This is referred to as a 'mini protein gel system' in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size.
Odyssey CLx Infrared Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey CLx Infrared Imagng System	This is referred to as an 'advanced infrared imaging system' in the manuscript.
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System	This is referred as a 'near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots' in the manuscript.
Image Studio software (version 4.0)	LI-COR Biotechnology	Image Studio software	This is referred to as a 'particular imaging software' in the manuscript.
Orange G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Orange loading dye			0.25% Orange G; 30% Glycerol
0.5x TBE			45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
5x Binding Buffer			50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μg/mL BSA