赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを使用したゲルシフトアッセイのために最適化されたプロトコル

要約

ここで重要な生物学的質問に取り組むためのケーススタディとして、赤外蛍光色素標識DNAプローブと一緒に精製されたSOX-2タンパク質を用いた蛍光電気泳動移動度シフトアッセイ（FEMSA）の最適化されたプロトコルを記述します。

要約

電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）は、タンパク質とその標的DNA配列間の相互作用を特徴付けるための器械ツールです。放射能はEMSAsにおけるDNA標識の主な方法でした。しかしながら、蛍光色素及びスキャン方法における最近の進歩は、時間を節約し、コストを低減し、安全性を向上させる、容易な取り扱いの利点のための放射能の代替として、DNAの蛍光タグの使用を促してきました。我々は最近、正常に重要な生物学的質問に対処するために、蛍光EMSA（FEMSA）を使用しています。私たちのFEMSA分析は、嗅覚ニューロンの種類の多様化に高度に保存されたHMG転写因子SOX-2に、G73E、ミスセンス変異の効果に機械的な洞察を提供します。我々は、変異SOX-2 ^{G73Eタンパク質}は、それによって嗅覚ニューロンの恒等変換を引き起こし、特定のDNA結合活性を変化させることがわかりました。ここでは、最適化され、費用対効果のステップバイステップのプロトコルを提示しますFEMSAのための生物学的な例として、LIM-4 / SOX-2に隣接する標的部位および精製SOX-2タンパク質（WTおよび変異体SOX-2 ^{G73Eタンパク質} ）を含む赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを使用。

概要

EMSAsは、目的のタンパク質とタンパク質¹の潜在的な標的部位を含む標識DNAプローブの混合物を解決するために、ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）を使用して、DNAとタンパク質間の相互作用を分析するために使用されます。タンパク質と結合したDNAプローブは、遊離DNAプローブに比べて遅く移動し、ポリアクリルアミドマトリックスを通るその移動にしたがって、遅角されます。 ³² PによるDNAの放射性標識はEMSAsでの検出のための主要な方法でした。生化学研究における放射性標識の適用が有益であったが、同程度の感度で代替DNA標識の方法が原因で、放射能の取り扱いに関連した健康と安全リスクに採用されています。これらの代替方法は、ビオチン²またはジゴキシゲニン^{（DIG）、3（}どちらも、その後の化学発光システムにより検出される）とDNAの結合、PAGEゲル⁴のSYBRグリーン染色を含みますまたはゲル^5,6をスキャンすることによって、DNA蛍光色素コンジュゲートの直接検出。

放射性標識されたDNAプローブを使用してEMSAsの解決されたゲルは、放射性信号^1,7を検出するために、オートラジオグラフィーのフィルムまたはホスホイメージャシステムを通じてポストラン処理を必要とします。ビオチン²またはDIG-共役³ DNAプローブを使用してEMSAsのゲルはまた、処理され、適当な膜に転写した後、化学発光⁶によって検出されなければなりません。ゲルのSYBRグリーン染色は、ポストランゲル染色および蛍光スキャナ^4が必要です。ポストランゲル処理ステップは、これらのDNA標識技術を使用してEMSAsために必要とされるので、解像ゲルは一度だけ測定することができます。対照的に、フルオロフォアで標識されたDNAプローブを直接スキャナによるガラス板内部のゲル中で検出することができます。従って、DNA-タンパク質相互作用をモニターすることができると、実行中の異なる時点で複数回アッセイしますかなりの時間とコストを削減します。 EMSAsために使用されているDNA蛍光色素コンジュゲートのCy3 ^6,8、Cy5の^6,8、フルオレセイン^9、及び赤外蛍光色素^4-6を含みます。

転写調節は、転写因子とその標的遺伝子のタンパク質-DNA相互作用を必要とします。これらの相互作用の調整は、動物の開発中に、共通の祖先から、多様な細胞型を生成します。公平なフォワード遺伝学的スクリーニングは、 シノラブディスエレガンス転写因子SOX-2の高度に保存されたHMG DNA結合ドメインにおいて、ミスセンス変異、G73Eを同定しました。 、分子形態学的および機能レベル^5,10でAWC嗅覚ニューロンへのAWB嗅覚ニューロンの細胞恒等変換における突然変異の結果。 SOX-2示差コンテキスト依存パートナー転写因子と相互作用することによって、AWBとAWCニューロンの分化を調節し、各DNA標的部位^5,10。 SOX-2端子AWB神経分化におけるLIM-4（LHX）と提携し、SOX-2端子AWCニューロンの分化におけるCEH-36（OTX / OTD）とのパートナーが。ルシフェラーゼレポーターアッセイは示しているが、そのSOX-2及び変異SOX-2 ^{G73Eタンパク質}はAWBとAWCニューロンに発現し、プロモーターを活性化する転写補助因子LIM-4とCEH-36との協力の相互作用を持っています。しかし、SOX-2及び変異SOX-2 ^G73Eは、プロモーターの差動活性化特性を示しました。 SOX-2、SOX-2 ^G73Eの差動DNA結合活性の分子的基礎を調査するために、fEMSAsは、これらのタンパク質およびそれらの潜在的な標的部位を用いて行きました。

まず、バイオインフォマティクスアプローチは、ルシフェラーゼアッセイに使用1kbのプロモーター領域内の生物学的に関連したDNA結合配列を同定するために採取しました。複数の潜在的SOX-2結合部位がプロモーター全体に存在していたので、私たちは集中しました推定上CEH-36またはLIM-4結合部位に隣接し、進化的に多様な線虫種間で保存予測SOX-2結合部位に。これらの配列は、欠失または変異し、及びその後AWBまたはAWCニューロンにおけるGFPレポーター導入遺伝子を発現するそれらの活性についてインビボで試験しました。このアプローチを通じて、我々は、具体的にはAWBとAWCニューロン、それぞれ⁵におけるGFPの発現に必要とされるLIM-4 / SOX-2電位とCEH-36 / SOX-2に隣接する標的部位を同定しました。私たちは、SOX-2およびSOX-2 LIM-4 / SOX-2同定し、CEH-36 / SOX-2に隣接する標的部位でFEMSAを使用して^G73EのDNA結合の潜在的な違いを調べました。私たちのEMSA分析は、SOX-2 ^G73Eは同様の効率WT SOX-2がしたように（AWBにおける遺伝子発現のために必要）LIM-4 / SOX-2に隣接する標的部位を含むDNAプローブを結合しなかったことを示しました。しかし、SOX-2およびSOX-2 ^G73Eは含むDNAプローブの結合には差がありませんでしたCEH-36 / SOX-2^5,10（AWCにおける遺伝子発現のために必要）djacent標的部位。私たちのFEMSAは、AWBツーAWC細胞恒等変換の表現型に特異的なDNA結合活性に影響を与えることにSOX-2 ^{G73E突然変異}の性質に機械的な洞察を提供する分析します。ここで、私たちは一緒に取り組むためのケーススタディとしてLIM-4 / SOX-2に隣接する標的部位を含む赤外蛍光色素標識DNAプローブを用いて精製した6xHis-SOX-2またはの6xHis-SOX-2 ^G73Eを使用してFEMSAの最適化されたプロトコルを記述する重要な生物学的質問。

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プロトコル

注：蛍光標識したDNAプローブまたは標識されたDNAの他の形態を使用EMSAsは、タンパク質または細胞抽出物の調製、タンパク質-DNA結合反応、およびPAGEゲルを調製するために同じプロトコルを共有し（ 図1A）を実行します 。主な違いは、DNA標識手順、ポストランゲル処理工程、および検出方法です。

1.ジェルの準備

1. ミニタンパク質ゲルシステム（8.3センチメートル幅X 7.3センチメートル縦x 0.75ミリメートルの厚さ）を使用して、0.5倍のTBE（45 mMトリス - ホウ酸、1mMのEDTA）および2.5％グリセロールを含む5％未変性ポリアクリルアミドゲルを準備します。
   1. 、5×TBEの、3ミリリットル（0.45 Mトリス - ホウ酸、10mMのEDTA）、50％グリセロールの1.5 mLを4：ゲル用のゲル溶液の30ミリリットルを調製するために、30％アクリルアミド/ビスの5ミリリットル（1 37.5）を混ぜます10％アンモニウム過硫酸塩の300μL、TEMEDの15μL、そして徹底的にのddH ₂ Oの20.2 mLです。
      注：アクリルアミドは有害で毒性である、適切な個人保護具を使用して処理します。
2. すぐにゲル溶液をキャストします。重合後、0.5×TBEで予め湿らせラップし、4℃で保管し、透明なプラスチックでゲルをラップします。

赤外蛍光色素で標識されたプローブの調製

注：準備、保管、および実験中に離れて、できるだけ多くの光から赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを保管してください。

1. デザインやオーダーオリゴヌクレオチド。
   1. 〜51マーのための長いオリゴヌクレオチドを設計します。
      注：LIM-4 / SOX-2プローブの長いオリゴヌクレオチド配列はTATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCCです。長いオリゴヌクレオチドは、PAGEまたはHPLC精製を必要としません。
   2. 5 '末端（5'Dye）と37℃以上の溶融温度での赤外蛍光色素修飾を有する〜14量体のための補完的な短いオリゴヌクレオチドを設計します。
      注：LIM-4 / SOX-の短いオリゴヌクレオチド配列2プローブは5'Dye-GGGAGAAGATTTTGです。 5'Dye標識した短いオリゴヌクレオチドの最小の合成スケールは100nmです。したがって、オリゴヌクレオチドはHPLC精製を必要とします。
2. 1×トリスEDTA緩衝液中で再懸濁したオリゴヌクレオチド（TE：10mMのトリス-HCl、pH8.0の、1mMのEDTA）、100μMの最終濃度まで。
3. ショート（5'Dye）とロングオリゴヌクレオチドをアニール。
   1. ; 10mMトリス - 塩酸、pHを100mMのNaCl：（100μM）、ロングオリゴの1.2μL（100μM）、および塩化ナトリウム、トリス-EDTA緩衝液の28.2μL（STE 5'Dye-ショートオリゴの0.6μLを混ぜます8.0; 1mMのEDTA）1.5 mLチューブインチ
   2. 5分間沸騰水中でチューブを置きます。熱源の電源をオフにして、アニールしたオリゴは、暗闇の中でO / Nを冷却して水をしてみましょう。
4. 二本鎖DNAプローブを作るためにクレノウDNAポリメラーゼによるアニール5'Dye-ショート/ロングオリゴの5 'オーバーハングを入力してください。
   1. 混合して反応を準備します5'Dyeタグとアニールショート/ロングオリゴの30μL、8.5μLの10×クレノウ緩衝液、10mMのdNTPの1.7μL、1.7クレノウのμL（3 ' - > 5'エキソ - ）（5 U /μL）、および0.2mLのPCRチューブ内のddH ₂ Oの43.1μL。
   2. PCR機で37℃で60分間インキュベートします。
   3. 反応して熱を停止するために3.4μLの0.5 M EDTAを追加PCR装置で20分間75℃で不活性化します。
5. 0.1μMの最終濃度STEで塗りつぶされたプローブ（0.7μM）を希釈します。
6. 使用する直前まで、暗所で-20℃で保存オリゴ。オリゴは、この状態で年間まで保存することができます。
   注：変異体の結合部位を有するDNAプローブを生成するには、長いオリゴヌクレオチドの変異体バージョンは、クレノウで5 'オーバーハングのフィルインが続く5'Dye標識短いオリゴヌクレオチドでアニールされます。一方の鎖を有するプローブは、赤外蛍光で標識されたことが示されています色素は、色素で標識された両方の鎖を有するプローブのわずか30％の強度を有します。信号強度を強化する必要がある場合、両方の鎖の長いオリゴの5 '末端に赤外蛍光色素で標識し、赤外蛍光色素で標識されたプローブを作製するためにアニールされます。

ラベルなし/コールドプローブ（競技者）の調製

注：相補的な配列（ロングとLongR）のロングオリゴヌクレオチドは、赤外蛍光色素で標識したプローブとの競合分析のための非標識プローブを作るためにアニールしました。

1. 1.5 mLチューブに100μMのロングの20μL、100μMLongRオリゴヌクレオチドの20μL、およびSTEの60μLを混ぜます。
2. 、5分間沸騰水中でチューブを置き、熱源をオフにして、アニールしたオリゴは、一晩冷却して水をしてみましょう。

4.結合反応と電気泳動

1. 50μLを混合して5倍の結合緩衝液を1mLの準備1 MのTris-HCl、pH7.5での、60。 5 M NaClを10μL; 1 M KClを200μL、1 MのMgCl _2、0.5 M EDTA、pHが8.0の10μLの5μL; 1 M DTTの5μL; ddH ₂ Oの25の10mg / mLのBSAのμL、および695μL
   注：5×結合緩衝液を等分し、-20℃で保存することができます。考慮すべきもう一つのポイントは、異なる転写因子が結合緩衝液とは異なる修飾を有するということです。
2. 右結合反応を設定する前に、30、80 Vで過硫酸アンモニウムのすべての痕跡を除去するために+ 2.5％グリセロール0.5×TBEで5％未変性ポリアクリルアミドゲルを事前に実行していない - 60分、または現在はもはや時間的に変化するまで。
3. 20μLの最終容量で結合反応を設定します。
   1. 4 5×結合緩衝液のμL、80ミックス-精製されたタンパク質Aをngの200（ すなわち 、50％グリセロール中でSOX-2）、0.1μM色素共役プローブの1μL（最終濃度entration：5 nM）を、とのddH ₂ O
   2. オプション：コールドプローブ競合他社が必要な場合は、様々な濃度の冷プローブの（2倍、10倍、25倍、50倍、100倍、 など ） を追加します。
   3. オプション：タンパク質AとBとの間の相互作用（ すなわち 、SOX-2およびLIM-4）試験される場合、80の追加-精製タンパク質B ngの200（ すなわち 、50％グリセロール中で、LIM-4）。
   4. オプション：核抽出物調製物を用いて、プロテインAの特異的な結合された場合、タンパク質A（ すなわち、抗の6xHis、抗FLAG など ）に特異的な抗体を追加し、検証します。
   5. 15分間、暗所でのR / Tでインキュベートします。
4. ゲルに結合反応のすべてをロードし、所望の距離に10 V / cmのでゲルを実行します。

5.イメージング

NOTE：ゲルは、高度な赤外線撮像システムを用いてガラス板に直接スキャンしました。したがって、ゲルをさらに解決することができ、繰り返し走査（ 図1Cおよび 2）。主に、ウェスタンブロットのために、近赤外蛍光イメージングシステムはまた、ゲルをスキャンするために試験したが、唯一の高度な赤外線撮像システムは、良好な分解能を有するゲルを走査することができました。他のソフトウェアパッケージを使用してもよいが、説明した方法は、特定の赤外線イメージングソフトウェアに固有です。

1. スキャン前のddH ₂ Oおよびドライウェルとスキャナの床を清掃してください。ゲルのガラスプレートを乾燥し、スキャナベッド上でゲルを含むプレートを配置拭いてください。
2. 赤外線イメージングソフトウェアを開き、「獲得」タブに移動します。薄いプレート（1ミリメートル）をスキャナベッド上に置かれた場合、チャンネルの設定を使用：700、輝度：オート、解像度：169μmで、品質：中、フォーカスオフセット：1.5ミリメートルを。厚い板（3ミリメートル）がスキャナベッド上に置かれた場合、チャンネルの設定を使用：700、輝度：オート、解像度：84μmで、品質：中、フォーカスオフセット：3.5ミリメートル。フォーカスオフセットに依存しますガラス板の厚さ。
3. ゲルは、スキャナの占有領域を選択します。スキャンを開始するには[スタート]をクリックします。
4. 電気泳動を繰り返し、さらに必要に応じてスキャンします。

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結果

オレンジGローディングダイ（6×100 mLの30％グリセロール0.12 gでオレンジG）は、電気泳動の進行を視覚化するためにロードする前に、結合反応に添加することができます。ブロモフェノールブルーを含む他のローディング色素は、スキャン中に検出されたため、画像解析（ 図1B）に干渉されます。

EMSAsのいく?...

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ディスカッション

fEMSAs、タンパク質-DNA相互作用を研究するための効率的なツールであり、DNAの放射性標識に対する代替です。赤外線染料などの蛍光染料は、市販されており、放射性DNA標識と比較して、より安全で環境に優しい方法を提供します。赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを用いてEMSAsは、ポストランゲル処理工程を必要とするため、他のDNA標識技術に比べて、時間とコストを節約しない...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	Bio-Rad	1610158	Acrylamide is harmful and toxic.
6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700-labeled DNA Oligos	Integrated DNA Technologies	Custom DNA oligo	These are referred to as "5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100 μM scale synthesis and HPLC purification.
Klenow Fragment (3'-->5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell	Bio-Rad	1658000FC	This is referred to as a 'mini protein gel system' in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size.
Odyssey CLx Infrared Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey CLx Infrared Imagng System	This is referred to as an 'advanced infrared imaging system' in the manuscript.
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System	This is referred as a 'near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots' in the manuscript.
Image Studio software (version 4.0)	LI-COR Biotechnology	Image Studio software	This is referred to as a 'particular imaging software' in the manuscript.
Orange G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Orange loading dye			0.25% Orange G; 30% Glycerol
0.5x TBE			45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
5x Binding Buffer			50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μg/mL BSA