Оптимизированный протокол для электрофоретической подвижности Сдвиг Пробирной с помощью ИК-флуоресцентным красителем-меченных

Резюме

Здесь мы опишем оптимизированный протокол флуоресцентных электрофоретической подвижности (анализах сдвига FEMSA) с использованием очищенного SOX-2 белки вместе с инфракрасным флуоресцентным красителем-меченых зондов ДНК в качестве примера для решения важный биологический вопрос.

Аннотация

Электрофоретической подвижности сдвига анализа (EMSA) являются инструментальным средством для характеристики взаимодействия белков и их последовательностей ДНК-мишени. Радиоактивность была преобладающим методом мечения ДНК в EMSAs. Тем не менее, последние достижения в области флуоресцентных красителей и методы сканирования побудили применение флуоресцентного мечения ДНК в качестве альтернативы радиоактивности за преимущества простоты управления, экономии времени, снижения затрат и повышению безопасности. Недавно мы использовали флуоресцентный EMSA (FEMSA) успешно решать важный биологический вопрос. Наш анализ FEMSA обеспечивает механистического представление о влиянии миссенс-мутации, G73E, в высококонсервативной ГМГ фактора транскрипции SOX-2 по типу нейрон диверсификации обонятельной. Мы обнаружили , что мутантные SOX-2 ^G73E белок изменяет специфической ДНК связывающей активностью, вызывая тем самым обонятельный нейрон тождественное преобразование. Здесь мы представляем оптимизированные и экономически эффективный шаг за шагом протоколадля FEMSA с помощью инфракрасного флуоресцентного красителя-меченых олигонуклеотидов , содержащих LIM-4 / SOX-2 смежных целевых сайтов и очищенные SOX-2 белки (WT и мутантных SOX-2 ^G73E белки) в качестве биологического примера.

Введение

EMSAs используются для анализа взаимодействия между ДНК и белками, используя нативный электрофорезом на геле полиакриламида (СТР) , чтобы разрешить смесь интересующего белка и меченой ДНК зонда , содержащего потенциальные целевые участки белка ^1. ДНК-зонд связан с белком будет мигрировать медленнее по сравнению со свободным ДНК-зондом, и, следовательно, задерживается в его миграции через матрицу полиакриламида. Радиоактивной ДНК ³² Р является основным методом для обнаружения в EMSAs. Хотя применение радиомечения в биохимических исследованиях было выгодным, методы альтернативной маркировки ДНК с сопоставимой чувствительностью в настоящее время используются в связи с риском для здоровья и безопасности, связанных с обработкой радиоактивностью. Эти альтернативные методы включают конъюгацию ДНК с биотином ² или дигоксигенином (DIG) ³ (оба из которых затем детектируется системами хемилюминесцентные), SYBR зеленый окрашивание ДСН ^4,или прямое обнаружение ДНК-флуоресцентного красителя конъюгатов путем сканирования геля ^5,6.

Разрешенные гели EMSAs с использованием радиоактивно меченых зондов ДНК требуют postrun обработки через авторадиографии пленок или систему Phosphorimager для обнаружения радиоактивных сигналов ^1,7. Гели EMSAs с использованием биотин - ² или DIG-конъюгированные зондов ³ ДНК также должны быть обработаны и переданы на подходящую мембрану , а затем детектируется хемилюминесценции ^6. SYBR зеленого окрашивания геля требует postrun геля окрашивания и флуоресцентный сканер ^4. Поскольку этапы обработки postrun гель необходимы для EMSAs с помощью этих методов мечении ДНК, разрешенное гель можно анализировать только один раз. В отличие от этого, ДНК-зондов, меченных флуорофоров могут быть непосредственно обнаружены в геле внутри стеклянных пластин с помощью сканера. Таким образом, ДНК-белковых взаимодействий можно контролировать и несколько раз в различные моменты времени оценивали во время бега, котораязначительно сокращает затраты времени и средств. ДНК-флуоресцентный краситель конъюгаты , которые были использованы для EMSAs включают Су3 ^6,8, Су5 ^6,8, флуоресцеин ⁹ и инфракрасные флуоресцентные красители ^4-6.

Регуляция транскрипции требует белок-ДНК взаимодействия факторов транскрипции и их генов-мишеней. Координация этих взаимодействий порождает различные типы клеток от общего предка во время развития животных. Объективный вперед генетический экран был выявлен миссенс мутации, G73E, в высоко законсервированной HMG ДНК-связывающим доменом Caenorhabditis фактора транскрипции Элеганс SOX-2. Мутация в трансформации идентичности клеток из AWB обонятельных нейронов в текущем AWC обонятельных нейронов на молекулярном, морфологических и функциональных уровнях ^5,10. SOX-2 дифференцированно регулирует терминальную дифференцировку AWB и AWC нейронов путем взаимодействия с контекстно-зависимых факторов транскрипции партнер и соответствующийДНК - мишени сайты ^5,10. SOX-2 партнеров с LIM-4 (LHX) в терминале AWB дифференцировки нейронов, в то время как SOX-2 партнеров с ЦВЗ-36 (OTX / ОДТ) в терминале AWC дифференцировки нейронов. Люциферазы анализы показывают , что SOX-2 и мутантные SOX-2 ^G73E белки имеют кооперативные взаимодействия с транскрипционных кофакторов LIM-4 и ЦВЗ-36 , чтобы активировать промотор , выраженный в AWB и AWC нейронов. Тем не менее, SOx-2 и мутант НОСКОВ-2 ^G73E отображаются свойства дифференциальной активацию промотора. Для изучения молекулярной основы дифференциальной ДНК - связывающим деятельности SOX-2 и SOX-2 ^G73E, fEMSAs были выполнены с этими белками и их потенциальных сайтов - мишеней.

Во-первых, биоинформатики подход был использован для идентификации биологически активные к ДНК последовательности в пределах области промотора 1 кб, используемого в анализе люциферазы. Поскольку несколько потенциальных SOX-2 сайты связывания присутствовали на протяжении промотора, мы сфокусировалина предсказанных SOX-2 связывающих участков, прилегающих к предполагаемому ЦВЗ-36 или LIM-4 сайты связывания и эволюционно консервативными между различными видами нематод. Эти последовательности были удалены или мутируют, и затем испытывали в естественных условиях для их деятельности , чтобы выразить GFP репортер трансгенов в AWB или AWC нейронов. Благодаря такому подходу, мы определили потенциальные LIM-4 / SOX-2 и Чех-36-2 SOX соседние целевые сайты /, которые конкретно необходимы для экспрессии GFP в AWB и AWC нейронов, соответственно ^5. Мы исследовали потенциальные различия в ДНК связывания SOX-2 и SOX-2 ^G73E использованием FEMSA с выявленными LIM-4 / SOX-2 и ЦВЗ-36 / SOX-2 смежных целевых сайтов. Наш анализ показал , что EMSA SOX-2 ^G73E не связывает ДНК - зонд , содержащий LIM-4 / SOX-2 смежных целевых сайтов (необходим для экспрессии генов в AWB) столь же эффективно , как WT SOX-2 сделал. Тем не менее, SOX-2 и SOX-2 ^G73E не было никакой разницы в связывании ДНК - зонд , содержащий ЦВЗ-36 / SOX-2 аdjacent целевой сайт (необходим для экспрессии генов в AWC) ^5,10. Наш FEMSA анализ обеспечивают механистической понимание природы ^G73E мутации SOX-2 в воздействии специфической ДНК - связывающей активности для идентичности клеточного фенотипа трансформации AWB-к-AWC. Здесь мы опишем оптимизированный протокол FEMSA с использованием очищенных 6xHis-SOX-2 или 6xHis-SOX-2 ^G73E вместе с ИК - флуоресцентных зондов ДНК красителя-меченый , содержащих LIM-4 / SOX-2 смежных целевых сайтов в качестве тематического исследования для решения важный биологический вопрос.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: EMSAs с использованием флуоресцентно меченых зондов ДНК или другие формы меченой ДНК разделяют одни и те же протоколы для белка или препарата клеточного экстракта, белок-ДНК реакции связывания и подготовки PAGE гель и работает (рис 1А). Основные отличия процедуры ДНК маркировки, этапы обработки геля после бежать, и методы обнаружения.

1. Гель Приготовление

1. Готовят 5% геля, содержащего нативный полиакриламидный 0.5x TBE (45 мМ Трис-борат, 1 мМ ЭДТА) и 2,5% глицерина, с использованием мини-гель системы белка (8,3 см ширина х 7,3 см толщина длина х 0,75 мм).
   1. Для приготовления 30 мл раствора геля для 4 гелей, смешать 5 мл 30% акриламид / бис (37.5: 1), 3 мл 5х КЭ (0,45 М Трис-борат, 10 мМ ЭДТА), 1,5 мл 50% глицерине, 300 мкл 10% персульфата аммония, 15 мкл TEMED, и 20,2 мл DDH ₂ O тщательно.
      Примечание: акриламид вреден и токсичен, ручка с соответствующими средствами индивидуальной защиты.
2. Cast раствора геля сразу. После полимеризации, обертывают гели в прозрачной пластиковой пленкой предварительно смачивать 0,5 × КЭ и хранить их при температуре 4 ° С.

2. Получение ИК-флуоресцентным красителем-меченых зондов

Примечание: Держите инфракрасные флуоресцентным красителем-меченных в защищенном от света как можно больше во время приготовления, хранения и экспериментов.

1. Дизайн и порядок олигонуклеотиды.
   1. Дизайн длинный олигонуклеотид в течение ~ 51-меров.
      Примечание: Длинная последовательность олигонуклеотида / SOX-2 зонда LIM-4 TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. Длинные олигонуклеотиды не требуют PAGE или очистки ВЭЖХ.
   2. Разработка дополнительных коротких олигонуклеотидов в течение ~ 14-меров с модификацией красителем инфракрасного флуоресцентного на 5'-конца (5'Dye) и температурой плавления выше 37 ° С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: короткая последовательность олигонуклеотида LIM-4 / SOX-2 зонд 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG. Минимальный масштаб синтеза 5'Dye-меченых коротких олигонуклеотидов составляет 100 нМ. Таким образом, олигонуклеотиды требуют очистки ВЭЖХ.
2. Ресуспендируют олигонуклеотиды в 1x Трис-ЭДТА буфере (ТЕ: 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 1 мМ ЭДТА) до конечной концентрации 100 мкМ.
3. Отжиг Short (5'Dye) и длинные олигонуклеотиды.
   1. Смешайте 0,6 мкл 5'Dye-Short олиго (100 мкМ), 1,2 мкл олиго (Long 100 мкМ), и 28,2 мкл натрия хлорид-трис-ЭДТА буфера (СТЭ: 100 мМ NaCl, 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0; 1 мМ ЭДТА) в 1,5 мл трубки.
   2. Поместите пробирку в кипящей воде в течение 5 мин. Выключите источник тепла и дайте воде с отожженные олигонуклеотиды охлаждения O / N в темноте.
4. Заполните свесами 5 'отожженных 5'Dye-короткий / длинный олигомеров с Кленова ДНК-полимеразы, чтобы двухцепочечные ДНК-зондов.
   1. Готовят реакцию путем смешивания30 мкл размороженного коротких / длинных олигомеров с 5'Dye теге, 8,5 мкл 10х буфера Кленова, 1,7 мкл 10 мМ дНТФ, 1,7 мкл Кленова (3 '-> 5' экзо-) (5 ед / мкл), и 43,1 мкл DDH ₂ O в 0,2 мл ПЦР - пробирку.
   2. Инкубировать 60 мин при 37 ° С в машине ПЦР.
   3. Добавить 3.4 мкл 0,5 М ЭДТА, чтобы остановить реакцию, и нагревать инактивированную при 75 ° С в течение 20 мин в машине ПЦР.
5. Развести заполненные зондов (0,7 мкМ) в СТЭ для конечной концентрации 0,1 мкМ.
6. Храните олигонуклеотиды при -20 ° С в темноте до готовности к использованию. Олигонуклеотиды могут храниться до года в этом состоянии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для создания ДНК-зондов с мутантными сайтами связывания, мутантные варианты длинных олигонуклеотидов отжигали с 5'Dye-меченых коротких олигонуклеотидов, а затем заполняются в 5 'свесы Кленова. Было показано, что зонд с одной цепью маркированы с инфракрасным флуоресцентнымкраситель имеет только 30% интенсивность зонда с обеих нитей, меченные красителем. Если интенсивность сигнала должна быть усилена, длинные олигонуклеотиды обеих нитей помечены с помощью инфракрасных флуоресцентных красителей на 5 'концах и отжигают, чтобы сделать инфракрасный флуоресцентный краситель меченных зондов.

3. Подготовка немеченых / хол Зонды (конкурентный)

Примечание: Длинные олигонуклеотиды комплементарных последовательностей (длинные и LongR) отжигали сделать немаркированные зондов для анализа конкуренции с помощью инфракрасного флуоресцентного красителя-меченых зондов.

1. Смешайте 20 мкл 100 мкМ в длину, 20 мкл 100 мкМ LongR олигонуклеотиды, и 60 мкл СТЭ в 1,5 мл трубки.
2. Поместите пробирку в кипящей воде в течение 5 минут, выключите источник тепла и дайте воде с отожженные олигонуклеотиды остыть в течение ночи.

4. Обязательность реакции и электрофорез

1. Подготовка 1 мл 5-кратного буфера для связывания путем смешивания 50 мкл60; 1 М Трис-HCl, рН 7,5; 10 мкл 5 М NaCl; 200 мкл 1 М KCl, 5 мкл 1 М MgCl _2, 10 мкл 0,5 М ЭДТА, рН 8,0; 5 мкл 1 М DTT; 25 мкл 10 мг / мл бычьего сывороточного альбумина, и 695 мкл DDH ₂ O.
   Примечание: 5х буфера для связывания может быть аликвоты и хранили при -20 ° С. Еще один момент, рассмотреть вопрос о том, что различные факторы транскрипции будут иметь различные модификации в связывающем буфере.
2. Право перед установкой реакции связывания, предварительно не запускать нативный полиакриламидный гель, 5% 0,5 × КЭ + 2,5% глицерина, чтобы удалить все следы персульфата аммония при 80 В в течение 30 - 60 мин, или до тех пор пока ток больше не изменяется со временем.
3. Настройка реакции связывания в конечном объеме 20 мкл.
   1. Смешать 4 мкл 5 - кратного буфера для связывания, 80 - 200 нг очищенного белка A (в 50% глицерине, то есть, SOx-2), 1 мкл 0,1 мкМ Краситель-конъюгированного зонда (конечная концentration: 5 нМ), и DDH ₂ O.
   2. Дополнительно: Когда конкуренты холодный зонд требуется, добавлять различные концентрации (2x, 10x, 25x, 50x, 100x и т.д.) холодных зондов.
   3. Дополнительно: Когда взаимодействие между белками А и В (то есть, SOx-2 и LIM-4) проверяется, добавить 80 - 200 нг очищенного белка B (в 50% глицерина, т.е. LIM-4).
   4. Дополнительно: Когда препарат ядерный экстракт используется и специфическое связывание белка А быть подтверждено, добавляют антитела , специфичные к протеином А (то есть, анти-6xHis, анти-FLAG, и т.д.).
   5. Инкубировать при R / T в темноте в течение 15 мин.
4. Загрузите все реакции связывания на гель и запустить гель при 10 В / см до требуемого расстояния.

5. обработки изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Гель сканировали непосредственно в стеклянные пластины с передовой инфракрасной системы визуализации. Таким образом, гель может быть решена в дальнейшем и сканировать несколько раз (Рисунки 1C и 2). Ближнего инфракрасного флуоресцентного система формирования изображения в основном для Вестерн-блоттинга также была испытана для сканирования геля, но только усовершенствованная инфракрасная система визуализации была способна сканировать гель с хорошим разрешением. Методика описана является специфическим для конкретного инфракрасного ПО для обработки изображений, хотя могут использоваться и другие программные пакеты.

1. Очистите слой сканера с DDH ₂ O и хорошо высохнуть перед сканированием. Насухо протирать стеклянные пластины геля и помещают пластины, содержащие гель на планшете сканера.
2. Откройте инфракрасное программное обеспечение визуализации и перейдите на вкладку 'Acquire'. Когда тоньше пластина (1 мм) помещается на планшете сканера, используйте настройки канала: 700, Интенсивность: Авто, разрешение: 169 мкм, Качество: среднее, и фокус смещение: 1,5 мм. Когда толще пластины (3 мм) помещается на планшете сканера, используйте настройки канала: 700, Интенсивность: Авто, разрешение: 84 мкм, Качество: среднее, и смещение фокуса: 3,5 мм. Направление смещения зависит оттолщина стеклянной пластины.
3. Выберите область, что гель занимает на сканере. Нажмите кнопку "Пуск", чтобы начать сканирование.
4. Повторите электрофорез и сканирования дополнительно по мере необходимости.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Оранжевый G красителем (6х: 0,12 г Оранжевый G в 100 мл 30% глицерина) может быть добавлен к реакции связывания перед загрузкой визуализировать ход электрофореза. Другие красители , включая погрузочные бромфенолового синего будут обнаружены во время сканирования и , следова?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

fEMSAs являются эффективным инструментом для изучения взаимодействия белок-ДНК, и являются альтернативой радиоактивное мечение ДНК. Флуоресцентные красители, такие как инфракрасные красители являются коммерчески доступными, а также обеспечить более безопасный и более экологически чи?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	Bio-Rad	1610158	Acrylamide is harmful and toxic.
6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700-labeled DNA Oligos	Integrated DNA Technologies	Custom DNA oligo	These are referred to as "5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100 μM scale synthesis and HPLC purification.
Klenow Fragment (3'-->5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell	Bio-Rad	1658000FC	This is referred to as a 'mini protein gel system' in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size.
Odyssey CLx Infrared Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey CLx Infrared Imagng System	This is referred to as an 'advanced infrared imaging system' in the manuscript.
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System	This is referred as a 'near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots' in the manuscript.
Image Studio software (version 4.0)	LI-COR Biotechnology	Image Studio software	This is referred to as a 'particular imaging software' in the manuscript.
Orange G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Orange loading dye			0.25% Orange G; 30% Glycerol
0.5x TBE			45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
5x Binding Buffer			50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μg/mL BSA