Um protocolo otimizado para a mobilidade eletroforética ensaio de desvio usando oligonucleotídeos Infrared corante fluorescente-etiquetados

Resumo

Descrevemos aqui um protocolo otimizado de ensaios fluorescentes eletroforética de desvio de mobilidade (Femsa) usando SOX-2 proteínas purificadas em conjunto com sondas de DNA infravermelhos fluorescentes marcadas com corante como um estudo de caso para resolver uma questão biológica importante.

Resumo

Ensaios de deslocamento da mobilidade electrof orética (EMSA) são uma ferramenta fundamental para caracterizar as interacções entre proteínas e suas sequências de ADN alvo. A radioactividade tem sido o método predominante de marcação de ADN em EMSAs. No entanto, avanços recentes em corantes fluorescentes e métodos de verificação ter solicitado o uso de marcação fluorescente de ADN como uma alternativa para radioactividade para as vantagens de fácil manuseamento, economia de tempo, reduzindo o custo, e melhorando a segurança. Nós temos usado recentemente EMSA fluorescente (Femsa) para tratar com sucesso uma questão biológica importante. Nossa análise FEMSA oferece uma visão mecanicista sobre o efeito de uma mutação missense, G73E, no altamente conservada fator de transcrição HMG SOX-2 no tipo de neurônio diversificação olfativo. Descobrimos que mutantes SOX-2 proteína ^G73E altera a atividade de ligação específica de DNA, causando transformação neurônio identidade olfativa. Aqui, apresentamos um otimizado e rentável passo-a-passo protocolopara FEMSA usando fluorescentes infravermelho oligonucleotídeos marcados com corante contendo os LIM-4 / SOX-2 locais alvo adjacentes e proteínas purificadas SOX-2 (WT e as proteínas mutantes ^G73E SOX-2) como um exemplo biológico.

Introdução

EMSAs são utilizados para a análise da interacção entre o ADN e as proteínas nativas usando electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) para resolver uma mistura de uma proteína de interesse e uma sonda de ADN marcado contendo potenciais locais alvo da proteína ^1. Uma sonda de ADN ligado com proteína migrarão mais lenta em comparação com uma sonda de ADN livre, e é, por conseguinte, retardado na sua migração através de uma matriz de poliacrilamida. A radiomarcação de ADN por ³² P tem sido o método predominante para a detecção em EMSAs. Embora a aplicação de marcação radioactiva na pesquisa bioquímica tem sido benéfica, os métodos de rotulagem DNA alternativa com sensibilidade comparável estão sendo empregados devido aos riscos de saúde e segurança associados com a manipulação de radioatividade. Estes métodos alternativos incluem a conjugação de ADN com biotina ou digoxigenina ² (DIG) ³ (ambos os quais são então detectados por sistemas quimioluminescentes), SYBR verde de coloração dos géis página ^4,ou detecção direta de conjugados de corante de ADN fluorescente por digitalizar a ^5,6 gel.

Os géis resolvidos de EMSAs usando sondas de DNA marcadas radioactivamente requerem processamento postrun através de filmes auto-radiografia ou um sistema de phosphorimager para detectar sinais radioativos ^1,7. Géis de EMSAs utilizando biotina ou ^2-DIG conjugados com as sondas de ADN ³ também devem ser processados e transferidos para uma membrana adequada e, em seguida, detectados por quimioluminescência ^6. SYBR coloração verde do gel requer coloração de gel postrun e um scanner fluorescente ^4. Uma vez que as etapas de processamento de gel postrun são necessários para EMSAs utilizando estas técnicas de marcação de ADN, o gel pode ser resolvido ensaiados apenas uma vez. Em contraste, as sondas de ADN marcadas com fluoróforos pode ser detectada directamente no gel no interior das placas de vidro por um scanner. Portanto, as interacções ADN-proteína podem ser monitorizadas e ensaiado várias vezes a diferentes pontos de tempo durante a execução, quereduz significativamente o tempo e custo. Os conjugados de corante de ADN fluorescente que têm sido utilizados para EMSAs incluem ^6,8 Cy3, Cy5 ^{6,8, 9} fluoresceína, e corantes fluorescentes infravermelhos ^4-6.

A regulação transcricional requer interacções proteína-ADN de factores de transcrição e os seus genes-alvo. A coordenação dessas interações gera diversos tipos de células a partir de um antepassado comum durante o desenvolvimento animal. Uma frente tela genética não distorcida identificada uma mutação sem sentido, G73E, no domínio de ligação ao ADN de HMG altamente conservada do factor de transcrição de Caenorhabditis elegans SOX-2. Os resultados de mutação em uma transformação identidade da célula de AWB neurônios olfativos em AWC neurônios olfativos em níveis moleculares, morfológicos e funcionais ^5,10. SOX-2 diferencialmente regula a diferenciação terminal dos neurônios AWB e AWC, interagindo com fatores sócio de transcrição dependentes do contexto e respectivaLocais-alvo DNA ^5,10. SOX-2 parceiros com LIM-4 (LHX) no terminal de AWB diferenciação neuronal, enquanto SOX-2 parceiros com CEH-36 (OTX / DTA) na diferenciação neuronal AWC terminal. Ensaios de repórter de luciferase mostram que SOX-2 e da SOX-2 mutantes proteínas ^G73E ter interações de cooperação com co-factores de transcrição LIM-4 e CEH-36 para ativar um promotor expresso em neurônios AWB e AWC. No entanto, SOX-2 e mutante SOX-2 ^G73E exibido propriedades de activação diferencial do promotor. Para investigar a base molecular da actividade de ligação ao ADN diferenciais de SOX-2 e SOX-2 ^G73E, fEMSAs foram realizados com estas proteínas e os seus locais alvo potenciais.

Em primeiro lugar, uma abordagem foi feita bioinformática para identificar as sequências de ligação no interior da região promotora do 1 kb usado no ensaio de luciferase de ADN biologicamente relevante. Desde várias-2 SOX locais de ligação potenciais estavam presentes ao longo do promotor, nós nos concentramosem sítios de ligação de SOX-2 preditos adjacentes ao putativo CEH-36 ou LIM-4 locais de ligação e evolutivamente conservados entre várias espécies de nemátodos. Estas sequências foram excluídos ou mutado, e posteriormente testado in vivo para a sua actividade para expressar transgenes repórter GFP em neurónios AWB ou AWC. Através desta abordagem, identificou potenciais LIM-4 / SOX-2 e CEH-36-2 SOX locais alvo adjacentes / que são especificamente necessárias para a expressão de GFP em neurónios AWB AWC e ^5, respectivamente. Nós investigamos as diferenças potenciais no DNA ligação de SOX-2 e da SOX-2 ^G73E usando FEMSA com as CEH-36 / SOX-2 locais alvo adjacentes identificadas LIM-4 / SOX-2 e. Nossa análise EMSA mostraram que SOX-2 ^G73E não se ligou a sonda de DNA contendo os LIM-4 / SOX-2 locais alvo adjacentes (necessários para a expressão do gene em AWB) tão eficientemente quanto WT SOX-2 fez. No entanto, SOX-2 e da SOX-2 ^G73E não tinha diferença na ligação da sonda de DNA contendo o CEH-36 / SOX-2 umsite de destino djacent (necessária para a expressão de genes em AWC) ^5,10. O nosso femsa análises fornecem uma visão mecanicista para a natureza da mutação ^G73E SOX-2 em afectar a actividade de ligação do ADN específico para a transformação de células fenótipo identidade AWB-a-AWC. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado da Femsa usando 6xHis-SOX-2 purificadas ou 6xHis-SOX-2 ^G73E em conjunto com sondas de DNA marcadas com corante fluorescente no infravermelho contendo os LIM-4 / SOX-2 locais alvo adjacentes como estudo de caso para enfrentar uma importante questão biológica.

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Protocolo

NOTA: EMSAs usando sondas de DNA marcadas com fluorescência ou outras formas de ADN marcado partilham os mesmos protocolos para a preparação de proteína ou extracto celular, reacção de ligação proteína-ADN, e a preparação de gel de PAGE e execução (Figura 1A). As principais diferenças são procedimentos de ADN de rotulagem, etapas de processamento gel pós-run, e métodos de detecção.

1. Preparação do gel

1. Prepare 5% de gel de poliacrilamida nativa contendo TBE 0,5x (45 mM Tris-borato, EDTA 1 mM) e 2,5% de glicerol, usando um sistema de mini-gel de proteína (8,3 cm de largura x 7,3 centímetros de espessura comprimento x 0,75 mm).
   1. Para preparar 30 mL da solução de gel durante 4 géis, mistura 5 mL de 30% de acrilamida / bis (37,5: 1), 3 mL de 5x TBE (0,45 M Tris-borato, EDTA 10 mM), 1,5 mL de glicerol a 50%, 300 mL de 10% de persulfato de amónio, 15 ul de TEMED e 20,2 ml de _ddH2O completamente.
      NOTA: A acrilamida é prejudicial e tóxico, lidar com equipamento de protecção individual adequado.
2. Lançai a solução de gel imediatamente. Após a polimerização, enrole os géis no envoltório de plástico transparente pré-molhado com TBE 0,5x e armazená-los a 4 ° C.

2. Preparação de Sondas Infrared corante fluorescente-etiquetados

NOTA: Mantenha os oligonucleotídeos marcados com corante fluorescente no infravermelho longe da luz, tanto quanto possível, durante a preparação, armazenamento e experiências.

1. Planejar e ativar oligonucleotídeos.
   1. Projetar longo oligonucleotídeo para ~ 51-meros.
      NOTA: A sequência de oligonucleotídeo longo do / SOX-2 sonda LIM-4 é TATCATATCTATTCTA TGATTA AATACC TATTCA TTTCAAAATCTTCTCCC. oligonucleotídeos longos não exigem PAGE ou purificação HPLC.
   2. Conceber oligonucleótidos curtos complementares para ~ 14-meros com corante fluorescente no infravermelho modificação no terminal 5 '(5'Dye) e uma temperatura de fusão acima de 37 ° C.
      NOTA: A sequência de oligonucleotídeo curto do LIM-4 / SOX-2 sonda é 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG. A escala mínima síntese de oligonucleotídeos curtos 5'Dye-rotulados é de 100 nm. Portanto, os oligonucleótidos requerem purificação por HPLC.
2. oligonucleótidos Ressuspender em 1x tampão de Tris-EDTA (TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; EDTA 1 mM) até uma concentração final de 100 uM.
3. Anneal curta (5'Dye) e oligonucleotídeos longas.
   1. Misture 0,6 mL de 5'Dye Curto-oligo (100 uM), 1,2 ul de oligo comprida (100 uM), e 28,2 mL de cloreto de sódio tampão de Tris-EDTA (STE: 100 mM de NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; EDTA 1 mM) num tubo de 1,5 mL.
   2. Colocar o tubo em água a ferver durante 5 min. Desligue a fonte de calor e deixe a água com os oligos recozidos esfriar O / N no escuro.
4. Preencha saliências 5 'de recozidos 5'Dye-Short / oligos longos com DNA polimerase Klenow para fazer sondas de DNA de cadeia dupla.
   1. Preparar a mistura de reacção através30 uL de recozidos curtas de comprimento / oligos com 5'Dye tag, 8,5 ul de tampão Klenow 10x, 1,7 ul de dNTPs 10 mM, 1,7 ul de Klenow (3 '-> 5' exo) (5 U / uL), e 43,1 uL de _ddH2O em um tubo de 0,2 mL de PCR.
   2. Incubar 60 min a 37 ° C numa máquina de PCR.
   3. Adicionar 3,4 uL de EDTA 0,5 M para parar a reacção e inactivam calor a 75 ° C durante 20 minutos numa máquina PCR.
5. Diluir sondas preenchidos (0,7 uM) em STE para a concentração final de 0,1 uM.
6. oligos armazenar a -20 ° C no escuro até que esteja pronto para uso. Oligos podem ser armazenadas por até um ano nesta condição.
   NOTA: Para gerar sondas de ADN com sítios de ligação mutantes, versões mutantes de longos oligonucleótidos são hibridados com os oligonucleótidos curtos 5'Dye marcados, seguido por preenchimento de 5 'com Klenow saliências. Demonstrou-se que a sonda com uma cadeia marcada com um fluorescente no infravermelhocorante tem apenas 30% da intensidade da sonda com as duas cadeias marcadas com o corante. Se a intensidade do sinal deve ser reforçada, longos oligos de ambos os fios são marcados com corantes fluorescentes infravermelhos em terminais 5 'e recozidos para fazer sondas marcadas com corante fluorescente no infravermelho.

3. Preparação de Unlabeled / frio Sondas (concorrentes)

Nota: oligonucleotídeos longos de sequências complementares (longas e LongR) foram emparelhados para fazer sondas não marcadas para análise da concorrência com sondas marcadas com corante fluorescente no infravermelho.

1. Misturar 20 uL de 100 uM longo, de 20 uL de 100 uM LongR oligonucleótidos, e 60 uL de STE num tubo de 1,5 mL.
2. Colocar o tubo em água fervente por 5 min, desligue a fonte de calor e deixe a água com os oligos recozidos arrefecer durante a noite.

4. reação de ligação e Eletroforese

1. Prepare 1 ml de tampão de ligação 5x por mistura de 50 uL60; de M de Tris-HCl 1 M, pH 7,5; 10 ul de NaCl 5 M; 200 mL de KCl 1 M, 5 mL de 1 M _{de MgCl2,} 10 ul de EDTA 0,5 M, pH 8,0; 5 ul de DTT 1 M; 25 uL de 10 mg / mL de BSA, e 695 uL de ddH ₂ O.
   NOTA: O 5x tampão de ligação pode ser dividido em alíquotas e armazenado a -20 ° C. Outro ponto a considerar é que fatores de transcrição diferentes terão diferentes modificações para o tampão de ligação.
2. Logo antes da criação de reacções de ligação, pré-correr em gel de poliacrilamida nativa a 5% em TBE 0,5x + 2,5% de glicerol para remover todos os vestígios de persulfato de amónio a 80 V durante 30 - 60 minutos, ou até que a corrente não varia com o tempo.
3. Configurar a reação de ligação no volume final de 20 mL.
   1. Mistura-se 4 uL de tampão de ligação 5x, 80-200 ng de proteína purificada A (em glicerol a 50%, ou seja, SOX-2), 1 ul de 0,1 uM sonda conjugado com corante (concentration: 5 nM), e ddH ₂ O.
   2. Opcional: Quando são necessárias concorrentes de sondas frias, adicionar várias concentrações (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, etc.) de sondas frias.
   3. Opcional: Quando a interacção entre as proteínas A e B (ou seja, SOX-2 e LIM-4) é testado, adicionar 80-200 ng de proteína purificada B (em glicerol a 50%, ou seja, LIM-4).
   4. Opcional: Quando a preparação de extracto nuclear é utilizada e a ligação específica de proteína A é para ser validado, adicionar o anticorpo específico para a proteína A (ou seja, anti-6xHis, anti-FLAG, etc).
   5. Incubar em R / T no escuro durante 15 min.
4. Carga em toda a reacção de ligação sobre o gel e correr o gel a 10 V / cm a uma distância desejada.

5. Imagiologia

NOTA: O gel foi digitalizado directamente nas placas de vidro com um sistema de imagem de infravermelhos avançada. Por conseguinte, o gel pode ser resolvida adicionalmente e rastreados repetidamente (Figuras 1C e 2). Um sistema de imagiologia fluorescente no infravermelho próximo principalmente para Western blots também foi testado para verificar o gel, mas apenas o sistema de imagem infravermelha avançada foi capaz de digitalizar o gel com boa resolução. A metodologia descrita é específico para um software de imagiologia de infravermelhos em particular, embora possam ser utilizados outros pacotes de software.

1. Limpar o leito do scanner com DDH ₂ O e secar bem antes da digitalização. Secar as placas de vidro do gel e colocar as placas contendo o gel sobre a superfície do scanner.
2. Abra o software de imagem de infravermelhos e vá para a guia 'Acquire'. Quando a placa mais fino (1 mm) é colocado na mesa do scanner, use as configurações do Canal: 700, Intensidade: Auto, resolução: 169 mm, Qualidade: médio, e Focus offset: 1,5 mm. Quando a placa mais espessa (3 mm) é colocado na mesa do scanner, use as configurações do Canal: 700, Intensidade: Auto, resolução: 84 mm, Qualidade: médio, e Focus offset: 3,5 mm. compensada foco depende doespessura da placa de vidro.
3. Seleccione a área que o gel ocupa no scanner. Clique em "Iniciar" para iniciar a digitalização.
4. Repetir electroforese e digitalizar, adicionalmente, como necessário.

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Resultados

Orange G corante de carga (6x: 0,12 g Laranja G em 100 ml de glicerol a 30%) pode ser adicionada à reacção de ligação antes do carregamento para visualizar o progresso da electroforese. Outros corantes de carga, incluindo azul de bromofenol vai ser detectadas durante a análise e, portanto, interferir com a análise de imagem (Figura 1B).

Em alguns casos de EMSAs, especialmente se a preparação de extrac...

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Discussão

fEMSAs são um instrumento eficaz para investigar interacções DNA-proteínas, e são uma alternativa à marcação radioactiva de ADN. corantes fluorescentes, tais como corantes de infravermelho estão comercialmente disponíveis, e proporcionar um método mais seguro e respeitador do ambiente em relação a marcação de ADN radioactivo. EMSAs usando fluorescentes infravermelho oligonucleotídeos marcados com corante não requerem etapas de processamento gel postrun, e, portanto, economizar tempo e custo em comparaç...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	Bio-Rad	1610158	Acrylamide is harmful and toxic.
6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anti-Flag M2 antibody	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Bovine Serum Albumin (BSA) molecular biology grade	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700-labeled DNA Oligos	Integrated DNA Technologies	Custom DNA oligo	These are referred to as "5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos" in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled-DNA oligonucleotides. Requires minimum 100 μM scale synthesis and HPLC purification.
Klenow Fragment (3'-->5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell	Bio-Rad	1658000FC	This is referred to as a 'mini protein gel system' in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25 cm x 25 cm in size.
Odyssey CLx Infrared Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey CLx Infrared Imagng System	This is referred to as an 'advanced infrared imaging system' in the manuscript.
Odyssey Fc Imaging System	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System	This is referred as a 'near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots' in the manuscript.
Image Studio software (version 4.0)	LI-COR Biotechnology	Image Studio software	This is referred to as a 'particular imaging software' in the manuscript.
Orange G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Orange loading dye			0.25% Orange G; 30% Glycerol
0.5x TBE			45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 1 mM EDTA
5x Binding Buffer			50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8.0; 5 mM DTT; 250 μg/mL BSA