איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

Summary

רצף תא בודד הוא כלי פופולרי ונגיש יותר ויותר לטיפול שינויים הגנומי ברזולוציה גבוהה. אנו מספקים פרוטוקול המשתמש רצף תא בודד לזהות שינויי מספר עותק תאים בודדים.

Abstract

איתור של שינויים גנומיים ברזולוצית תא בודדת חשוב לאפיון מגוון גנטי ואבולוציה ברקמות נורמליות, סרטן, ואוכלוסיות מיקרוביאלי. שיטות מסורתיות להערכת הטרוגניות גנטית היו מוגבלות על ידי ברזולוציה נמוכה, רגישות נמוכה, ו / או סגולי נמוך. רצף תא יחיד התפתח ככלי רב עצמה לאיתור הטרוגניות גנטית עם רזולוציה גבוהה, רגישות גבוהה, כאשר נותחו כראוי, סגולי גבוה. כאן אנו מספקים פרוטוקול עבור הבידוד, הגברת הגנום כולו, רצף, וניתוח של תאים בודדים. הגישה שלנו מאפשרת זיהוי האמין של וריאנטים מספר עותק megabase מידת תאים בודדים. עם זאת, היבטים של פרוטוקול זה יכול להיות מיושמים גם לחקור סוגים אחרים של שינויים גנטיים בתאים יחידים.

Introduction

שינויים במספר עותק דנ"א יכול טווח בגודל מכמה זוגות בסיסים (מספר עותק וריאנטים) (CNVs) לכרומוזומים כולו (aneuploidy). שינויים במספר ההעתק המשפיעים אזורים גדולים של הגנום יכולים להיות השלכות פנוטיפי משמעותיות על ידי שינוי הביטוי של עד אלף גנים ^{1, 2.} CNVs שנמצא בכל התאים של אוכלוסייה יכולה להיות מזוהה על ידי רצף בתפזורת או בשיטות מבוססות microarray ^{3, 4.} עם זאת, אוכלוסיות גם יכולות להיות גנטי הטרוגנית, עם CNVs קיים קבוצת משנה של האוכלוסייה או אפילו תאים בודדים. מגוון גנטי שכיח סרטן, נהיגת התפתחות גידול, וגם נוכח ברקמות נורמליות, עם תוצאה לא ידועה ^{5, 6, 7, 8, 9 , 10.}

באופן מסורתי, מגוון גנטי הוערך באמצעות גישות ציטולוגיה או רצף בתפזורת. גישות ציטולוגיה, כגון קרינת כלאה באתרו (FISH), ממרחים כרומוזום, ואת karyotyping ספקטרלי (SKY), יש את היתרון של שינויים בזיהוי נוכחיים בתאים בודדים אבל יש שיעורי לטעות גבוהים עקב ממצאים של כלאה והפצת ^11. גישות אלה מוגבלות גם מספר חושף ההעתק בלבד פתרונם משתנות פורשות כמה megabases. רצף או microarrays של DNA בתפזורת, אם כי גבוה דיוק ורזולוציה, הוא פחות רגיש. כדי לזהות מגוון גנטי על ידי גישות מבוססות אוכלוסייה, הגירסות חייבות להיות נוכחות חלק ניכר של תאים באוכלוסייה. הופעה של שיטות כדי להגביר את הדנ"א הגנומי של תאים בודדים הפך אותו ניתן לרצף את הגנום של תאים בודדים. seque תא יחידיש ncing היתרונות של רזולוציה גבוהה, רגישות גבוהה, וכאשר שיטות בקרה איכות מתאימות מוחלות, גבוה דיוק ^12.

כאן אנו מתארים שיטה לגילוי שינויים במספר עותק בקנה מידה megabase ב תאים בודדים. אנו לבודד תאים בודדים על ידי מיקרו אספירציות, להגביר הדנ"א הגנומי באמצעות מתאם מקשר PCR, להכין ספריות עבור סידור הדור הבא, וכדי לזהות מספר עותק וריאנטים הן על ידי מודל מרקוב חבוי ופילוח בינארי מעגלית.

Protocol

1. בידוד תאים בודדים

1. הכן את microaspirator
   1. הסר את הקצה פלסטיק שקוף ממכלול aspirator צינור והכנס את הקצה הצר אל קצה אחד של צינורות PVC 1 רגל ארוכה עם 3/16 "קוטר פנימי.
   2. הכנס את השקע של מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר לתוך הקצה השני של צינורות PVC 1 רגל הארוכה עם 3/6 "קוטר פנימי.
   3. הכנס את הכניסה של מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר לתוך קצה אחד של צינורות PVC 6 אינץ 'ארוך עם 5/16 "קוטר פנימי.
   4. אופציונלי: חותכים את צינורות PVC באורך שני סנטימטרים וחצי 6 עם 5/16 "קוטר פנימי לשניים ולהכניס מלכודת המים אונליין בין שני החצאים.
   5. לשבור פיפטה סרולוגיות פלסטיק 5 מ"ל ב 1 הסיום מ"ל והכנס את הקצה הקרוע אל הקצה הפתוח של הצינור PVC עם 5/16 "קוטר פנימי.
   6. הכנס את היציאה של פיפטה 5 מיליליטר פלסטיק סרולוגיות לתוך הסוף הגמיש של הרכבת צינור aspirator (שסיומו הפלסטיק השקוףהוסר).
   7. עבור אחסון, מכסה את פומית הטלפון האדומה של הרכבת צינור aspirator עם צינור פלסטיק סטרילית.
   8. צייר את צינור נימי זכוכית בקוטר פנימי של 10-30 מיקרומטר ידי הבאה באמצע הצינור ליד להבת מבער בונזן ויישום מתח על צד אחר של הצינור. לשבור את הצינור נמשך באמצע כדי ליצור שתי מחטים aspirator פוטנציאליים. חזור על פעולה זו עם מספר צינורות כמו שרק כמה צינורות יהיו בסופו של דבר עם קוטר פנימי המתאים לקטיף תאים בודדים.
   9. עבור אחסון, הנח שתי רצועות של פלסטלינה בצלחת 15 ס"מ פטרי ולאבטח את המחטים aspirator פני רצועות.
2. פיק תאים
   1. כן השעית תא בודד בהתאם לסוג התא ולהתנסות. לדוגמא, כדי להכין תאים חסידים כגון שורות תאי פיברובלסטים אדם, תאי קציר על ידי תאי trypsinization ו והעבירו צינור חרוטים המכילים חומרי הדפסה מתאימות.
   2. לפני, במהלך, אוחרה הכנת השעית התא הבודדה (תלוי כמה זמן לוקח להכין את השעית התא הבודדה), להגדיר את מכסה מנוע הגברת הגנום כולו.
      1. תרסיס למטה פני השטח של מכסה המנוע, תיבות קצה פיפטה, וטיפים פיפטה עם אקונומיקה 10% ולנגב במגבת נייר. חזור על פעולה זו עם 70% אתנול.
      2. הוסף 8 μL של מים מן הגברת הגנום כולו (WGA) ערכתי לבארות בודדות של צלחת 96-היטב PCR, גם אחד עבור כל תא כדי להיות רצף. מכסים את צלחת 96-היטב PCR עם מכסה מהצלחת בתרבית רקמה 96-היטב ומניחים על קרח.
   3. להוסיף 1,000 תאים 10 מ"ל התקשורת או פוספט בופר סליין (PBS) בצלחת 15 ס"מ פטרי במקום צלחת על הקרח כדי למנוע את התאים מפני דבקות המנה.
   4. תביא את התאים בצלחת פטרי צלחת 96-היטב PCR עם מכסה על קרח כדי מיקרוסקופ אור עם מטרת 10X.
   5. גדל פתיחת מחט aspirator ידי קשה סוף והמוארך בעדינות של המחט דואר aspirator על משטח קשה כזה הקצה השתתק. הכנס את הקצה הרחב של מחט aspirator אל הקצה הברור של microaspirator.
   6. מניחים את צלחת פטרי המכילה תאים על הבמה מיקרוסקופ. מניח את הפיה האדומה של aspirator בפה. השתמש ביד אחת כדי להזיז את המחט aspirator ואת היד השנייה כדי להעביר את צלחת פטרי המכילה תאים. לזהות תאים בודדים כדי להיות רצף.
   7. באמצעות יניקת פה, לצייר תא בודד לתוך מחט aspirator יחד עם ~ 1-2 μL של תקשורת או PBS. מעביר את התא אל 8 μL של מים בתוך באר אחת של צלחת 96-היטב PCR. הימנע החדרת בועות בעת העברת התא.
   8. חזור על שלב 1.2.7 עד מספר התאים הרצוי בודד. שמור את הצלחת PCR על הקרח מכוסה במכסה בין תאים לקטוף. סמן את הבארות שקבלו תאים.
      1. בעוד לקטוף תאים בודדים, להפשיר את תמוגה תא בודד 10X חיץ הפיצול מן g כולוערכת הגברה enome. לאחר לקטוף את המספר הרצוי של תאים, יש לפנות מייד הגברת הגנום כולו.

2. הגברת הגנום כולו

1. כדי למנוע זיהום במהלך הגברת הגנום כולו, להוסיף את כל החומרים כימיים בתוך ברדס בתרבית רקמה, השתמש טיפים פיפטה עם מסננים, ולשנות את הקצה פיפטה בין בארות.
2. כן פתרון חיץ תמוגה ופיצול עובד מן הגברת הגנום כולו (WGA) הערכה. לכל קבוצה של עד 32 תאים, לשלב 32 μL של 10x תמוגה תא בודד חיץ הפיצול 2 μL של פתרון K proteinase בתוך שפופרת microcentrifuge. וורטקס הצינור לערבב הפתרונות.
3. הוסף 1 μL של עובד תמוגה פתרון חיץ הפיצול זה היטב פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב.
4. מכסה את הצלחת ולאטום את כל הבארות עם סרט פלסטיק. צנטריפוגות בקצרה את צלחת טווית הצלחה מיני.
5. מחזור תרמי כמו follOWS: 50 ° C, 1 שעות 99 מעלות צלזיוס, 4 דק '.
6. מצנן את הצלחת על קרח בקצרה צנטריפוגות צלחת טווית הצלחה מיני.
7. כן פתרון חיץ כנת ספרייה עובד מן ערכת הגברת הגנום כולו. עבור כל תא, לשלב 2 μL של חיץ הכנה הספרייה תא בודד 1x ו 1 μL של פתרון ייצוב הספרייה בתוך שפופרת microcentrifuge. הכן את הפתרון עובד עבור תאים יחד באותה צינור microcentrifuge.
8. הסר את הסרט הפלסטי ולהוסיף 3 μL של פתרון עובד חיץ כנת ספרייה היטב כל אחד. פיפטה את התוכן של הבאר למעלה ולמטה כדי לערבב. החזר את הסרט הפלסטי.
   הערה: סרט הפלסטיק ניתן לעשות שימוש חוזר לאורך כל תהליך הגברת הגנום כולו עד בארות המתחילים בולש בסרט. כאשר זה קורה, לעבור סרט פלסטיק חדש.
9. צנטריפוגות בקצרה את צלחת טווית הצלחה מיני לדגור על 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
10. מצננים את הצלחת על קרח בקצרהבצנטריפוגה צלחת טווית הצלחה מיני.
11. הסר את הסרט הפלסטי, להוסיף 1 μL אנזים כנה ספרייה זה טוב, ו פיפטה את התוכן של הבאר למעלה ולמטה כדי לערבב. שמור את האנזים כנה ספרייה על קרח או בתוך גוש קר לאורך שלב זה. החזר את הסרט הפלסטי.
12. צנטריפוגות בקצרה את צלחת טווית הצלחה מיני מחזור תרמי כדלקמן: 16 ° C, 20 דקות, 24 ° C, 20 דקות, 37 ° C, 20 דקות, 75 ° C, 5 דקות, והחזק על 4 מעלות צלזיוס.
13. מצנן את הצלחת על קרח בקצרה צנטריפוגות צלחת טווית הצלחה מיני.
14. להכין תערובת הגברה עובדת מן ערכת הגברת הגנום כולו. עבור כל תא, המשלבים מים 48.5 μL, 7.5 μL 10x הגברה תערובת הורים, ו -5 פולימראז μL WGA DNA בתוך שפופרת microcentrifuge. מכינים את תערובת עובד עבור תאים יחד באותה צינור microcentrifuge. שמור את התערובת עובדת על קרח.
15. הסר את הסרט הפלסטי, להוסיף 61 μL לעבוד תמהיל הגברהזה טוב, פיפטה תוכן גם מעלה ומטה כדי לערבב. שמור את תערובת ההגברה עובדת על קרח או בתוך גוש קר לאורך שלב זה. החזר את הסרט הפלסטי.
16. צנטריפוגות בקצרה את צלחת טווית הצלחה מיני מחזור תרמי כדלקמן: 95 ° C, 3 דקות, 25 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס, 30 שניות ו 65 מעלות צלזיוס, 5 דקות, והחזק על 4 מעלות צלזיוס.
17. העברת 60 μL של כל דגימה לצינור ולאחסן microcentrifuge נפרד - 20 ° C לשימוש בשלב 3.
18. להוסיף צבע טעינת DNA נפח הנותרים של כל דגימה (כלומר 3 μL של 6x DNA צבע טעינת עד 15 μL של המדגם) ולהפעיל 5 μL מכל תגובה על ג'ל agarose 1%.
    הערה: תאים מוגבר בהצלחה יופיע ככתם מ 250 עד 1000 נ"ב. דוגמאות שאינן מראות מריחות או רק להראות מבחין בכתם קלוש צפויות להניב נתוני רצף שימושיים.

רצף 3.

1. לטהר דגימות עם חרוזים פאראמגנטיים.
   1. thaדגימות DNA w על הקרח. וורטקס חרוזים פאראמגנטיים עד הפתרון הוא הומוגני דגירה חרוזים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות.
   2. העבר 20 μL של כל דגימת DNA לתוך צינור microcentrifuge נקי. שאר המדגם ניתן לאחסן ב -20 ° C.
   3. הוסף 30 μL (1.5x) של חרוזים פאראמגנטיים לכל דגימת DNA מערבולת לערבב. דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. השאירו את פתרון המניות של חרוזים בטמפרטורת החדר לשימוש צעד 3.4.
   4. מניחים את הצינורות על רצועת צינור מגנטי למשך 2 דקות, או עד חרוזים צורה כדורית ואת supernatant ברור.
   5. בעזרת פיפטה P200, להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר מבלי להפריע חרוזים.
   6. להוסיף 180 μL של אתנול 80% לתערובת DNA חרוז. סובב את הצינורות כמה פעמים ביחס המגנט "לשטוף" את החרוזים באמצעות הפתרון אתנול.
   7. בעזרת פיפטה P200, להסיר כמה שיותר לשטוף אתנול כמו possible מבלי להפריע את החרוזים.
   8. חזור 3.1.6 ו 3.1.7.
   9. האוויר יבש חרוז למשך כ -10 דקות או עד שלא אתנול יותר גלוי. המשך לשלב הבא כאשר חרוזים להופיע סדוק או ליפול מהקיר של הצינור.
   10. הסר את הדגימות מן הפס המגנטי. הוסף 40 μL של 10 מ"מ טריס pH 8.0 elute את ה- DNA מן החרוזים המערבולת דגימות כדי resuspend את החרוזים. דגירה של 2 דקות בטמפרטורת החדר.
   11. בקצרה בצנטריפוגה הדגימות כדי לאסוף את הנוזל בתחתית של התחתית ומניח את הצינורות על רצועת צינור מגנטית עבור שתי דקות לפחות. מעבירים את eluent לתוך צינורות microcentrifuge נקי מבלי להפריע את החרוזים.
2. נורמליזציה לדוגמא
   1. לכמת את הריכוז של כל דגימה באמצעות ספקטרופוטומטר. הריכוזים צריכים לנוע בין 10 ל 30 ng / μL.
   2. לדלל מדגם ל -0.2 ng / μL באמצעות 10 מ"מ טריס pH 8.0. השלבים הבאים ידרשו i מינימוםNput 5 μL מדילול זה.
3. הכנה הספרייה
   1. הכן ספריות רצף לפי ההנחיות של ערכת הכנה הספרייה ^13.
4. ניקוי סופי
   1. נקה את הדגימות על פי שלב 3.1. עבור אורכים לקריאה של 50 נקודות בסיס, 75 נ"ב, או 150 נ"ב, השתמש יחס של חרוז לדגום נפח של 1.5x, 1x, או 0.6x, בהתאמה. Elute עם 15 μL של 10 מ"מ טריס pH 8.0.
   2. הפעל את הדגימות על מנתח שבר לבדוק את התפלגות הגודל של הספרייה ^14. התפלגות הגודל צריך להתפשט באופן שווה 150 כדי 900 נ"ב.
5. לכמת דגימות באמצעות qPCR
   1. באמצעות ערכת כימות ספרייה, הקים תגובת qPCR בהתאם להוראות ערכת ^15. השאר ריק עמודה כדי להוסיף תקנים חיוביים (סטנדרטים דנ"א בערכה) ותקנים שליליים (מים או פתרון ריק אחר).
   2. מחזור תרמי כמו folשפל: 95 ° C, 5 דקות (שיעור הרמפה של 4.8 ° C / sec) ו -35 מחזורים של 95 ° C, 30 שניות (שיעור הרמפה של 4.8 ° C / sec) ו -60 ° C, 45 שניות (שיעור הרמפה של 2.5 ° C / sec).
6. איגום
   1. לקבוע את מספר נתיבים על flowcell נדרשים ולחלק את הדגימות לקבוצות, עם קבוצה אחת לכל נתיב.
   2. עבור כל קבוצה של דגימות, לבחור את המדגם עם הריכוז הנמוך ביותר על בסיס הנתונים qPCR משלב 3.5.2 לנרמל את כל דגימות כי הקבוצה כי ריכוז באמצעות 10 מ"מ טריס pH 8.0.
   3. פינת דגימות בכל קבוצה ביחד.
7. רצף
   1. ברכות טענו במחשב רצף הדור הבא בעקבות הליכים סטנדרטיים ^16.

ניתוח 4. נתונים

הערה: סביבה מבוססת יוניקס נדרשה להפעיל את התוכניות ותסריטים בסעיף זה. התקנת התוכנה המוזכרים בפרוטוקול הבא שלהם מדריכי stallation. ניתן למצוא את כל התסריטים בבית https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/.

1. חתוך את הקורא ל -40-NT באמצעות fastx_trimmer מגרסת FASTX-Toolkit 0.0.13 ^17.
   fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l 40 -o example.trim.fastq
2. יישר את מקריא הגנום ההתייחסות המתאים (mm9 לעכבר, hg19 עבור אדם) באמצעות גרסת 0.6.1 BWA עם אפשרויות ברירת מחדל ^18.
   BWA AlN mm9.fa example.trim.fastq> example.sai
   BWA samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq> example.sam
3. סור מערכים כדי chrm וכרומוזומים אקראי, ואז למיין מדד קובץ BAM וכתוצאה מכך באמצעות SAMTools גרסה 0.1.19 ^19.
   grep -v -w chrm example.sam | grep -v אקראי> example.filtered.sam
   samtools להציג example.filtered.sam -uSh | samtools מין - example.filtered
   מדד samtools example.filtered.bam
4. הפעל HMMcopy לזהות CNVs= "Xref"> 20
   1. השתמש gcCounter ב HMMcopy כדי ליצור קובץ התייחסות אחוז GC עבור הגנום. השתמש באפשרות "-w 500000" כדי לציין את גודל החלון. השתמש באותו גרסת קובץ התייחסות fasta בשימוש בשלב 4.2, אבל להפוך chrm בטוח הכרומוזומים אקראיים יוסרו מקובץ fasta.
      gcCounter -w 500000 mm9.fa> mm9_gc.wig
   2. השתמש generateMap.pl ב HMMcopy כדי ליצור קובץ להתנועע עבור mappability. השתמש באפשרות "-w 40" כדי לציין לקרוא אורך. השתמש באותו קובץ התייחסות fasta בשימוש בשלב 4.4.1.
      generateMap.pl -b mm9.fa
      generateMap.pl -w 40 -i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig
   3. השתמש mapCounter ב HMMcopy כדי ליצור קובץ התייחסות mappability עבור הגנום. השתמש באפשרות "-w 500000" כדי לציין את גודל החלון.
      mapCounter -w 500000 mm9.bigwig> mm9_map.wig
   4. השתמש readCounter ב HMMcopy כדי ליצור קובץ להתנועע עבור כל קובץ BAM.
      readCounter -w 500000 example.filtered.bam> input.wig
   5. שנה את הנתיבים לקבצים התייחסות סקריפטים R (run_hmmcopy.mm9.r או run_hmmcopy.hg19.r), להשתמש את הקבצים שנוצרו לעיל 4.4.1 (למשל, mm9_gc.wig) ו 4.4.3 (למשל, mm9_map. פאה) עבור המשתנים gfile ו mfile, אשר עיין בחומר עזר הקובץ mappability התייחסות GC אחוז קובץ, בהתאמה. ואז להריץ את הסקריפט R ניתן "run_hmmcopy.mm9.r" או "run_hmmcopy.hg19.r".
      R CMD BATCH run_hmmcopy.mm9.r
      אוֹ
      R CMD BATCH run_hmmcopy.hg19.r
   6. עבור עיבוד אצווה של קבוצה של קבצים BAM, לשים את הקבצים BAM בתיקייה אחת ולהפעיל את הסקריפט המסופק "HMMpipe.pl" בחבילה לקרוא מגזרים ולחשב ציונים השתנות (VS). בצע את הפורמט:
      perl HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles mm9
5. הפעל DNAcopy לזהות CNVs ^21.
   1. השתמש SAMtools גרסה 0.1.19 לחלץ ממופה באופן ייחודי קורא מתוך כל קובץ BAM.
      samtools להציג -h -f 0x0004 example.filtered.bam | egrep -i "^ @ | XT: A: U" | samtools להציג -Shu -> example.mapped.bam
   2. השתמש MarkDuplicates בגירסה פיקארד 1.94 לסמן כפילויות PCR ב BAM להגיש ^22.
      java-jar INPUT MarkDuplicates.jar = OUTPUT example.mapped.bam = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = true
   3. השתמש coveragebed ב bedtools גרסה 2.17.0 לספור ממופה קורא אחד מחלונות mappable 500KB מוגדרים מראש דינמי בקובץ BED ניתן "mm9.500k.dynamic.win.bed" או "hg19.500k.dynamic.win.bed" ²³ .
      coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | מיין -k1,1 -k2,2n> example.nondup.counts
   4. השתמש סקריפט Perl ניתן "normalizeGC.pl" לנרמל את ספירת קוראים המבוססים על קובץ עזר תוכן GC ניתן "mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt" או "hg19.500k.dynamic.win.fa. gc.txt ".
      perl normalizeGC.pl mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts> example.bam.norm.counts
   5. השתמש "dnacopy.r" תסריט R ספק לקרוא מגזרים.
      R CMD BATCH dnacopy.r
6. זהה CNVs
   1. אל תכלול תאים שעבורם VS מחושב ב 4.4.6 עולה 0.26.
   2. סנן את הפלחים נקראים על ידי HMMcopy ב 4.4.6 לכלול רק אלה שעבורם יחס יומן ₂ החציוני עולה 0.4 (רווח משוער) או פחות מ -0.35 (פסד משוער).
   3. סנן את הפלחים נקראים על ידי DNAcopy ב 4.5.5 לכלול רק לאלה בם המגזר מתכוון גדול מ 1.32 או פחות מ -0.6.
   4. חופף את קטעי פסוקי 4.6.2 ו 4.6.3, קורא CNVs רק באזורים בם הוא HMMcopy ו DNAcopy לזהות רווח משוער או פסד משוער.

תוצאות

Aspirator התאספו אמור להופיע דומה לזו באיור 1 א. המחט צריכה להיגרר כאלה שזה רחב מספיק כדי להכיל תא בודד אבל לא כל כך רחב כי נפח גדול נערך עם התא הבודד. Aspirating תאים בודדים היא הקלה כאשר יש בין אחת לחמש תאים בשדה 10X (איור 1B).

אם הגברת הגנום כולו היא מוצלחת, המדגם יופיע ככתם על ג'ל agarose (איור 2, מסלולי 1, 2, 4, 5, 6, ו -7). מבחין בכתם קלוש או נעדר מצביע על תגובת הגברה נכשלה ואת המדגם לא צריך להיות רצף (איור 2, נתיבי 3 ו -8).

בעקבות הכנת ספרייה, חלוקת גודל שבר של הדגימות צריכה להיות מוערכת על ידי אלקטרופורזה נימים על נתח שבר.בהצלחת ספריות מוכנות תהיינה חלוקות למדי אפילו בגדלים שברים 150 כדי 900 נ"ב (איור 3, A, B). נכשלתי כנת ספרייה תגרום התפלגות גודל שבר סוטה וספריות כזה לא צריכות להיות רצף (איור 3 ג).

עיבוד הנתונים רצף באמצעות מודל מרקוב נסתר (HMMcopy) ופילוח בינארי עגול (DNAcopy) יהיה לנתח את הגנום של כל תא למקטעים של מספר עותק מוערך. מגזרים אלה לאחר מכן ניתן מסוננים לזהות את אלה עם מספר עותק מוערך בקנה אחד עם רווח או הפסד בתא בודד (טבלה 1). מגזרים מסוננים אלה מן HMMcopy ו DNAcopy יש חפיפה ואז לזהות CNVs ברמת ודאות גבוהה.

איור 1. בידוד תא יחיד. ( א) התאסף microaspirator. (B) מראה השדה 10X ניתק תאים (חיצים) ומחט microaspirator (בפינה הימנית התחתונה). Aspirating תאים בודדים הוא הקלה כאשר יש בין אחת לחמישה תאים בשדה 10X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. הגברת הגנום כולו. ג'ל אלקטרופורזה agarose של 5 μl של מוצרי הגברה הגנום כולו. דוגמאות כי בהצלחה להגביר יופיע לכתמים בהירים החל מיום 100 נ"ב ל -1 kb (מסלולים 1, 2, 4, 5, 6, ו -7) והוא יכול להיות רצף. דוגמאות שאינו להגביר בהצלחה תפקנה מריחות קלושות או לא למרוח (נתיבים 3 ו -8) ואסור להיות רצף.large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. הכנת הספרייה. תוצאות נציגת מנתח שבר. הגרפים מראים גודל שבר (ב BP) על ציר X ו- יחידות הקרינה היחסית (RFU) על ציר Y. מימין כל גרף הוא שביל ג'ל מדומה. (א) תוצאות עבור מדגם אידיאלי, עם חלוקה שווה בין 150 ל 900 נ"ב וללא פסגות חדות או הטיה כלפי צד אחד. מדגם זה מקובל על רצף. תוצאות (B) מדגימה בסדר, עם התפלגות גודל מוטה כלפי בגדלים שבר נמוכים. אמנם זה לא אופטימלי, המדגם יכול עדיין להיות רצף. (ג) תוצאות ממדגם נכשל, עם גדלים שבר קטן בעיקרה. זו נגרמת ככל הנראה על ידי דגירה ממושכת במהלך שלב tagmentationהכנה הספרייה. מדגם זה לא אמור להיות רצף. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

HMMcopy
לִטעוֹם	מִגזָר	Chr	הַתחָלָה	סוֹף	מדינה	חֲצִיוֹן
D15-4998	23	chr8	144,500,001	146,500,000	6	0.5008794
D15-4998	29	chr10	67,000,001	134,500,000	6	0.4031945
D15-4998	52	גhr19	1	20,000,000	6	0.4616884
D15-4998	57	chrY	1	59,500,000	2	-1.506532
DNAcopy
לִטעוֹם	Chrom	התחל סל	סוף bin	הַתחָלָה	סוֹף	ממוצע Seg	med Seg
D15-4998	chr10	88	197	62,612,945	129,971,511	1.4688	0.157
D15-4998	chr19	0	31	0	28,416,392	1.4141	.1674
D15-4998	chrX	77	126	51,659,160	95,343,369	1.3548	.1874
D15-4998	chrY	0	14	0	23,805,358	-2.7004	.3591

ניתוח נתונים מהטבלה 1.. מגזרים מסוננים שנוצרו על ידי HMMcopy ו DNAcopy מתא בודד. חופפים שתי תוצאות אלו מגלה רווח על כרומוזום 10 מ 67 130 MB כמו גם רווח על כרומוזום 19 מן 0 כדי 20 MB. מצאנו כי רווחי על החלק הפרוקסימלי של כרומוזום 19 הם תוצר של רצף תא בודד ^12.

Discussion

באופן מסורתי, זיהוי CNVs ו aneuploidy ברמה של תאים בודדים נדרשים שיטות ציטולוגיה כגון דגי SKY. עכשיו, רצף תא בודד התפתח גישה חלופית עבור שאלות כאלה. יש רצף תא יחיד יתרונות על פני דגי SKY כפי שהוא הוא הגנום כולו ברזולוציה גבוהה. יתר על כן, כאשר שיטות בקרה איכות מתאימות מוחלות, רצף תא בודד יכול לספק הערכה אמינה יותר של CNVs ו aneuploidy כפי שהוא לא רגיש וממצאי הכלאה והפצת הטבועות דגי SKY. עם זאת, רבים של היישומים האחרונים של רצף תא בודד לא אושש על ידי הערכה יסודית של הרגישות וסגולית של השיטות ומנתח. ואכן, חלק מן הגישות אנליטית שמוצג מחקרים אחרים המשויכים תדרים גבוהים (> 50%) של שקר חיובית CNV מכנה ^12. הגישה נתאר נבדקה בקפדנות באמצעות תאים של KNנטל CNV עצמו כדי לקבוע שיעורי גילוי אמת ושקר לייעל את הרגישות והסגוליות של זיהוי CNV ^12. באמצעות בקרת איכות גישות אנליטיות מתוארת בפרוטוקול זה, כ 20% של 5 רווחים Mb, 75% עליה של 5 הפסדים Mb, וכל CNVs עולה על 10 Mb ניתן לאתר. למרות קביעת שיעור גילוי השווא של רצף תא בודד קשה, אנחנו מעריכים שזה יהיה פחות מ -25%. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על תאים ממגוון מקורות, סקריפטים יכול להיות שונה כדי להתאים את הרזולוציה של זיהוי CNV, ואת הפרוטוקול ניתן להתאים לזהות וצורות אחרות של שינויי הגנומי.

יש מגוון של אמצעי מתנער רקמות טריות לתוך תאים בודדים, ורבי פרסומים לתאר הליכים מותאמים במיוחד ברקמות ספציפיות, כגון ²⁴ עור ²⁵ מוח. אנחנו מעדיפים לבודד תאים בודדים על ידי מיקרו אספירציות שכן היא מאפשרת FO r הערכה חזותית של כל תא כדי להיות רצף. עם זאת, אפשר גם לבודד תאים בודדים ידי מיון תא מופעל פלואורסצנטי (FACS) ²⁶ והתקני microfluidic ^27. אם בידוד תא יחיד הגברה הגנום כולו מתבצע באופן ידני, סביר לבודד להגביר עד תאים ארבעים אחד יושב. על מנת לקבל נתוני רצף תא בודד באיכות גבוהה, חשוב כי ההגברה של הגנום תא בודד היא אחידה ושלמה. אנו מוצאים כי איכות יחיד תאים המבודדות כמו גם את היעילות של תמוגה יש הגברת השפעה משמעותית על איכות נתוני רצף. ככזה, יש לקצור את התאים מן סביבת מולדתם רק לפני הבידוד והגברת הגנום כולו צריך להתחיל מייד לאחר תאים מבודדים. יתר על כן, צעד תמוגה והפיצול יש לפעול בדיוק כפי שמתואר בשלבי 2.3-2.6.

"> האלגוריתמים יכול להיות מותאם כדי לשנות את הרזולוציה של זיהוי CNV, עם השפעות מנוגדות על הרגישות והסגוליות ^12. כמו כן, ניתן להתאים את הספים כדי לזהות aneuploidy כל כרומוזום בסביבה של ¹¹ tetraploidy. עם זאת, אנו מוצאים כי הגישה שלנו מוגבלת לגילוי CNVs יותר מ -5 Mb, כרעש הציג במהלך הגברת הגנום כולו מסבך זיהוי של וריאנטים קטן ^12. שיפורים עתידיים בגישות הגברת הגנום כולו צריכים בסופו של דבר לשפר את הרזולוציה של זיהוי CNV באמצעות רצף תא בודד.

רצף תא בודד מאפשר לחקירה של שינויים במספר העותק יחידים לא אבל גם וריאציות נוקלאוטיד בודדות ^{28, 29} ו וריאציה מבנית ^30. הפרוטוקול שלנו עבור בידוד תא בודד יכול להיות מיושם לענות que אלה אחריםstions. עם זאת, הבחירה של שיטת הגברת הגנום כולו תלויה ביישום המסוים. השיטה המתוארת פרוטוקול זה, המתבסס על תגובת שרשרת פולימראז, הוא מתאים ביותר לאיתור שינויי מספר העותק כי היא מזוהה עם רמות נמוכות יותר של הטית הגברת ^32. על חקירה וצורות אחרות של שינויי הגנומי, כגון פולימורפיזם נוקלאוטיד בודד, שיטות אחרות של הגברת הגנום כולו הם האמינו להיות יותר מתאימים ^{31, 32.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes	Sigma	A5177
PVC tubing (ID 3/16", OD 5/16", ~1 foot)	VWR	89068-500
PVC tubing (ID 5/16", OD 7/16", ~6 inches)	VWR	89068-508
Acrodisc Syringe Filter with HT Tuffryn Membrane (diameter 25 mm, pore size 0.2 µm)	VWR	28144-040
Serological pipette (5 mL)	BioExpress	P-2837-5	Any plastic 5 mL pipette should suffice
In-Line Water Trap for Oxygen Use	Amazon.com	700220210813
Capillary Melting Point Tubes (ID 0.8-1.1 mm, 100 mm length)	VWR	34502-99
Modeling clay	VWR	470156-850
Petri dish (150 mm diameter)	VWR	25384-326	Surface should be non-adherent to facilitate aspiration of single cells
Hard-Shell Full-Height 96-Well Semi-Skirted PCR Plates	Bio-Rad	HSS9601	Any 96-well PCR plate should suffice
96-well tissue culture plate	VWR	62406-081	Any 96-well tissue culture plate should suffice
GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit	Sigma	WGA4
Microseal 'A' Film	Bio-Rad	MSA5001
Mini plate spinner	Thomas Scientific	1225Z37
Thermal cycler	Bio-Rad	1861096	Any thermal cycler should suffice so long as it can accommodate a 96-well PCR plate
Agencourt Ampure Beads	Beckman Coulter	A63880
Dynamag-2 Magnet	Thermo Fisher Scientific	12321D	Any similar magnetic tube strip should suffice
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1096
Nextera XT Index Kit	Illumina	FC-121-1012
Complete kit (optimized for Roche LightCycler 480)	Kapa Biosystems	KK4845	This kit is optimized for the Roche LightCycler 480 real-time PCR machine. If using a different machine, substitute a kit optimized for your machine.