ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Summary

אנו מציגים פתרון תוכנה למעקב חצי אוטומטי של ריכוז חלבון יחסי לאורך של בליטות תאיות דינמיות.

Abstract

פילופודיה הן בליטות תאיות דינמיות, דמויי אצבע, הקשורות בהעברה ובתקשורת תאית. על מנת להבין טוב יותר את מנגנוני האיתות המורכבים העומדים בבסיס החניכה הגופנית, הארכה וייצוב או נסיגה שלאחר מכן, חשוב לקבוע את פעילות החלבון הזמני-הטמפורלי במבנים דינמיים אלה. כדי לנתח את תפקוד החלבון ב filopodia, פיתחנו לאחרונה אלגוריתם חצי אוטומטי מעקב שמתאים לשינויים צורה filopodial, ובכך מאפשר ניתוח מקבילי של הדינמיקה בליטה וריכוז חלבון יחסית לאורך כל אורך filopodial. כאן, אנו מציגים מפורט שלב אחר שלב פרוטוקול עבור טיפול התא אופטימיזציה, רכישת התמונה וניתוח תוכנה. בנוסף, אנו מספקים הנחיות לשימוש בתכונות אופציונליות במהלך ניתוח תמונות וייצוג נתונים, וכן הנחיות לפתרון בעיות עבור כל השלבים הקריטיים לאורך הדרך. לבסוף, אנו כוללים גם השוואה של דEscribed תוכנת ניתוח תמונה עם תוכניות אחרות הזמינות לכימות filopodia. יחד, הפרוטוקול המוצג מספק מסגרת לניתוח מדויק של הדינמיקה חלבון ב בליטות filopodial באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.

Introduction

שליטה ספציו-טמפורלית של חלבונים רגולטוריים אקטין קשורה דינמיקה פילופודיום ^{1 , 2} . מעקב ריכוז חלבונים בריכוז מרחבי לאורך כל אורך filopodial דרך הזמן ולכן חיוני כדי לקדם את הבנתנו את המנגנונים ביסוד היזום, הארכה, ייצוב או קריסה של מבנים דינמיים אלה ^{3 , 4} . שלא כמו ניתוח חלבון cytosol, שבו שינויים רבים צורה התא מתרחשים בקנה מידה גדול יותר, filopodia הם מבנים דינמיים מיקרו אשר כל הזמן אבזם ⁵ וכופף, ובכך מונע ניתוח באמצעות גישה פשוטה כגון קו סריקה.

פתרונות תוכנה שונים למעקב אחר הצורה filopodial זמינים ^{6 , 7 , 8 , 9} . כמו כןIse, תוכנה למעקב ratiometric של הדינמיקה חלבון בתוך הגוף התא פותחה ^{10 , 11} . כדי לשלב מעקב אוטומטי של הצורה filopodial וניתוח חלבון זמן ספטיו, פיתחנו לאחרונה ניתוח תמונה תוכנה המבוססת על קמור גוף האלגוריתם ¹² . שיטת ניתוח חדשנית זו, המופעלת באמצעות ממשק משתמש גרפי (GUI), משלבת לראשונה את ריכוז החלבון היחסי לאורך אורך הגדילה ומהירות הגדילה, ומאפשרת מדידה מדויקת של התפלגות חלבונים מזמניים-טמפורליים ללא תלות בתנועה של אלה מבנים דינמיים ¹² .

הרעיון מאחורי התוכנה (קוד המקור זמין באופן חופשי, ראה להלן) היא כי אחד הקודקודים של גוף קמור יעלה בקנה אחד עם קצה של פילופודיום ( איור 1 א ). על ידי הסתכלות על מסגרת הבאהR את הקודקוד הקרוב ביותר של גוף קמור, עצה מרגש ניתן לעקוב לאורך כל הסרט. לאחר קצה מזוהה בכל מסגרת, המיקום שלה משמש לצייר ציר על ידי הצטרפות קצה עם נקודת התייחסות בבסיס של פילופודיום ( איור 1 ב ). לבסוף, תוך שימוש בנקודות ראשיות שווה, שתפקידן נקבע על ידי הפיקסל החציוני בעוצמה מקסימלית לאורך הקו האורתוגונלי לציר, משמשות לקביעת עמוד שדרה העוקב אחר הצורה הפילופודיאלית. ניצול של עמוד שדרה זה מסתגל, kymograph מופק כדי לעקוב אחר הצמיחה filopodial ריכוז חלבון עד שלושה ערוצים לאורך אורך filopodial ( איור 1C ).

איור 1: עקרון העבודה של תוכנת ניתוח תמונה. ( א ) האלגוריתם שמאחוריהתוכנה. ב Step1 המשתמש מציין את הפניה (בסיס) ואת קודקוד (קצה) של פילופודיום. בשלב 2-1 את עמוד השדרה של פילופודיום מתקבל באמצעות פיקסל חציון עם ערך אינטנסיביות מקסימלית. בשלב 3 את עמוד השדרה משמש פרופיל חלבון מרחבי פרופיל. בשלב 2-2 התוכנה עוקבת באופן אוטומטי את קצה במסגרת הבאה. כל התהליך חוזר. ( ב ) תצלום של אלגוריתם עם פילופודיום אמיתי מציגה אלמנטים חשובים כגון גוף קמורה כי הוא משמש למעקב. ( ג ) סקירה של פרמטרים שניתן למדוד עם האלגוריתם. נתון זה שונה מהתייחסות ¹² . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

תוכנת ניתוח התמונה מופעלת ב Matlab (המכונה תוכנה תכנות) באמצעות שימוש גרפיממשק. כדי למקסם את הגמישות והחוסן להגדרה הניסויית, המשתמש יכול להתאים סדרה של פרמטרים למעקב ( למשל זווית כיפוף מותרת ותנועה בין-מסגרתית) וכן לבצע כמה תיקונים לסרטים ( למשל חיתוך, סיבוב, הסרת אובייקטים לא רצויים) ( איור 2 א וטבלה 1) .

GUI	לא.	חובה	תאור					שם (ב- GUI)
# 1	1 א	Y	טעינת קובץ .tiff מוערמים המייצגים את גוף התא (עם תיבת מסומנת) או ליצור גוף תא superimposed מערוצים					סלבודי
# 1	1b	Y	טוען קובץ תמונה מוערם המתאים לחלבון 1					חלבון 1
# 1	1 ג	Y	טעינת קובץ תמונה מוערם המתאים לחלבון 2					חלבון 2
# 1	1 ד	Y	טעינת קובץ תמונה מוערם המתאים לחלבון 3					חלבון 3
# 1	1e	N	איפוס הכל לטעינת קובצי תמונות מוערמים מראש					אִתחוּל
# 1	2 א	Y	גלילה בר כדי לקבוע את המסגרת הראשונית לניתוח בחלון GUI # 2					NA
# 1	2 ב	Y	גלילה בר כדי לקבוע את המסגרת הסופית לניתוח בחלון GUI # 2					NA
# 1	2 ג	Y	סרגל גלילה המייצגמסגרת nt					NA
# 1	2 ד	N	הערך האפור של הפיקסלים שמתחתיו כל הפיקסלים יוגדרו לאפס					NA
# 1	2e	N	הערך האפור של הפיקסלים שמעליהם כל הפיקסלים יוגדרו לערכים מקסימליים					NA
# 1	2 ו	N	הגדר את ערכי העוצמה של הפיקסלים שצוינו על ידי <2e> <2f>					מַעֲרֶכֶת
# 1	2 גרם	N	הפעל את הסרט מותאם-עוצמה					לְשַׂחֵק
# 1	2h	N	חתוך תמונה					יְבוּל
# 1	2i	N	סובב תמונה					לְסוֹבֵב
# 1	2	N	מחק אזורים בכל הערימה					מחק אזורים
# 1	3 א	Y	לחץ כדי לפתוח את 'חלון ניתוח' (חלון GUI # 2)					חלון מעקב
# 1	3 ב	Y	הזן את הגודל של פיקסל במיקרונים					הזן גודל פיקסל
# 2	4	Y	לחץ כדי ליצור את התמונה גבול / קצה של גוף התא על גבי					גְבוּל
# 2	5	Y	לחץ כדי לבחור את הבסיס ואת קצה filopodia					הפניה
# 2	6 א	Y	הזן את מספר הפלחים או הצמתים					לא של מקטעים
# 2	6 ב	Y	הזן את אורך הסריקה (בניצב לציר)					רוחב סריקה
# 2	6 ג	Y	הזן את אורך מעל אשר filopodia מתחיל כיפוף					דקות מדויקות לאחר
# 2	6 ד	Y	הזן את הרדיוס של מעגל איתור קצה (כלומר אזור שבו קודקוד יכול להיות מקומי במסגרת הבאה)					רדיוס של איתור קצה
# 2	6e	Y	הזן את הזווית המקסימלית פילופודיום יכול לכופף מן הציר האנכי					זווית סף
# 2	6F	N	הוסף נקודות התייחסות לבסיס ולעצה עבור מסגרת ספציפית זו					בחר התייחסות
# 2	6 גרם	N	הזן את אורך מעל אשר filopodia מתחיל כיפוף עבור מסגרת מסוימת					דקות מדויקות לאחר
# 2	6h	N	הזן את הרדיוס של מעגל האיתור עבור המסגרת הספציפית הזו					רדיוס של איתור קצה
# 2	6i	N	לאחר הזנת כל הפרמטרים עבור המסגרת הספציפית לחץ כדי לאחסן את הערכים לזיכרון ולקובץ לעיון נוסף					לְהוֹסִיף
# 2	6	N	לחץ כדי למחוק את הפרמטרים באופן ידני עבור אותה מסגרת					לִמְחוֹק
# 2	6k	N	לחץ כדי למחוק את כל הפרמטרים המאוחסנים ידנית באמצעות 'לוח תכונות אופציונלי' עבור כל המסגרות					אִתחוּל
# 2	6l	N	בדוק לפני המעקב כדי לאחסן את כל תוצאות המעקב בזיכרון לצורך הפניה בעתיד					היסטוריה עקבות
# 2	7	Y	לחץ כדי להתחיל במעקב					לעקוב ולנתח
# 2	8 א	N	לחץ כדי להתחיל מעקב אחר עוצמת ערוץ חלבון					ניתוח חלבון אינטנסיבות
# 2	8 ב	N	בדוק כדי לעקוב אחר עוצמת ערוץ חלבון לאורך אורך filopodial					פילופודיה שלמה
# 2	8 ג	N	בדוק עבור מעקב אחר חלבון התייחסות או חלבון A					פרוטאין
# 2	8 ד	N	בדוק את המעקב אחר החלבון B					פרוטיין
# 2	8e	N	בדוק את המעקב אחר החלבון C					ProteinC
# 2	8F	N	בדוק כדי לעקוב אחר עוצמת החלבון הממוצע ב thעצה					קצה מוביל
# 2	8g	N	הזן את אורך הקצה					אורך עצה
# 2	8h	N	הזן את המרחק המינימלי מבסיס שמעליה מתחיל הקצה להיווצר					סף
# 2	8i	N	לחץ כדי לשמור את התוצאות המוביל ניתוח קצה לקובץ					לחץ על הכפתור
# 2	9 א	N	לחץ כדי להתחיל ניתוח חלבון ratiometric					לְהַשְׁווֹת
# 2	9b	N	בדוק כדי להשוות בין חלבון B לגבי A					Log10 (B / A)
# 2	9 ג	N	בדוק כדי להשוות חלבון C ביחס A					Log10 (C / A)
# 2	9d	N	בדוק כדי להשוות חלבון B ביחס A בקצה					Log10 (B / A)
# 2	9e	N	בדוק כדי להשוות חלבון C ביחס A בקצה					Log10 (C / A)
# 2	10 א	N	בחר מפת צבע אחרת (ברירת מחדל: Jetplot)					מפת צבע
# 2	10 ב	N	ערוך את colormap					עריכת colormap

טבלה 1: סקירה כללית של כל הפונקציות המופיעות ב- GUI Windows # 1 ו- # 2.

ברגע שזה נעשה, התוכנית יוצרת גוף קמורה באופן אוטומטי מסלולים קצה לאורך הסרט. פרמטרים שחולצו מהסרט, כגון קימוגרפיה רטיומטרית, מהירות גדילה ואורך פילופודיאליRe מוצג גם מאוחסן בתיקיית העבודה כתמונות וכקובצי נתונים. פרמטרים אחרים כגון החיים filopodial, קצב הצמיחה שיעור נסיגה לאחר מכן ניתן לחלץ ונותח נוספת מקבצי הנתונים המאוחסנים ( איור 2 ב ).

איור 2: ממשק משתמש גרפי לשימוש בתוכנת ניתוח התמונות. ( A ) GUI חלון # 1 משמש לטעינה ועיבוד של תמונות. התוכנית יכולה לטעון עד 3 ערוצי חלבון, לפיה 2 ערוצים מושווים זוג חכם. החלון מגיע עם חובה (כחול) תכונות אופציונלי (ירוק) לעיבוד מראש את התמונות לפני המעקב ( B ) GUI חלון # 2 משמש למעקב אחר פילופודיום, כמו גם ספטיו- temporal ו יחס- metric ניתוח חלבון. שוב, תכונות אופציונליות מסומנות בירוק. נתון זה היה modifiEd מתוך התייחסות ¹² . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להכנת המדגם וטיפול בתוכנה. אנו מתחילים עם הוראות מפורטות על תאים culturing ו רכישת סרטים אופטימיזציה עבור ניתוח התמונה. סעיף זה על רכישת נתונים ואחריו תיאור מפורט להפעלת תוכנת ניתוח התמונה. לאורך הפרוטוקול, אנו מציגים צעדים קריטיים ותכונות אופציונליות שיש לקחת בחשבון בעת ​​איסוף ועיבוד נתונים. לבסוף, אנו מנתחים filopodia ממערכות מודל שונים עם תוכנת ניתוח התמונה, לפני הסגירה עם השוואה של התוכנה המתוארת ניתוח התמונה עם תוכניות אחרות הזמינות לכימות filopodial ודיון על מגבלות והכיוון העתידי.

Protocol

1. תרבות התא

1. תרבות HeLa או תאים COS ב Dulbecco השתנה הנשר בינוני (DMEM) המכיל 4.5 גרם / L גלוקוז D, L-alanine-L- גלוטמין dypptide, pyruvate, 10% בסרום שור עוברית, ו 10 יחידות / מ"ל ​​של פניצילין / סטרפטומיצין. תרבות נוירונים בתרבות התקשורת ללא L- גלוטמין, חומצה גלוטמית או חומצה אספרטית, בתוספת 0.5 מ"מ L-alanine-L- גלוטמין dipeptide, נטול תוסף נוירונים חינם ו -10 יחידות / מ"ל ​​של פניצילין / סטרפטומיצין.
2. לאחר 40% confluency הוא הגיע, transfect תאים עם בונה של בחירה באמצעות מגיב transfection לפי הוראות היצרן. שמור תאים transfected בחממה ב 37 ° C ו 5% CO ₂ עבור 15-18 שעות.
3. כדי להפחית את השינויים pH ו osmolarity (עקב אידוי) במהלך רכישת התמונה, למלא את תא התרבות תאים (לפני הדמיה) עד 90% עם 37 ° C מראש חימם בינוני המכיל 20 מ"מ -4 (2-hydroxyethyl) -1 -Ppiperethethanesulfonic חומצה (HEPES). לאטוםהמכסה, להחיל שכבה דקה של שומן ואקום על החלק הפנימי של המכסה בעדינות לחץ על החדר התרבות המכיל את התאים transfected.

2. רכישת תמונה

הערה: אורך filopodia משתנה מ 2-10 מיקרומטר ¹³ . Filopodia לגדול במהירות ממוצעת של 0.05-0.1 מיקרומטר / ים ^{13 , 14} .

1. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ עם מטרה 60X או 100X ולא binning פיקסל (כאן, מיקרוסקופ דיסק מסתובב confocal). השתמש בשיעורי רכישה גבוהים מ 1 הרץ (הרץ) כדי לעקוב אחר הדינמיקה filopodial. כדי למזער out-of- להתמקד חפצים, filopodia התמונה קרוב לממברנה הבסיסית ( כלומר משטח המצע).
2. כדי להבטיח מעקב חלקה, להתאים את זמן החשיפה של המצלמה ועוצמת לייזר כך יחס אות לרעש (SNR) גדול יותר מאשר 4. הימנע הרוויה של ערוצים בודדים ( כלומר פיקסל ערכים של255 עבור תמונות 8 סיביות ו 65,535 עבור 16 סיביות תמונות), כמו זה ימנע ניתוח התמונה הבאים.
3. כדי למנוע דימום, רק להשתמש בתגיות הקרינה תואם קווי לייזר מסננים של המיקרוסקופ (לפרטים ראה התייחסות ¹⁵ ).

3. עיבוד תמונה מראש

הערה: השתמש בתוכנת ImageJ או בתוכנה זמינה אחרת כדי לעבד מראש תמונות ^{16 , 17} .

1. אם המדגם נע, נכון להיסחף לרוחב באמצעות תוכנה זמינה ( למשל https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ) לפני הניתוח. לא לכלול סרטים עם סחף צירית (כלומר תנועה בכיוון z).
2. רקע נכון ( כלומר, ערכים אפורים של אזורים מחוץ לתא), הלבנה ( כלומר הפסד מתמשך אם עוצמת הקרינה עקב פגיעה בחלבונים הקרינה) ו-שוקת דימום אפשרי ( כלומר האות משפעת אחתאו בדיקה של שני ערוצים) באמצעות תוכנה זמינה ( למשל http://imagej.net/Category:Plugins ו ^{16 , 17} ).
   הערה: עוצמות הקרינה של ערוצים בודדים אינם משתנים על ידי התוכנה.
3. כדי להבטיח את ניתוח התמונה הבאים, לשמור סרטים המתאימים ערוצי חלבון מסוים בקנה מידה אפור כמו ".tiff" בפורמט קובץ מוערמים בתיקייה עבודה.
   הערה: המידות ( כלומר , גודל, אורך) של ערימות חייב להיות זהה עבור כל הערוצים.

4. ניתוח תמונה - שלב 1: טען תמונות

הערה: התוכנה המתוארת כאן נכתבה ב- Matlab (המכונה תוכנת תכנות) ותפעל רק עם תוכנית זו.

1. הורד את התיקיה zip המכיל את כל הקבצים הדרושים לניתוח תמונות מהאתר הבא: https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softwהם /. לפתוח ולהעתיק קבצים לתוך תיקיית העבודה.
2. לאחר ההתקנה, לפתוח את תוכנת התכנות ולהפעיל 'filopodiaAnalysisM3.fig'. חלון GUI # 1 יפתח כפי שמוצג באיור 2 א .
3. טען את הקבצים הנפתחים "tiff" המתאימים לחלבון מסוים של עניין בחלון GUI מס '1 באמצעות הכפתורים <1b> לחלבון A, <1c> לחלבון B, <1d> לחלבון C. ראה איור 2 וטבלה 1 לפרטים.
   הערה: חלבון מוצג בחלון GUI # 1 משמש כערוץ הפניה לניתוח הסופי של הראיומטריה.
4. יצירת תמונה על גבי תא של חלבונים על ידי לחיצה על <1a>.
5. לחץ על כדי להקצות את המסגרת הראשונה ואת <2b> למסגרת האחרונה המשמשת לניתוח.
6. לחלופין, לחתוך את האזור של ריבית (ההחזר על ההשקעה) המכיל את הפילופודיום של עניין באמצעות לחצן <2h>, לסובב את התמונה uלחצן 'שירה' <2i> או מחק אזורים לא רצויים באמצעות כלי הציור החינמי <2j>.
   הערה: כדי לייעל את ניתוח התמונה, מומלץ לבודד את ההחזר על ההשקעה ( כלומר , לחתוך, לסובב, למחוק) יחד עם השלבים מראש אחרים (חיסור רקע, תיקונים אקונומיקה, וכו ') באמצעות ImageJ.
7. להזיז את המחוון <2c> עבור כל מסגרת עבור בקרת איכות ולבדוק אם הפילופודיום נשאר גלוי בבירור לאורך כל הסרט.

5. ניתוח תמונה - שלב 2: יצירת מעקב

1. לחץ על כפתור <3a> בחלון GUI # 1 כדי לפתוח את חלון GUI # 2 (ראה איור 2 ב ).
2. לחץ על כפתור <4> בחלון GUI # 2 כדי ליצור את המסכה של גוף התא על גבי (שנוצר בחלון GUI # 1 לאחר לחיצה על >). התוכנית גם יוצרת את הגבול של המסכה, שם הקמור גוף מיושם כדי לקבל את נקודות הקודקוד.
3. קליCk כפתור <5>; יופיע סמן. השתמש הסמן כדי לבחור את הבסיס (שממנו משם המרחק של קצה פילופודיאלי נמדדת) ואחריו קצה filopodia במסגרת שבו הוא מופיע לראשונה. לשם כך, הזז את המחוון בחלון מס '2).
   הערה: כדי למזער שגיאות בפלט הנתונים, הנח את נקודת הבסיס אנכית מתחת לעצה הגופנית לאורך הציר. מיצוב נקודת הבסיס במקומות אחרים ( כגון מעבר רוחבי) עשוי להציג הטיה כיוונית בערכי הקרינה בתוך גוף התא.
4. בחר את אורך הסף (מעל אשר filopodia יהיה להתכופף) באמצעות <6c>.
   הערה: אורך זה מוגדר כמרחק בין נקודת הבסיס (נבחר באמצעות <5>) וגבול גוף התא ( כלומר האזור שממנו מתחיל הפילופודיה). המרחק נמדד בפיקסלים.
5. ציין את מספר המקטעים המשמשים כדי להשוות את הצורה של filopodia בתיבה <6a>.
   הערה:המספר המרבי של מקטעים תלוי באורך המקסימלי שמגיע על ידי פילופודיום, אבל גם איך פילופודיום מתכופף. אל תבחר מספר מקטעים גדולים ממספר הפיקסלים בין הבסיס לקצה ( כלומר , אורך הסף). בחירת פלחים נוספים מאורך הסף המוגדר בשלב 5.4. ( כלומר מספר פיקסלים בין הבסיס ואת קצה) תביא overestimation של אורך של פילופודיום.
6. ציין את רוחב הסריקה, הפועל כסורק אופקי למיקום הצמתים, ב <6b>.
   הערה: צמתים אלה משמשים את התוכנית כדי להתאים את הקו שהצטרף הבסיס ואת קצה עם הגוף של פילופודיום ( כלומר כדי ליצור את עמוד השדרה). כנקודת התחלה, לשים ערך בפיקסלים שווה אורך המרבי מוכפל גורם .
7. ציין את רדיוס הסריקה (בפיקסלים) בתיבה <6d>. השתמש בערך שהוא כ 50% יותר מאשר obשימש בין העקירה עצה בין מסגרת.
   הערה: שימוש ברדיוס סריקה גדול מאוד עלול לתפוס נקודות גוף קמור לא רצויות במסגרות שבהן אין עצה פילופודיאלית אמיתית ( למשל, מחוץ לתנועת המטוס או ל- SNR נמוך).
8. ציין את זווית ההטיה בתיבה <6e>.
   הערה: סף הזווית נקבע על ידי הזווית המקסימלית של פילופודיום הוא כיפוף במהלך הניתוח כולו. הגדרת סף הזווית מסייעת התוכנה כדי למנוע מעקב של מבנים לא רצויים גדל בצד של filopodia כאשר filopodia מתכופף לעבר הגוף התא. התוכנית פועלת באופן אמין עבור filopodia עם זווית הטיה פחות מ 45 מעלות מן הציר האנכי.
9. כדי להתחיל במעקב, לחץ על הלחצן 'מעקב וניתוח' בחלון GUI # 2. לחץ על התיבה 'היסטוריה עקבות' בחלון GUI # 2 כדי לשמור את פרוטוקול המעקב כולו לעיון בעתיד.
   הערה: לאחר השלמת הליך המעקב, מאוחסן אורך הפילופודיום בכל מסגרתאת הסדין בשם 'length_vel' של 'dynamics.xlsx' עבור הפניות בעתיד. כמו כן, כל שאר פרמטרים המעקב מאוחסנים בגיליון בשם "פרמטרים" של "dynamics.xlsx".
10. לחלופין, אם filopodia אינו מזוהה באופן אוטומטי בכל המסגרות, בצע את השלבים הבאים כדי לתקן ידנית עבור זה.
    1. בקר את המסגרת המתאימה באמצעות המחוון בחלון מס '2 ובחר ידנית את קצה הפילופודיום.
       הערה: מסגרות, כאשר נקודות גוף קמור לא מזוהים יוצגו על ידי אזור כחול בחלון המעקב של חלון GUI # 2. זה חובה לבדוק את "ההיסטוריה עקבות" כפתור לפני תוכנית המעקב היה ביוזמת גישה קואורדינטות קדוטיים באותה מסגרת.
    2. בחר את נקודות ההתייחסות (בסיס ואחריו טיפ) באמצעות <6f> ב- GUI Window # 2. ציין את הפרמטרים האחרים כגון 'אורך הסריקה', 'מדידה מדויקת לאחר' ו'זווית כיפוף מרבית '; עבור מסגרת כפי שמתואר צעדים 5.4-5.8.
    3. לחץ על הלחצן <6i> כדי לשמור את הפרמטרים החדשים (ספציפיים למסגרת אחת). יש לחזור על השלבים עבור כל המסגרות המצוינות על ידי האזור הכחול.
    4. בסיום, אתחל מחדש את תהליך המעקב באמצעות <7>.
       הערה: תיקון זה יכול לשמש גם אם התוכנית פתאום עובר מ filopodial אחד למשנהו בתוך סרט. כחלופה, שקול חיתוך סרטים המכילים filopodia מרובים.

6. ניתוח תמונה - שלב 3: ניתוח חלבון זמן ספטיו

1. עבור ניתוח ספציו-טמפורלי, בחר את התיבה המיוצגת על ידי <8b> ולאחר מכן את ערוץ החלבון המעניין (<8c> ו / או <8d> ו / או <8e>).
   הערה: חובה לבחור פרוטאין לפני ניתוח רטיומטרי (<9a>, <9b> ו / או <9c>) מאחר וחלבון A משמש כנקודת התייחסות.
2. לחץ על <8a>כדי ליזום מעקב חלבון לאורך אורך filopodial באמצעות עקבות שנוצר בשלב 5.9.

7. ניתוח תמונה - שלב 4: יחס חלבון ניתוח מטרי

1. סמן את תיבת הסימון <9b> או <9c> ולחץ על הכפתור <9a> כדי לקבל את החלקה הרטיומטרית הזמנית-ספקטורלית.
   הערה: כדי למנוע מצג שווא של ריכוז חלבון יחסי, התמונה ratiometric אינו מזויפים כמו X / Y אבל כמו יומן (X / Y). לשימוש עתידי, העלילה ratiometric מיוצא קבצי ". PNG" ו ".fig" פורמט, ונתונים מגרש גולמי מאוחסן בתוך "dynamics.xlsx" הקובץ.

8. ניתוח תמונה - שלב 5: ניתוח עצה פילופודיאלי

1. סמן את תיבת הסימון <8f> וציין את אורך הטיפ ואת אורך הסף מהבסיס באמצעות <8g> ו- . לחץ על הלחצן כדי לשמור את הנתונים לקובץ 'dynamics.xlsx'. לחץ על <ניתוח חלבון אינטנסיבות> כדי ליצור אתעקבות של עוצמות חלבון של קצה פילופודיאלי לשמור על ניתוח ratiometric.
   הערה: אורך העצה קובע את מספר הפיקסלים בקצה המשמש לניתוח. התוכנה תחזיר את הערך הממוצע בעוצמה של פיקסלים בקצה מעל כל מסגרת. אורך הסף קובע את המרחק המינימלי מהבסיס לקצה שמעליה מתחיל הפילופודיום (קצה פילופודיאלי) לגדול (וכאשר התוכנית מתחילה לעקוב אחר עוצמת העוצמה של הטיפ). אז אורך קצה צריך להיות קטן יותר מאשר אורך הסף.
2. לחץ על היחס הרצוי כדי לנתח באמצעות <9d> או <9e>.
3. לחץ על כפתור ההשוואה <9a> כדי ליצור את הנתונים ratiometric.

תוצאות

באמצעות תאים COS transfected עם סמן עבור אקטין נימי (F-tractin ¹⁸ , אדום) ואת הפניה cytosolic (ירוק), מצאנו אקטין עשיר filopodial בליטות ( איור 3 א , פאנל העליון). סדרות זמן הראו כי filopodia להרחיב במהירות לחזור ( איור 3 א , לוח באמצע). בא?...

Discussion

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט למעקב דינמיקה הצמיחה filopodial וניתוח של ריכוזי חלבון יחסית מבנים דינמיים אלה באמצעות אלגוריתם קמור האל. באמצעות התוכנה, עד 3 ערוצים ניתן להשוות זוג חכם בריצה אחת, לפיה הריכוזים היחסיים של שני ערוצים ( כלומר חלבונים) נקבע במהלך מחזור הרח...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Life Technologies	31966-021
10% Fetal bovine serum	Biochrom AG	L11-044
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668-027
1% penicillin/streptomycin	Biochrom AG	12212
Neurobasal Medium	Life Technologies	21103-049
B27	Life Technologies	17504-044
HEPES (1M stock solution)	Life Technologies	15630
Citrine-N1	Addgene	54593
Labtech	Thermo	155411
Glutamax-I	Thermo	35050-061
Hela	Leibniz Institute DSMZ	ACC-57
COS 7	Leibniz Institute DSMZ	ACC-60
3T3 cells	Leibniz Institute DSMZ	ACC-59
Microscope	Nicon Eclipse
Camera	Andor	DU888 Ultra
Confocal Unit	Yokagawa	CSU-X1
Pyruvate	Gibco	31966-021