JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כתב יד זה מתאר שיטה כדי להמחיש ולכמת תרגום לשפות אחרות אירועים בתאים subcellular. הגישה המוצעת כתב יד זה דורש מערכת הדמיה קונאפוקלית בסיסית, ריאגנטים, והוא מהיר וחסכוני.

Abstract

מנגנוני ויסות ה-mRNA תרגום מעורבים תהליכים ביולוגיים שונים, כגון פיתוח קו נבט, תאית התמיינות organogenesis, כמו גם מחלות מרובות. פרסומים רבים הראו בצורה משכנעת למנגנונים הספציפיים לווסת בחוזקה mRNA תרגום. עניין גדל בוויסות הנוצרות על-ידי תרגום של ביטוי חלבון הובילה בפיתוח שיטות רומן ללמוד ולעקוב אחרי דה נובו חלבון סינתזה ב- cellulo. עם זאת, רוב השיטות האלה הם מורכבים, הפיכתם יקר, לעיתים קרובות הגבלת מספר מטרות mRNA שניתן ללמוד. כתב יד זה מציעה שיטה הדורשת רק בסיסי ריאגנטים, מערכת הדמיה פלורסצנטיות קונאפוקלית כדי למדוד והמחש את השינויים בתרגום mRNA המתרחשים בכל שורת התאים בתנאים שונים. לאחרונה להשתמש בשיטה זו כדי להציג תרגום לשפות אחרות המבנים subcellular של תאים חסיד על פני תקופה קצרה של זמן, ולכן מציע את האפשרות להמחיש תרגום דה נובו לתקופה קצרה במהלך מגוון ביולוגי תהליכים או של אימות שינויים בפעילות translational בתגובה לגירויים מסוימים.

Introduction

התקנון של תרגום על ידי תאיים שונים יש בקשה רבים צוותי המחקר לפתח כלים חדשים, שיטות לקביעת ההתאמה subcellular של mRNA תרגום וחלבון מוסדר סינתזה1,2 ,3,4. ההתקדמות הטכנולוגית האחרונות אלה מאפשרים הבנה משופרת של המנגנונים הקשורים קולטנים upregulation תרגום או הדיכוי של mRNAs ספציפי במהלך תהליכים ביולוגיים, כגון פיתוח עצביים, סמים התגובה גרורות5 ,-6,-7,-8. עם זאת, רוב השיטות האלה דורשים יקר או מסוכנים ריאגנטים וציוד ספציפי כי לא יכול להיות זמין ברוב מעבדות. ככזה, פותחה שיטה חסכונית כדי לאפשר ההערכה המהירה של תרגום אירועים לעקוף באופן ספציפי אלה בעיות פוטנציאליות. שיטה זו מזהה חריפה האפנון translational להתרחש במהלך תהליכים תאיים ספציפיים, מאפשר גם עבור ההתאמה של תרגום באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

השיטות המתוארות כאן שימשו כדי לפקח על תרגום לשפות אחרות בתוך תאי subcellular שנקרא חניכה מתפשטת מרכזי (SIC)5. SICs הם מבנים ארעיים נמצאו בתאים הזריעה מותאמים על מתחמי אדהזיה המתהווה. למרות SICs, מתחמי אדהזיה ברורים, וגורלם הדוק. אכן, SICs ידועים להיעלם בהדרגה עם ההבשלה מורכבים אדהזיה מוקד לתוך אתר אדהזיה בשלב הראשוני של הידבקות. מצאנו כי RNA מחייב חלבונים ידוע בקרה ספציפית על תרגום ה-mRNA (למשל, Sam68, FMRP, ו G3BP1) ומבנים polyadenylated RNAs היו מועשר בתוך אלה5. שימוש בשיטות המתוארות כאן, הראינו כי ברגולציה של mRNA SIC-הקשורים תרגום משמש מחסום ומאפשר נזרע תאים כדי לאחד אדהזיה תא. שיטה זו, המבוססת על תאגיד puromycin, יכול להיחשב גירסה מותאמת של חישת משטח תרגום assay (שקיעה). פותח במקור כדי למדוד את המחירים סינתזת חלבון העולמי באמצעות של חומצת אמינו שאינן radioactively שכותרתו, חלבון puromycilation מציע דרך יעילה כדי להמחיש סינתזה של חלבון דה נובו 9. שיטה זו מתבססת על ההתנהגות מהותי של puromycin, אנטיביוטיקה החוסמת תרגום דרך שרשרת מוקדמת סיום ריבוזום10. אכן, puromycin הוא מקביל מבחינה מבנית tyrosyl-tRNA, המאפשר השתלבות מתארך פפטיד שרשראות דרך היווצרות של קשר פפטידי. לעומת זאת, מחייב puromycin שרשרת פפטיד גדל מונעת של קשר פפטידי חדשה נוצרת עם הבא aminoacyl-tRNA, מאז puromycin יש קשר אמיד hydrolysable במקום הקשר אסתר hydrolysable נמצאו ב- tRNAs. לפיכך, שילוב של puromycin לתוך מתארך polypeptides תוצאות במהדורה מוקדמת של polypeptides puromycilated קטום רבים המתאימים מתורגם באופן פעיל mRNA9,11,12 .

באמצעות שיטה זו, ניתן היה להעריך פעיל תרגום בתוך אלמנה זמן קצר (למשל, 5 דקות) במהלך אדהזיה הסלולר באמצעות של נוגדנים ספציפיים נגד puromycin על תאים היו בתוספת האנטיביוטיקה לתקופות 5-מין בנקודות זמן שונות במהלך תהליך אדהזיה5תאים. הדיוק של שיטת זו מסתמכת על נוגדנים ספציפיים מאוד נגד את moiety puromycilated. זיהוי immunofluorescent מפוליפפטיד puromycilated מספק של repartition subcellular הכללי של mRNA שתורגם, אשר גם ניתן לכמת בדיוק רב באמצעות מערכות הדמיה קונפוקלי.

לכן, השיטה מציעה אופציה רלוונטית עבור מספר רב של מעבדות לימוד מנגנוני הרגולציה translational המעורבים בתהליכים כגון פרור עצביים6,13,14, 15, מורפוגן mRNA לוקליזציה ותרגום במהלך פיתוח16,17. זה גם מתאים במיוחד לימודי תרגום לשפות אחרות או ממודר במהלך מהיר אירועים ביולוגיים כגון נדידת תאים, הדבקות או חדירה או להעריך פשוט טיפולים בסמים עלול לגרום שינויים translational5, 7 , 18. בסך הכל, שיטה זו מאפשרת עבור הפריט החזותי של אירועים תרגום לשפות אחרות או מבוקר בצורה מהירה, מדויקת וחסכונית.

Protocol

1. נחישות של תנאים Puromycilation

הערה: טכניקה זו מתאר את השיטה להערכת תרגום לשפות אחרות במהלך תהליך 5 אדהזיה תא MRC-5. כפי puromycilation יכול להיעשות בתא כלשהו, חשוב למטב את התנאים puromycilation עבור שורות תאים מסוים לשמש, כי התנאים הטיפול אינם זהים עבור כל קו תא מבחינת הריכוז puromycin, את הרצוי זמן הדגירה. כדי להראות כמה תנאים אלה מוגדרים, שלוש שורות תאים דוגמה (קרי, הלה, MRC-5 ו- 7-מה) טופלו עם הגדלת ריכוזי puromycin לזמנים שונים דגירה ( איור 1).

מספרים זהים
  1. הגידול של תאים בצלחת 24-ובכן ב- 0.5 מ ל המתאים להשלים תרבות בינוני h 16 לפני המבחן. זרע 30,000 MRC-5 תאים, התאים הלה 50,000 או 50,000 תאים מה-7 לכל טוב. הקפד להימנע מחריגה 60-70% הנהרות (איור 1 א').
  2. הכן 6 צינורות עם mL 1.5 תא שלם של תרבות בינוני עם הגדלת ריכוזים של puromycin (0, 5, 10, 15, 20, ו 30 µg/mL). חם מראש ב 37 º C
  3. עבור כל ריכוז של puromycin בינוני (שלב מוכן ב- 1.2), העברת 0.5 מ של כל צינור לתוך צינורות חדשים 6 ולהוסיף cycloheximide-ריכוז הסופי של µg 50/mL כל 6 צינורות חדשים. חם מראש ב 37 º C
  4. לשנות את המדיום עם 0.5 מ של תרבות שלמה בינוני (שורה 1 ו- 2). השורה השלישית, הוסיפו 0.5 מיליליטר בינוני תרבות מלאה בתוספת 50 µg/mL של cycloheximide ( איור 1B).
    הערה: טיפול Cycloheximide הוקם של הפקד שלילי הטוב ביותר עבור puromycilation חלבון בשל יכולתו לחסום את התארכות תרגום. כי puromycin התאגדות דורש תרגום התארכות, טיפול cycloheximide מוביל לאובדן של puromycilated חלבון אותות 5 , 18-
  5. תקופת דגירה של 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2).
  6. להוסיף 0.5 מ"ל של המדיום puromycin מוכן בשלב 1.2 על השורה השניה כדי לקבל ריכוזים הסופי של 0, 2.5, 5, 7.5, 10 ו- 15 µg/mL, בהתאמה, בעמודות A, B, C, D, E ו- F. במקביל, להוסיף 0.5 מ של puromycin בתוספת cycloheximide המדיום (שלב 1.3) בשורה השלישית ( איור 1C).
  7. תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2).
  8. להוסיף 0.5 מ"ל של המדיום puromycin מוכן בשלב 1.2 לשורה הראשונה כדי לקבל ריכוזים הסופי של 0.0, 2.5, 5, 7.5, 10 ו- 15 µg/mL ( איור 1C).
  9. תקופת דגירה של 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2).
  10. לרחוץ כל אחד מן שורות 1-3 עם 1 מ"ל של קרח 1 X באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) 5 דקות לאחר התוספת של puromycin כדי בארות של השורה הראשונה (לשטוף פעמיים). להוסיף µL 75 מאגר X Laemmli 1 (4% נתרן גופרתי dodecyl (מרחביות), 4% מרקפטואתנול, M HCl טריס 0.120 pH 6.8, גליצרול bromophenol כחול, ו-10% 0.004%) כדי להשיג כל-תא lysates עבור כל תנאי.
  11. לרוץ 10% מרחביות-לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד) באמצעות 1/3 של הדגימות מוכן כדי להעריך puromycin ההתאגדות.
    1. לקבוע רמת התאגדות puromycin על ידי ניתוח תספיג באמצעות נוגדן אנטי puromycin (12 יח 10) מדולל ביחס של ערים ב מאגר הדגירה נוגדן ראשוני (2% שור אלבומין (BSA)), 430 מ מ NaCl, 10 מ מ טריס pH 7.4 ו- 0.01% אזיד הנתרן).
      הערה: להחליפן בתמונות המתאים תמציות קו תא שונים שנעשו כפי שמתואר בשלב 1 מוצגות כדוגמאות באיור 2.

2. ב- Cellulo לשפות אחרות תרגום חזותי

הערה: בטכניקה המתוארת כאן שימש להערכת תרגום לשפות אחרות בתוך SICs בתאים MRC-5 במהלך תהליך אדהזיה 5. למרות MRC-5 תאים משמשים כאן, שורות תאים אחרים ניתן להשתמש עם המתודולוגיה באותו שמתואר בשלב 2.1.

  1. תא הכנה-
    1. ניתוק MRC-5 תאים באמצעות 0.25% טריפסין/2.21 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) בהאנק ' s מאוזנת פתרון מלח (HBSS). גלולה התאים על ידי צנטריפוגה (5 דקות ב- 200 x גרם) בשפופרת צנטרפוגה חרוט 15-mL ו להשעות אותם ב- Dulbecco ' s השתנה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% עוברית שור סרום (FBS)-תאים למ"ל 40,000 לאחר ספירת עם חדר הספירה.
    2. דגירה התאים על תנאי ב 37 ° C תחת סיבוב עדין באמצעות מסובב שפופרת של כעשרים דקות כדי לשמור אותם ההשעיה.
      הערה: שלב זה הוא קריטי כדי לאפשר הדיסוציאציה מלאה של מתחמי אדהזיה מוקד.
    3. צלחת 2 מ"ל של תאים MRC-5 על תנאי (40,000 תאים/mL) בשתי מנות 35 מ מ זכוכית-התחתון. המנה 35 מ מ זכוכית המדרגה הראשונה לשימוש וזמינותו puromycilation (ראה שלב 2.1.5) ולהשתמש השני כפקד שלילי (ראה שלב 2.1.6).
    4. לשמור את התאים ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2) במשך 55 דקות לאפשר אדהזיה סלולרית ויצירת SIC.
    5. Puromycin הוסף למדיום מנות 35 מ מ זכוכית-התחתון (assay) באמצעות ריכוז שהוגדרה קודם לכן בסעיף 1. כדי להתייחס MRC-5 תאים, השתמש puromycin µg/mL 10 עבור 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2).
    6. כפקד שלילי, להוסיף cycloheximide למנה 35 מ מ זכוכית המדרגה השניה 40 דקות לאחר זריעה התאים להתייחס אליהם מראש עם µg/mL 50 cycloheximide ( איור 2B). לאחר מכן, 15 דקות לאחר cycloheximide תוספת, להוסיף puromycin המדיום באמצעות ריכוז, דגירה זמנית כמו שלב 2.1.5 (למשל, שימוש 10 µg/mL של puromycin עבור 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (5% CO 2) MRC-5).
    7. לרחוץ כל צלחת פעמיים עם 2 מ של קרח 1 X PBS ולתקן את התאים עם 1 מ"ל של 4% פורמלדהיד (מדולל ב- 1 X PBS) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
      התראה: Paraformaldehyde יש להשתמש אך ורק ברדס כימי.
  2. Immunostaining.
    1. בעקבות קיבוע paraformaldehyde, לשטוף שלוש פעמים עם 2 מ ל 1 X PBS, תקופת דגירה של 500 µL של PBS-TritonX-100 (0.5%) של 20 דקות ב RT כדי permeabilize את התאים.
    2. כדי למנוע מחייב נוגדן ספציפי, לחסום את הדגימה עם 500 µL PBS – BSA (1%) במשך 20 דקות ב- RT.
    3. שלוש פעמים עם 2 מ של PBS-Tween20 (0.1%) וקונטה דגירה עם 300 µL של 1:12,500 אנטי-puromycin נוגדנים (12 יח 10) מדולל ב- PBS X 1 על 1 h RT.
    4. 3 פעמים עם 2 מ של PBS-Tween20 (0.1%) וקונטה דגירה עם 300 µL של העכבר אנטי איג מצומדת כדי fluorophore (כאן, 488 ננומטר) מדולל ב- PBS לדמיין puromycilated polypeptides ועם phalloidin מצומדת כדי fluorophore אחרת (כאן, 555 ננומטר) כדי להמחיש F-אקטין. תקופת דגירה של 1 h RT.
    5. ואז תקופת דגירה של 5 דקות ב RT ב- 300 µL של PBS-Tween20 (0.1%) בתוספת µg 1/4 מ"ל וקונטה שלוש פעמים עם 2 מ של PBS-Tween20 (0.1%) ', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי).
    6. לרחוץ שלוש פעמים עם 2 מ של PBS-Tween20 (0.1%), ולאחר מכן לשטוף עם 2 מ ל 1 X PBS. למנוע את התאים מתייבשים על ידי שמירה המדגם על 2 מ ל 1 X PBS במהלך ייבוא תמונות.

3. ייבוא תמונות immunofluorescent

הערה: המתודולוגיה הבאים ניתן להשתמש עם כל מערכת הדמיה זמינים מסחרית קונפוקלי.

  1. המתאים לקבוע הגדרות עבור כל fluorophore להגדיל את הטווח הדינמי על כימות.
    הערה: נציג כימות יכולה להיות מושגת רק אם רוויה פיקסל הוא נמנע הסף אות מכוונן כראוי. הגדרות אלה יכולות להיות על-ידי התאמת בקפידה את עוצמת הלייזר, מתח גבוה (HV), לקבל, היסט...
    1. התאם הזום גורם (5 X), מספר הפיקסלים (512 x 512) כדי למטב את גודל פיקסל.
      הערה: זה צריך להיות לפחות 2.3 - פעמים קטנים יותר לרזולוציה אופטית, על-פי משפט נייקוויסט.
    2. להקטין את מהירות סריקה (12.5-20 µs לפיקסל), להשתמש בממוצע (2 - 3 פעמים) כדי לשפר את יחס אות לרעש בהתאם להגדרות הנ ל.
  2. באופן ידני לקבוע העליון המתאים והתחתונים מטוסים מוקד לאורך ציר z עם גודל צעד אופטימלית (0.4 מיקרומטר פרוסה).
    הערה: המטוס גודל צעד נקבעת לפי הרזולוציה צירית מחולק 2.3, בהתאם משפט נייקויסט המוכלל. בדרך כלל, 20-25 שכבות נחוצים לכסות את כל התא עומק תאים חסיד.
  3. לרכוש תמונה קונאפוקלית של תא יחיד כולו עם 60 X לתכנן Apo שמן טבילה יעד (מפתח נומרי 1.42 ג ' יגה).

4. כימות תמונה immunofluorescent

  1. נחישות העשרה.
    1. לפתוח תמונה המתאימה בשכבת מטוס ה-z עניין מקובץ הנתונים רכשה תא באמצעות התוכנה ImageJ (freeware לרשותכם http://fiji.sc).
    2. לצייר קו באמצעות הכלי קו ציור (סרגל הכלים → ישר) דרך האזורים של התא שבו רצוי כמת. לשנות את רוחב הקו על-ידי לחיצה כפולה על " שכיבה על הגב " ערכי העוצמה ייכללו בממוצע דרך רוחב הקו (מוגדר ב-8 באיור 3).
      הערה: קו דק יותר הוא העדיף להימנע אות חפיפה של מבנים שונים.
    3. אחרי הקו מוגדר כראוי, פרופיל הצפיפות אות לאורך הציר נחוש (שורת התפריטים → ניתוח → פרופיל מגרש).
      הערה: חלון חדש יפתח המציגה פרופיל התואם עוצמת האות לכל פיקסל של הערוץ שנבחר (fluorophore ספציפי) לאורך הקו עבור המקטע שנבחר מטוס ה-z.
      1. חזור על התהליך לכל ערוץ התואם fluorophore בשימוש (קרי, כימות אחד עבור 488, אחד עבור 568 ואחד 405).
        הערה: הערך עוצמת האות תמיד תידרש בעקבות הכיוון של הקו מצוירות.
    4. כדי להשיג את הערכים מספריים בגווני אפור לכל פיקסל של הפרופיל התואם quantifications של השכבה שנבחרה מטוס ה-z, העתק את נתוני הפרופיל (שורת תפריטים בחלון התמונה → עותק) והדבקתו בתוכנה בכל גיליון אלקטרוני-
      5. 4.1.1-4.1.4
    5. חזור על שלבים עבור כל מקטע מטוס ה-z של התמונה קונאפוקלית רכשה ו כל ערוץ שבו רצוי כמת.
      הערה: יכול להיות איחדו כימות של שכבות שונות של מטוס ה-z כדי לקבל הערכה כללית של העשרת מיוחד של האות על-ידי חישוב הערך סכום של כל פיקסל לאורך הקו עבור כל שכבת מטוס ה-z. סוג זה של איגוד תושג רק קו שצויר הינו זהה עבור כל שכבת מטוס ה-z כללו את הערכים רשע.
    6. כאמצעי חלופי עבור כל תא כימות של ערוצים שונים עם מספר רב של שכבות, להשתמש במאקרו שנקרא StackprofileData (ראה קובץ משלים).
      הערה: פקודת מאקרו זו נגישה בחופשיות-https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt והוא יכול לשמש כדלקמן:
      1. להדביק את המאקרו לתוך קובץ טקסט ולשמור את זה
      2. לפתוח את קובץ התמונה הכוללת את כל השכבות קונאפוקלית של התא.
      3. לצייר קו, כמתואר בשלב 4.1.2, לפתוח חלון חדש לייבא את המאקרו (שורת התפריטים → תוספים → מאקרו → להפעיל), בחר את קובץ הטקסט שנשמר התואם המאקרו StackprofileData ולחץ " פתוח. "
        הערה: בעקבות מאקרו היבוא, חלון חדש בשם " תוצאות " יפתח, כל כימות לאורך הציר נחוש יפורטו עבור כל שכבת מטוס ה-z של ערוץ נוכח קובצי התמונה.
      4. להעתיק את הנתונים לכל ערוץ (שורת התפריטים → לערוך → Copy) כדי לקבל ייצוג גרפי הפרופיל התואם quantifications אות. להדביק אותם בכל תוכנת הגיליון האלקטרוני. לחשב את ערך סכום של כל ערוץ לכל פיקסל לאורך הקו עבור כל שכבת מטוס ה-z. השתמש בערכים אלה כדי ליצור ייצוג גרפי הדומה לזה המוצג באיור 3.
  2. כימות של האות באזור המיועד הסלולר או נפח.
    1. לפתוח את קובץ התמונה בתוכנה ImageJ.
    2. לצייר על שטח לציון אזור עניין באמצעות הפונקציה צורה גיאומטרית (סרגל הכלים → " מלבן, " " סגלגלות, " או " מצולע ").
      הערה: הערך כימות ייקבעו על האזור המתאים בטופס מצוירות.
    3. להתאים את רמת הסף כדי למנוע כל אות רקע (שורת התפריטים → להתאים את התמונה → סף); יופיע חלון חדש כדי לייצג את עוצמות פיקסל בטופס היסטוגרמה. לשנות את הערכים לכלול/לא לכלול פיקסלים כימות בעזרת המחוון ' '. בחר סף המונע אדום פיקסלים מחוץ לתא, כמו פיקסלים המסומנים באדום ייכלל כימות.
    4. להגדיר את הפרמטרים מדידה לכמת את האות פיקסל בתוך האזור הנבחר, ללא רקע אות (שורת התפריטים → ניתוח → להגדיר מידות), הקפד לבדוק " הגבלה על הסף " ו " צפיפות משולב " תיבות.
    5. למדוד כמותית הערכים עבור האזור שנבחר (שורת התפריטים → ניתוח → מדידה).
      הערה: כימות עוצמת האות יוצגו בחלון חדש תחת " IntDen " זיהוי, אשר מייצג את המוצר של ערכי אפור רשע לבין מספר הפיקסלים בתוך האזור הנבחר.
    6. לצייר אזור הכולל את התא כולו באמצעות צורה גיאומטרית (סרגל הכלים → " מלבן, " " סגלגלות, " או " מצולע ") ולהמשיך עם 4.2.3-4.2.5 צעדים כדי להשיג ערך התואם לאות הכולל. לחשב את היחס של האות בתוך האזור הנבחר מעל האות כל להשיג את האחוזים של האות בתוך אזור עניין.
    7. חוזר 4.2.2-4.2.6 צעדים כדי להשיג כימות של תא האחסון עבור כל מטוס ה-z. להתאים את הצורה הגיאומטרית כנדרש.
    8. העתק/הדבק הנתונים המתקבלים " תוצאות " של windows עבור כל שכבת מטוס ה-z לתוך גיליון אלקטרוני לקבלת תיאור גרפי וכדי למצוא ערך רשע.

תוצאות

להבחין במדויק באירועים תרגום באמצעות התאגדות puromycin, זה קריטי כדי לקבוע את התנאים אופטימליים עבור כל קו תא כי כל מראה שונה puromycin התאגדות קינטיקה (איור 1)9,11 12, ,18. מכאן, כדי לאמת puromycin התאגדו...

Discussion

ההתקדמות הטכנולוגית האחרונות איפשרו הבנה טובה יותר של המנגנונים המעורבים translational קולטנים upregulation או הדיכוי של mRNAs ספציפיים של תהליכים ביולוגיים, כגון פיתוח עצביים, סמים התגובה גרורות. המתודולוגיה חסכונית המתוארים כאן מאפשר תרגום אירועים, ניתן לאבחן בתאים כדי ללמוד כיצד RNA מחייב חלבונים לה...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים ד ר ראשיד Mazroui (אוניברסיטת לאוול, קוויבק, קנדה) על קריאה ביקורתית של כתב היד. אנו מודים יחידת דימות תא של המרכז לחקר לסיוע טכני שלהם. Huot מé. הוא חוקר המחקר ג'וניור 1 דה Fonds du רשרש קוויבק-Santé (FRQ-S). עבודה זו נתמכה על ידי קנדי מוסדות של בריאות המחקר (להעניק מספר CIHR, מגב-286437 למ-É. Huot).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMwisent319-005-CL
Trypsinewisent325-043 EL
FBSThermo Fisher Scientific12483020
Puroycin antibody 12D10EMD milliporeMABE343western blot dilution 1:25,000
Immunofluoresence dilution 1:10,000
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibodycell signaling technology7076western blot dilution 1:8,000
Western Lightning Plus-ECLPerkin ElmerNEL104001EA
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate)cell signaling technology4408immunofluoresecence dilution 1:400
CF568 Phalloidinbiotium00044immunofluoresecence dilution 1:400
CyclohexmideSigmaC1988-1G50µg/ml final concentration
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)InvitrogenD1306final concentration 1µg/ml
Puromycinbio-BasicPJ5932.5µg/ml to 10µg/ml
Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreatIbidi81156
MRC-5 cellsATCCCCL-171
HeLa cellsATCCCCL-2
Huh-7 cellsfrom Dr. Mazroui (Université Laval)
Fv1000olympusconfocal imaging system
Fiji softwarehttp://fiji.sc
PBS (Phosphate BuffeRed Saline)bio-BasicPD8117
Formaldehyde 37% Solutionbio-BasicC5300-1
Triton X-100bio-BasicTB0198
BSAFisher BioreagentsBP9702-100
Tween20Fisher BioreagentsBP337-500

References

  1. Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
  2. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
  3. Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
  4. Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
  5. Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
  6. El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
  7. Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
  8. Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
  9. Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. n. S. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
  10. Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
  11. Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
  12. David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
  13. Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
  14. Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
  15. Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
  16. Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
  17. Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
  18. Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
  19. Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
  20. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
  21. Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
  22. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

126Puromycilation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved