Imunofluorescência quantitativa a medida Global localizadas Tradução

Resumo

Este manuscrito descreve um método para visualizar e quantificar eventos tradução localizada em compartimentos subcellular. A abordagem proposta neste manuscrito requer um sistema básico de imagens confocal e reagentes e é rápido e econômico.

Resumo

Os mecanismos de regulação tradução do mRNA estão envolvidos em diversos processos biológicos, tais como o desenvolvimento de linha germinal, diferenciação celular e organogênese, bem como em várias doenças. Inúmeras publicações têm demonstrado convincentemente que mecanismos específicos firmemente regulam tradução do mRNA. Aumento do interesse na regulação da expressão da proteína induzida em tradução tem levado ao desenvolvimento de novos métodos de estudar e seguir de novo proteína síntese em cellulo. No entanto, a maioria desses métodos é complexa, tornando-os dispendiosos e muitas vezes limitar o número de destinos de mRNA que podem ser estudados. Este manuscrito propõe um método que requer somente reagentes básicos e um sistema de imagens de fluorescência confocal para medir e visualizar as alterações na tradução de mRNA que ocorrem em qualquer linha de celular em diversas condições. Este método foi usado recentemente mostrar tradução localizada nas estruturas subcelulares de células aderentes durante um curto período de tempo, oferecendo assim a possibilidade de visualizar a tradução de novo por um curto período durante uma variedade de biológicas processos ou de Validando alterações na atividade translacional em resposta a estímulos específicos.

Introdução

O Regulamento de tradução por diferentes funções celulares levou muitas equipes de investigação para desenvolver novas ferramentas e métodos para determinar a Localização subcellular da tradução do mRNA e proteína regulamentado síntese^{1,2 ,3,4}. Estes recentes avanços tecnológicos permitem uma melhor compreensão dos mecanismos que envolvem a tradução upregulation ou a repressão de mRNAs específicos durante processos biológicos, tais como o desenvolvimento neuronal, a resposta de drogas e metástase^{5 ,6,7,8}. No entanto, a maioria desses métodos requerem equipamentos específicos que podem não estar disponíveis para a maioria dos laboratórios e reagentes caros ou perigosos. Como tal, um método de baixo custo para permitir a rápida avaliação de eventos de tradução foi desenvolvido para especificamente contornar esses problemas potenciais. Este método detecta modulações translacionais agudas que ocorrem durante os processos celulares específicos e também permite a localização de tradução usando microscopia confocal.

Os métodos descritos aqui foram usados para monitorar uma tradução localizada dentro de compartimentos subcellular chamado espalhamento iniciação centros (SIC)⁵. SICs são transitórias estruturas encontradas nas células semeadas que são localizadas no topo de complexos de adesão nascente. Embora SICs e complexos de adesão são distintos, seus destinos estão intimamente ligados. Com efeito, SICs são conhecidos por desaparecer gradualmente após maturação complexo de adesão focal em um site de adesão durante a fase inicial de adesão. Descobrimos que RNA-proteínas conhecidas para controlar especificamente tradução mRNA (por exemplo, Sam68, FMRP e G3BP1) e polyadenylated RNAs foram enriquecidos dentro estas estruturas⁵. Usando os métodos descritos aqui, nós mostramos que o Regulamento de SIC-associada mRNA tradução age como uma barreira, permitindo semeado células para consolidar a adesão celular. Este método, baseado na incorporação de puromicina, poderia ser considerado uma versão adaptada da superfície de sensoriamento de tradução do ensaio (pôr do sol). Originalmente desenvolvido para medir as taxas de síntese de proteína global usando um aminoácido não-radioativa etiquetado, proteína puromycilation oferece uma maneira eficiente de Visualizar de síntese de proteínas de novo ⁹. Esse método depende o comportamento intrínseco de puromicina, um antibiótico que bloqueia a tradução por meio de encerramento prematuro da cadeia no Ribossoma¹⁰. Com efeito, a puromicina é estruturalmente análoga ao tRNA-correntes, que permite a incorporação alongando cadeias peptídicas através da formação de uma ligação peptídica. No entanto, vinculação de puromicina para uma crescente cadeia peptídica impede que uma nova ligação peptídica sendo formado com o próximo aminoacil-tRNA, desde puromicina tem uma ligação Amida não hidrolisável em vez da ligação éster hidrolisável encontrada em tRNAs. Assim, a incorporação de puromicina alongando polipeptídeos resulta na liberação prematura de numerosos polipeptídeos de puromycilated truncado correspondente ativamente traduzido do mRNA^9,11,12 .

Usando este método, foi possível avaliar tradução ativa dentro de uma viúva de curto período de tempo (por exemplo, 5 min) durante a adesão celular usando um anticorpo específico dirigido contra puromicina em células que foram suplementados com o antibiótico para períodos de 5-min em pontos de tempo diferentes durante a adesão célula processo⁵. A precisão deste teste depende altamente específicos anticorpos dirigidos contra a fracção puromycilated. Detecção de imunofluorescência do polypeptide puromycilated fornece uma repartição geral subcellular do mRNA recentemente traduzidas, que também pode ser quantificada com grande precisão usando sistemas de imagiologia confocal.

Portanto, esse método oferece uma opção relevante para um grande número de laboratórios estudando mecanismos de regulação traducional envolvidos em processos como granulação neuronal^{6,13,14, 15}, morphogen mRNA de localização e tradução durante desenvolvimento^16,17. Também é adequado para estudar tradução localizada ou compartimentada durante rápidas eventos biológicos, tais como a migração celular, adesão ou invasão, ou simplesmente avaliar tratamentos com drogas que podem induzir alterações translacional^{5, 7 , 18}. em geral, esse método permite que para a visualização de eventos tradução localizadas ou controlada de uma forma rápida, precisa e econômica.

Protocolo

1. determinação das condições de Puromycilation

Nota: esta técnica descreve o método usado para avaliar a tradução localizada durante o MRC-5 célula adesão processo ⁵. Como puromycilation pode ser feito em qualquer célula, é importante otimizar as condições de puromycilation para as linhas de célula específica a ser usado, porque as condições de tratamento não são idênticas para cada linha de celular em termos de concentração de puromicina e o desejado tempo de incubação. Para mostrar como essas condições são definidas, três linhas de célula exemplo (ou seja, HeLa, MRC-5 e 7-Huh) foram tratadas com concentrações crescentes de puromicina para tempos de incubação diferentes ( Figura 1).

1. Crescer números idênticos de células em uma placa de 24 em 0,5 mL do adequado completam 16 h antes do teste de meio de cultura. MRC-5 células de semente 30.000, 50.000 células HeLa ou 50.000 HuH-7 células por poço. Certifique-se de evitar exceder a confluência de 60-70% (figura 1A).
2. Preparar 6 tubos com 1,5 mL de meio de cultura celular completa com concentrações crescentes de puromicina (0, 5, 10, 15, 20 e 30 µ g/mL). Pré-aquecido a 37 ° C.
3. Para cada concentração do meio de puromicina (preparado no passo 1.2), de transferir 0,5 mL de cada tubo para 6 tubos de novos e adicionar cicloheximida em uma concentração final de 50 µ g/mL para todos os 6 tubos de novos. Pré-aquecido a 37 ° C.
4. Mudar o meio com 0,5 mL de meio de cultura completo (linha 1 e 2). Para a terceira linha, adicionar 0,5 mL de meio de cultura completo suplementado com 50 µ g/mL de cicloheximida ( figura 1B).
   Nota: Tratamento de cicloheximida foi estabelecido como o melhor controle negativo para puromycilation de proteína devido à sua capacidade de bloquear do alongamento. Porque a incorporação de puromicina requer do alongamento, cicloheximida tratamento leva a uma perda de puromycilated proteína sinais ^{5 , 18}.
5. Incube por 15 min a 37 ° C (5% CO ₂).
6. Adicionar 0,5 mL do meio de puromicina preparado na etapa 1.2 para a segunda linha para obter concentrações finais de 0, 2,5, 5, 7,5, 10 e 15 µ g/mL, respectivamente, nas colunas A, B, C, D, E e F. Ao mesmo tempo, adicionar 0,5 mL de puromicina no meio de cicloheximida-completada (etapa 1.3) na terceira linha ( Figura 1).
7. Incubar durante 5 min a 37 ° C (5% CO ₂).
8. Adicionar 0,5 mL do meio de puromicina preparado na etapa 1.2 para a primeira linha para obter concentrações finais de 0.0, 2.5, 5, 7,5, 10 e 15 µ g/mL ( Figura 1).
9. Incubar durante 5 min a 37 ° C (5% CO ₂).
10. Cada um lavar bem a partir de soro de linhas 1 a 3 com 1 mL de gelado 1 X tamponada fosfato (PBS) 5 min após a adição de puromicina poços de primeira linha (lavar duas vezes). Adicionar 75 µ l de tampão de X Laemmli 1 (4% sulfato dodecyl de sódio (SDS), 4% de 2-Mercaptoetanol, 0.120 M Tris HCl pH 6,8, 0,004% azul de bromofenol e 10% de glicerol) para obter células inteiras lysates para cada condição.
11. Run 10% eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) usando 1/3 das amostras preparadas para avaliar a incorporação de puromicina.
    1. Determinar o nível de incorporação de puromicina por análise ocidental do borrão, usando um anticorpo antipuromicina (12 D 10) diluído na proporção de 1: 25.000 em tampão de incubação do anticorpo primário (2% soro de Albumina bovina (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4 e 0,01% azida de sódio).
       Nota: Imagens representativas correspondente à célula diferentes extratos de linha feitos conforme descrito na etapa 1 são mostradas como exemplos na Figura 2.

2. Em Cellulo Localizada a visualização de tradução

Nota: A técnica descrita aqui foi usada para avaliar a tradução localizada dentro SICs em MRC-5 células durante o processo de adesão ⁵. Embora MRC-5 células são usadas aqui, outras linhas de células podem ser usadas com a mesma metodologia descrita no passo 2.1.

1. Celular preparação.
   1. Desanexar MRC-5 células usando 0,25% tripsina/2,21 ácido etilenodiaminotetracético de mM (EDTA) em Hank ' s solução sal equilibrado (HBSS). As células de pelotas por centrifugação (5 min x 200g) em um tubo de centrifuga conico de 15 mL e suspendê-las em Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% soro bovino fetal (FBS) 40.000 células/ml, depois de contar com uma câmara de contagem.
   2. Incube as celulas suspensas a 37 ° C sob rotação suave usando um rotador tubo por 20 min para mantê-las em suspensão.
      Nota: Este passo é fundamental para permitir a completa dissociação dos complexos adesão focal.
   3. Placa 2 mL de suspensão MRC-5 células (40.000 células/mL) em dois pratos de 35mm vidro-fundo. Use o primeiro prato que 35mm vidro-fundo para o ensaio de puromycilation (consulte a etapa 2.1.5) e usar o segundo como um controle negativo (consulte a etapa 2.1.6).
   4. Manter as células a 37 ° C (5% CO ₂) por 55 min permitir a adesão celular e formação de SIC.
   5. Add puromicina ao meio nos pratos 35mm vidro-fundo (ensaio) usando a concentração previamente definida na secção 1. Para tratar o MRC-5 células, usar 10 puromicina µ g/mL por 5 min a 37 ° C (5% CO ₂).
   6. Como um controle negativo, adicionar cicloheximida para o segundo prato de 35mm vidro-fundo 40 min após a propagação das células pre-tratá-los com 50 cicloheximida µ g/mL ( Figura 2B). Em seguida, 15 min após a adição de cicloheximida, adicione puromicina ao meio usando o mesmo tempo de concentração e incubação como na etapa 2.1.5 (por exemplo, uso 10 µ g/mL de puromicina por 5 min a 37 ° C (5% CO ₂) para MRC-5).
   7. Lavar cada placa duas vezes com 2 mL de gelado 1 X PBS e consertar as células com 1 mL de formol 4% (diluído em 1X PBS) durante 15 minutos à temperatura ambiente (RT).
      Cuidado: Paraformaldehyde deve ser usado estritamente em uma capa química.
2. Immunostaining.
   1. Após a fixação do paraformaldehyde, lavar três vezes com 2 mL de 1X PBS e incubar em 500 µ l de PBS-TritonX-100 (0,5%) por 20 min no RT para permeabilize as células.
   2. Para impedir a ligação de anticorpos inespecíficos, bloquear a amostra com 500 µ l de PBS – BSA (1%) por 20 min no RT.
   3. Lavar três vezes com 2 mL de PBS-Tween20 (0,1%) e incube com 300 µ l de 1:12,500 anticorpo antipuromicina (12 D 10) diluído em 1X PBS por 1h no RT.
   4. Lavar 3 vezes com 2 mL de PBS-Tween20 (0,1%) e incube com 300 µ l de anti-mouse IgG conjugada com um fluoróforo (aqui, 488 nm) diluído em PBS para visualizar puromycilated polipeptídeos e com conjugados a faloidina para outro fluoróforo (aqui, 555 nm) Visualizar F-Actina. Incubar durante 1 h em RT.
   5. Lavar três vezes com 2 mL de PBS-Tween20 (0,1%) e então incubar durante 5 min à RT em 300 µ l de PBS-Tween20 (0,1%) suplementado com 1 µ g/mL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
   6. Lavar três vezes com 2 mL de PBS-Tween20 (0,1%) e em seguida lavar com 2 mL de 1X PBS. Impedir as células de secagem, mantendo a amostra em 2 mL de 1X PBS durante a aquisição de imagens.

3. Aquisição de imagens de imunofluorescência

Nota: A metodologia a seguir pode ser usada com qualquer sistema da imagem latente confocal comercialmente disponível.

Configurações de

1. determinar o apropriado para cada fluoróforo para maximizar a gama dinâmica para quantificação.
   Nota: Quantificação representante só pode ser obtida se a saturação de pixel é evitada e o limiar de sinal está ajustado corretamente. Essas configurações podem ser alcançado ajustando cuidadosamente a potência do laser, de alta tensão (HV), ganhar, e o deslocamento. Fator
   1. ajustar o zoom (5x) e o número de pixels (512 x 512) para otimizar o tamanho de pixel.
      Nota: Isto deve ser pelo menos 2.3 - vezes menor do que a resolução óptica, de acordo com o teorema de Nyquist.
   2. Diminuir a velocidade de varredura (12,5-20 µs/pixel) e usar uma média (2 - 3 vezes) para melhorar a relação sinal-ruído de acordo com as configurações mencionadas acima.
2. Manualmente determinar o top apropriado e planos focais ao longo do eixo z com o tamanho de passo ótimo (0,4 µm/fatia) de fundo.
   Nota: O avião do tamanho de etapa é determinado pela resolução axial dividida por 2.3, de acordo com o teorema de Nyquist. Normalmente, 20-25 camadas são necessárias para cobrir a profundidade de toda a célula de células aderentes.
3. Adquirir uma imagem confocal de uma única célula inteira com um 60 objetivo de imersão de óleo X plano Apo (1,42 abertura numérica).

4. Quantificação de imagem imunofluorescência

1. determinação de enriquecimento.
   1. Abrir uma imagem correspondente à camada de z-plano de interesse do arquivo de dados adquiridos de célula usando o software ImageJ (freeware disponível em http://fiji.sc).
   2. Desenhar uma linha usando a ferramenta de linha de desenho (barra de ferramentas → em linha reta) através das regiões da célula onde a quantificação é desejada. Modificar a largura da linha clicando duas vezes em " em linha reta; " vão ser média dos valores de intensidade através da largura da linha (fixado em 8 na Figura 3).
      Nota: Uma linha mais fina é a preferida para evitar a sobreposição de sinal de diferentes estruturas.
   Perfil de
   3. depois que a linha está definida corretamente, a densidade de sinal ao longo do eixo determinado (barra de menu → Analyze → traçar perfil).
      Nota: Uma nova janela abrirá que mostra um perfil correspondente à intensidade de sinal para cada pixel do canal selecionado (específico fluoróforo) ao longo da linha para a seção selecionada do plano z.
      1. Repita o processo para cada canal correspondente para o fluoróforo usado (isto é, uma quantificação para 488, um para 568 e outra para o 405).
         Nota: O valor de intensidade de sinal serão sempre ordenado seguindo a orientação da linha desenhada.
   4. Para obter os valores de cinza escala numéricos para cada pixel do perfil correspondente as quantificações da camada selecionada plano z, copiar os dados de perfil (barra de menu na janela de imagem → copiar) e cole-o em qualquer software de planilha eletrônica.
   4.1.1-4.1.4
   5. repita os passos para cada seção do plano z da imagem confocal adquirida e cada canal onde a quantificação é desejada.
      Nota: A quantificação das diferentes camadas de z-plano pode ser agrupada para obter uma avaliação geral do enriquecimento especial do sinal calculando o valor da soma de cada pixel, ao longo da linha para cada camada plano z. Este tipo de pool só será possível se a linha desenhada é idêntica para cada camada de z-plano constam os valores médios de.
   6. Como um método alternativo para a quantificação de células inteiras de canais diferentes, com um grande número de camadas, use a macro chamada StackprofileData (consulte o Arquivo suplementar).
      Nota: Esta macro pode ser acessada livremente em https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt e pode ser usada da seguinte maneira:
      1. Cole a macro em um arquivo de texto e salvá-lo
      2. Abrir o arquivo de imagem que inclua todas as camadas confocal da célula.
      3. Desenhar uma linha, conforme descrito na etapa 4.1.2, abrir uma nova janela para importar a macro (barra de menu → Plugins → Macros → executar), escolher o arquivo de texto salvo anteriormente correspondente a macro StackprofileData e clique " abrir... "
         Nota: Sequência da importação de macro, uma nova janela chamada " resultados " será aberto e todos da quantificação ao longo do eixo determinado serão listados para cada camada de z-plano e canal presentes nos arquivos de imagem.
      4. Copiar os dados para cada canal (barra de menu → editar → cópia) para obter a representação gráfica do perfil correspondente as quantificações de sinal. Colá-lo em qualquer software de planilha eletrônica. Calcule o valor da soma de cada canal para cada pixel, ao longo da linha para cada camada plano z. Usar esses valores para criar uma representação gráfica semelhante ao apresentado na Figura 3.
2. Quantificação do sinal em um volume ou área designada celular.
   1. Abrir o arquivo de imagem com software ImageJ.
   2. Desenhar uma área para denotar a área de interesse, usando a função de forma geométrica (barra de ferramentas → " retângulo, " " oval, " ou " polígono ").
      Nota: O valor de quantificação será determinado pela área correspondente ao formulário desenhado.
   3. Ajustar o nível de limiar para evitar qualquer sinal de fundo (barra de menu → ajustar a imagem → limiar); uma nova janela aparecerá para representar as intensidades pixel em forma de histograma. Altere os valores para incluir/excluir pixels na quantificação usando o controle deslizante. Selecione um limiar que elimina pixels vermelhos fora da célula, como pixels destacadas em vermelho serão incluídas na quantificação.
   4. Definir os parâmetros de medida para quantificar o sinal de pixel dentro da área selecionada, sem sinal de fundo (barra de menu → Analyze → conjunto de medições) e certifique-se de verificar o " limite de limiar " e o " densidade integrada " caixas.
   5. Medir os valores quantitativos para a área selecionada (barra de menu → Analyze → medida).
      Nota: Quantificação de intensidade do sinal será apresentada em uma nova janela sob o " IntDen " identificação, que representa o produto dos valores médios de cinza e o número de pixels dentro da área selecionada.
   6. Desenhar uma área que inclui toda a célula usando uma forma geométrica (barra de ferramentas → " retângulo, " " oval, " ou " polígono ") e prosseguir com passos 4.2.3-4.2.5 para obter um valor correspondente para o total de sinal. Calcular a relação do sinal dentro da área selecionada sobre o sinal inteiro para obter a porcentagem do sinal dentro da área de interesse.
   7. 4.2.2-4.2.6 passos de repetição para obter a quantificação do volume de célula para cada plano z. Adaptar a forma geométrica, conforme necessário.
   8. Copiar/colar os dados obtidos a partir da " os resultados " windows para cada camada de z-plano em uma planilha para representação gráfica e para encontrar um valor médio.

Resultados

Para observar com precisão eventos de tradução usando a incorporação de puromicina, é fundamental para determinar as condições ideais para cada linha de celular porque cada mostra diferentes puromicina incorporação cinética (Figura 1)^{9,11 ,12,18}. Portanto, para validar a incorporação de puromicina, é necessário trata...

Discussão

Avanços tecnológicos recentes permitiram uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na regulação alta translacional ou a repressão de mRNAs específicos em processos biológicos, tais como o desenvolvimento neuronal, a resposta de drogas e metástase. A metodologia econômica descrita aqui permite que eventos de tradução ser visualizado em células para estudar como RNA-proteínas regulam processos metastáticos, como adesão celular, migração e invasão.

Apesar de inúmeros m?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	wisent	319-005-CL
Trypsine	wisent	325-043 EL
FBS	Thermo Fisher Scientific	12483020
Puroycin antibody 12D10	EMD millipore	MABE343	western blot dilution 1:25,000 Immunofluoresence dilution 1:10,000
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	cell signaling technology	7076	western blot dilution 1:8,000
Western Lightning Plus-ECL	Perkin Elmer	NEL104001EA
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate)	cell signaling technology	4408	immunofluoresecence dilution 1:400
CF568 Phalloidin	biotium	00044	immunofluoresecence dilution 1:400
Cyclohexmide	Sigma	C1988-1G	50µg/ml final concentration
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	final concentration 1µg/ml
Puromycin	bio-Basic	PJ593	2.5µg/ml to 10µg/ml
Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat	Ibidi	81156
MRC-5 cells	ATCC	CCL-171
HeLa cells	ATCC	CCL-2
Huh-7 cells	from Dr. Mazroui (Université Laval)
Fv1000	olympus		confocal imaging system
Fiji software			http://fiji.sc
PBS (Phosphate BuffeRed Saline)	bio-Basic	PD8117
Formaldehyde 37% Solution	bio-Basic	C5300-1
Triton X-100	bio-Basic	TB0198
BSA	Fisher Bioreagents	BP9702-100
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500