정량적 면역 형광 측정 글로벌 현지화 번역

요약

이 원고 시각화 및 subcellular 구획에서 지역화 된 번역 이벤트를 계량 하는 방법을 설명 합니다. 이 원고에 제안 접근 기본 confocal 이미징 시스템 및 시 약을 필요로 하 고 신속 하 고 비용 효율적인.

초록

MRNA 번역 조절 메커니즘 여러 질병에서 뿐만 아니라 세균 선 개발, 세포 분화, organogenesis, 등 다양 한 생물학 과정에서 포함 된다. 다 수의 출판물에서는 특정 메커니즘 단단히 mRNA 번역 규제 설득 나타났습니다. 단백질 식의 번역 유도 규칙에 대 한 관심 증가 연구 하 고 de novo 단백질 합성에서 cellulo에따라 새로운 방법의 개발을 주도하 고 있다. 그러나, 이러한 방법의 대부분은 복잡 한, 그들이 비용이 많이 드는 고 공부 될 수 있다 mRNA 대상의 수를 제한 하는 자주. 이 원고만 기본적인 시 약 및 측정 하 고 다양 한 조건에서 어떤 셀 라인에서 발생 하는 mRNA 번역에 변화를 시각화 confocal 형광 이미징 시스템을 필요로 하는 방법을 제안 합니다. 이 메서드는 최근 시간, 따라서 생물 다양 한 동안 짧은 기간에 대 한 드 노 보 번역 시각화의 가능성을 제공 하는 짧은 기간 동안 부착 셀의 subcellular 구조에서 지역화 된 번역을 표시 하는 데 사용 됩니다. 프로세스 또는 특정 자극에 응답에서 변환 활동에 변화를 확인.

서문

다른 세포질 기능에 의해 번역의 규칙 새로운 도구와 mRNA 번역 및 규제 단백질 합성^{1,2 의 subcellular 지 방화를 결정 하는 방법을 개발 하기 위해 많은 연구 팀을 묻는 메시지가 있다 ,34}. 이러한 최근의 기술 진보에 대 한 번역 upregulation 또는 신경 개발, 약물 반응 및 전이^{5 같은 생물 학적 과정 동안 특정 mRNAs의 억압 메커니즘의 향상 된 이해 허용 ,6,,78}. 그러나, 이러한 방법의 대부분 비싼 또는 유해 시 약 및 특정 장비를 대부분 실험실을 사용할 수 없는 필요 합니다. 따라서, 번역 이벤트의 급속 한 평가 대 한 허용 하는 비용 효율적인 방법은 구체적으로 이러한 잠재적인 문제를 회피 하 개발 되었다. 이 방법은 특정 세포 프로세스 동안 발생 하는 급성 변환 변조 감지 및 또한 번역 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 지역화에 대 한.

여기에 설명 된 방법은 확산 개시 센터 (SIC)⁵라는 subcellular 구획 내에서 지역화 된 번역을 모니터링 하는 데 사용 되었다. SICs 과도 구조 초기 접착 단지 위에 지역화 된 시드 셀에 있습니다. SICs 및 접착 단지 가지는, 비록 그들의 운명은 밀접 하 게 연결 됩니다. 실제로, SICs 접착의 초기 단계 동안 접착 사이트에 초점 접착 복잡 한 성숙에 점차적으로 사라질 알려져 있습니다. 우리는 발견 특히 mRNA 번역 (예를 들어, Sam68, FMRP, 및 G3BP1)을 제어 하려면 알려진 RNA 의무적인 단백질 및 RNAs 이러한 내에서 농축 된 polyadenylated 구조⁵. 여기 설명 된 방법을 사용 하 여, 우리는 SIC 관련 mRNA 번역 검사점 수 역할의 규칙 세포 세포 접착을 통합 시드 보였다. Puromycin 설립에 따라이 메서드는 적응된 버전의 번역 분석 결과 (일몰) 표면 감지의 간주 될 수 있습니다. 원래는 비 방사성 레이블이 아미노산을 사용 하 여 글로벌 단백질 합성 속도 측정을 개발, 단백질 puromycilation de novo 단백질 합성⁹를 시각화 하는 효율적인 방법을 제공 합니다. 이 방법은 puromycin, 번역 리보솜¹⁰조 체인 종료를 차단 하는 항생제의 고유 동작에 의존 합니다. 실제로, puromycin tyrosyl-tRNA, 펩 티 드 사슬 펩 티 드 결합의 형성을 통해 elongating으로 수 있는 구조적으로 유사한 이다. 그러나, 성장 펩 티 드 사슬에 puromycin 바인딩 puromycin tRNAs에서 발견 hydrolysable 에스테 르 결합 대신 비 hydrolysable 아 미드 유대를가지고 있기 때문에 다음 aminoacyl-tRNA와 함께 형성 되 고에서 새로운 펩 티 드 결합을 방지 합니다. 따라서, polypeptides를 elongating에 puromycin의 설립 적극적으로 번역 mRNA^{9,11,12에 해당 하는 수많은 잘린된 puromycilated polypeptides의 조기 출시에 결과} .

짧은 시간과 부 내에서 활성 번역 평가 가능 했다이 메서드를 사용 하 여 (예를 들어, 5 분) 동안 puromycin 항생제 5 분 동안 보충 된 셀에 대 한 지시는 특정 항 체를 사용 하 여 세포 접착 세포 접착 하는 동안 다른 시간 지점에서⁵를 처리 합니다. 이 분석 결과의 정밀도 높은 특정 항 체에 대하여 puromycilated moiety 지시에 의존 합니다. Puromycilated polypeptide의 immunofluorescent 감지 또한 confocal 이미징 시스템을 사용 하 여 좋은 정확성과 계량 수 새로 번역 된 mRNA의 일반적인 subcellular 재분할을 제공 합니다.

이 방법은 신경 알갱이 만듦^6,,1314, 등의 프로세스에 관련 된 변환 규제 메커니즘을 공부 하는 실험실의 많은 수에 대 한 관련 옵션을 제공 하는 ¹⁵, morphogen mRNA 지역화, 그리고 개발^16,17동안 번역. 그것은 또한 급속 한 생물 학적 이벤트, 셀 이동, 접착, 또는 침략, 또는 단순히 변환 변경^5, 를 일으킬 수 있는 약물 치료를 평가 하기 위해 동안 지역화 된 또는 compartmentalized 번역을 공부 하는 데 적합 ^{7 , 18}. 전반적으로,이 메서드를 사용 하면 지역화 된 또는 제어 번역 이벤트의 시각화를 위한, 정확, 신속 하 고 비용 효율적인 방식으로.

프로토콜

1. 결정의 Puromycilation 조건

참고:이 기술은 MRC 5 세포 접착 과정 ⁵ 동안 지역화 된 번역을 평가 하는 데 사용 하는 방법에 설명 합니다. Puromycilation 셀에 행 해질 수 있다, 그것은 치료 조건 puromycin 농도 및 원하는 각 셀 라인에 대 한 동일 하지 않기 때문에 사용 될 특정 셀 라인에 대 한 puromycilation 조건을 최적화 하는 것이 중요 보육 시간입니다. 이러한 조건이 정의 되는 방법 표시, 3 예제 셀 라인 (즉, 헬러, MRC-5, 그리고 허-7) 다른 보육 시간 puromycin의 농도 증가 함께 취급 했다 ( 그림 1).

1. 성장 동일한 숫자의 적절 한 0.5 mL에 24-잘 접시의 세포의 배양 시험 전에 16 h 완료합니다. 시드 30000 MRC-5 셀, 50000 HeLa 세포, 또는 잘 당 50000 허 7 셀. 60-70% 합류 (그림 1A)를 초과 하지 않도록 하는 것을 확인 하십시오.
2. 준비 6 튜브 1.5 mL puromycin (0, 5, 10, 15, 20, 및 30 µ g/mL)의 농도 증가 함께 완전 한 세포 배양 매체의와 함께 합니다. 37 ° c.에 미리 따뜻한
3. 는 Puromycin 매체 (1.2에서 준비 단계)의 각 농도에서 0.5 mL 전송 각각 6 새로운 튜브로 튜브 및 모든 6 새로운 튜브를 50 µ g/mL의 최종 농도에 cycloheximide를 추가. 37 ° c.에 미리 따뜻한
4. 완전 한 문화 매체 (행 1 및 2)의 0.5 mL와 매체를 변경합니다. 세 번째 행에 대 한 추가 cycloheximide ( 그림 1B)의 50 µ g/mL로 보완 하는 완전 한 문화 매체의 0.5 mL.
   참고: Cycloheximide 치료 단백질 puromycilation 번역 신장 차단 하는 기능 때문에 대 한 가장 부정적인 제어로 설립 되었습니다. Cycloheximide 치료 puromycilated 단백질 신호 ^{5 , 18}의 손실에 이르게 puromycin 설립 필요 번역 신장, 때문에.
5. 37 ° C (5% CO ₂)에서 15 분 동안 품 어.
6. 추가 단계 1.2 두 번째 행에서에서 열 A, B, C, D, E 및 f.에에서 각각 0, 2.5, 5, 7.5, 10, 및 15 µ g/mL의 최종 농도 얻기 위해 준비 puromycin 매체의 0.5 mL 동시에 세 번째 행 ( 그림 1C) cycloheximide-보충 매체 (1.3 단계)에 puromycin의 0.5 mL을 추가.
7. 37 ° C (5% CO ₂)에서 5 분 동안 품 어.
8. 0.0, 2.5, 5, 7.5, 10, 15 µ g/mL ( 그림 1C)의 최종 농도를 단계 1.2 첫 번째 행에서에서 준비 puromycin 매체의 0.5 mL을 추가.
9. 37 ° C (5% CO ₂)에서 5 분 동안 품 어.
10. 씻어 각 행 1 ~ 3 1 mL와 함께 차가운 1 X의 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 5 분 추가 후의 첫 번째 행 (워시에 두 번)의 우물에 puromycin에서 잘. 1 X Laemmli 버퍼의 75 µ L를 추가 (4% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 4 %2-mercaptoethanol 0.120 M Tris HCl pH 6.8, 0.004 %bromophenol 블루, 그리고 10% 글리세롤)를 각 상태에 대 한 전체-세포 lysates.
11. 실행 10% SDS polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE) puromycin 법인을 평가 하기 위해 준비 된 샘플의 1/3을 사용 하 여.
    1. Puromycin 설립 방지 puromycin 항 체 (12 D 10) 1:25,000 1 차적인 항 체 외피 버퍼 (2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.4, 및 0.01%의 비율로 희석을 사용 하 여 서쪽 오 점 분석의 수준 결정 나트륨 아 지 드).
       참고: 단계 1에서에서 설명한 대로 만든 다른 셀 선 추출 물에 해당 하는 대표적인 이미지는 그림 2에서 예제로 표시 됩니다.

2. Cellulo에서 지역화 된 번역 시각화

참고: 여기에 설명 된 기술은 접착 과정 ⁵ 동안 SICs MRC-5 셀에서 내에서 지역화 된 번역을 평가 하기 위해 사용 되었다. MRC 5 셀 여기에서 사용 된다, 비록 다른 셀 라인 단계 2.1에에서 설명 된 동일한 방법론으로 사용할 수 있습니다.

1. 준비 셀. 행 크에 0.25 %trypsin / 2.21 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)를 사용 하 여
   1. 분리 MRC-5 셀 ' s 균형 소금 솔루션 (HBSS). 원심 분리 (200g x 5 분) 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 의해 셀 펠 렛 및 Dulbecco에서 그들을 중단 ' s 수정이 글 매체 (DMEM) 세 챔버와 계산 후 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 40, 000 셀/mL에서 보충.
   2. 품 어에 그들을 유지 하기 위해 20 분에 대 한 튜브 회전자를 사용 하 여 부드러운 회전에서 37 ° C에서 일시 중단 된 셀.
      참고:이 단계는 초점 접착 단지의 완전 한 분리에 대 한 있도록 중요.
   3. 정지 MRC-5 셀 (40, 000 셀/mL) 두 35 m m 유리 하단 요리 접시 2 mL. Puromycilation 분석 결과 대 한 첫 번째 35 m m 유리 하단 접시를 사용 하 여 (단계 2.1.5 참조) 부정적인 제어로 두 번째를 사용 하 여 (단계 2.1.6 참조).
   4. 세포 접착 및 SIC 형성 있도록 55 분 37 ° C (5% CO ₂)에서 세포를 유지.
   5. 이전 제 1 정의 농도 사용 하 여 35 m m 유리 하단 요리 (시험) 매체에 추가 puromycin. MRC 5 셀을 치료 하려면 10 µ g/mL puromycin 37 ° C (5% CO ₂)에서 5 분.
   6. 부정적인 컨트롤 추가 cycloheximide 두 번째 35 m m 유리 하단 접시 40 분 미리 50 µ g/mL cycloheximide ( 그림 2B)와 그들을 치료 하는 세포를 뿌리기 후. 다음, cycloheximide 또한, 후 15 분 추가 단계 2.1.5 (예: 사용 10 µ g/mL puromycin MRC-5 (5% CO ₂) 37 ° C에서 5 분)에서 같은 농도 및 부 화 시간을 사용 하 여 매체에 puromycin.
   7. 씻어 얼음의 2 mL로 두 번 각 플레이트 1 X PBS 및 실 온 (RT)에서 15 분 동안 4% 포름알데히드 (1 X PBS에 희석)의 1 mL와 함께 셀을 수정.
      주의: Paraformaldehyde 사용 해야 합니다 엄격 하 게 화학 후드.
2. Immunostaining.
   1. Paraformaldehyde 고정, 1 X PBS의 2 mL로 세 번 세척 하 고 세포를 permeabilize를 RT 20 분에 대 한 PBS-TritonX-100 (0.5%)의 500 µ L에서 품 어.
   2. 특이 항 체 바인딩 방지 하기 위해, 500 µ L PBS와 샘플을 차단 – 실시간에서 20 분 (1%) BSA
   3. PBS-Tween20 (0.1%)의 2 개 mL로 세 번 세척 하 고 실시간에 1 시간에 대 한 1 X PBS에 안티 puromycin 항 체 (12 D 10) 희석 1:12,500의 300 µ L로 품 어
   4. PBS Tween20 (0.1%)의 2 개 mL로 3 번 세척 하 고 반대로 마우스 IgG는 fluorophore를 활용의 300 µ L로 품 어 (여기, 488 nm) 희석 puromycilated polypeptides를 시각화 하는 PBS와 phalloidin 활용 된 다른 fluorophore를 (여기, 555 nm) 에 F-말라 시각화. 실시간에서 1 시간에 대 한 품 어
   5. PBS Tween20 (0.1%)의 2 개 mL로 세 번 세척 하 고 다음 5 분 동안 RT에서 300 µ L에 PBS Tween20 (0.1%)의 1 µ g/mL 4 보충 품 어 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
   6. 는 PBS Tween20 (0.1%)의 2 개 mL로 세 번 세척 하 고 1 X PBS의 2 mL로 씻어. 이미지 수집 동안 1 X PBS의 2 ml에서 샘플을 유지 하 여 건조에서 세포를 방지.

3. Immunofluorescent 이미지 수집

참고: 다음 방법론 어떤 상용 confocal 이미징 시스템 함께 사용할 수 있습니다.

정량화에 대 한 동적 범위를 극대화 하기 위해 각 fluorophore

1. 결정 적절 한 설정을.
   참고: 대표적인 정량화만 얻을 수 있습니다 픽셀 채도 피할 경우 신호 임계값 제대로 조정 됩니다. 이러한 설정은 수 얻을 레이저 전력, 높은 전압 (HV), 신중 하 게 조정 하 여 달성 그리고 오프셋.
   1. 조정 확대/축소 계수 (X 5) 및 픽셀 (512 x 512) 픽셀 크기를 최적화할 수.
      참고:이 이상 2.3 번 보다 작아야 광학 해상도, Nyquist 법칙에 따라.
   2. 스캔 속도 (12.5-20 µs/픽셀)을 감소 하 고 위에서 언급 한 설정 신호 대 잡음 비율 개선 (2-3 시간) 평균 사용.
2. 수동으로 적절 한 정상을 결정 하 고 최적의 스텝 크기 (0.4 µ m/슬라이스)와 z 축 따라 초점 비행기 아래쪽.
   참고: 단계 크기 비행기 Nyquist 법칙에 따라 2.3을 나눈 축 해상도 의해 결정 됩니다. 일반적으로 20-25 레이어는 부착 세포의 전체 셀 깊이 커버 하는 데 필요한.
3. 60 X 계획 Apo 기름 침수 목적 (1.42 숫자 조리개)으로 전체 단일 셀의 공초점 이미지 획득.

4. Immunofluorescent 이미지 정량화

1. 농축의 결정.
   1. 관심의 z-평면 레이어 ImageJ 소프트웨어 (http://fiji.sc에서 사용할 수 있는 프리웨어)을 사용 하 여 인수 셀 데이터 파일에서 해당 이미지를 엽니다.
   2. 선 그리기 도구를 사용 하 여 선 그리기 (도구 모음 → 직선) 정량화 원하는 셀의 영역을 통해. 두 번 클릭 하 여 선 두께 수정 " 직선; " 강도 값 ( 그림 3에 8에서 설정) 라인의 폭을 통해 평균 됩니다.
      참고: 얇은 라인을 다른 구조에서 신호 중복을 피하기 위해 선호 된다.
   3. 라인을 제대로 설정 프로필 결정된 축 따라 신호 밀도 (메뉴 모음 → 분석 → 플롯 프로필).
      참고: 새 창이 열립니다 선택한 z-평면 섹션에 대 한 라인을 따라 (특정 fluorophore) 선택 된 채널의 각 픽셀에 대 한 신호 강도에 해당 하는 프로필을 보여줍니다.
   4. 반복 (즉, 488, 568, 및 405에 대 한 하나에 대 한 정량화) 해당 fluorophore 사용 하는 각 채널에 대 한 프로세스
      .
      참고: 신호 강도 값은 항상 주문할 수 그린된 라인의 방향을 따라.
   5. 선택한 z-평면 계층의 quantifications에 해당 프로 파일의 각 픽셀에 대 한 숫자 회색 배율 조정 값을 얻기 위해 프로 파일 데이터를 복사 (이미지 창에서 메뉴 모음 → 복사) 모든 스프레드시트 소프트웨어에 붙여 넣습니다.
   6. 반복 단계 취득된 공초점 이미지의 각 z-평면 섹션 및 정량화 원하는 각 채널에 대 한 4.1.1-4.1.4.
      참고: 다른 z-평면 레이어의 정량화 각 z-평면 계층에 대 한 라인을 따라 각 픽셀의 합계 값을 계산 하 여 신호의 특별 한 우라늄 농축의 일반적인 평가 얻기 위해 풀링된 수 있습니다. 이러한 유형의 풀링 그린 선 평균 값에 포함 된 각 z-평면 계층에 대 한 동일한 경우 달성 될 수 있다만.
   7. 층의 다 수 다른 채널의 전체 셀 정량화에 대 한 대체 방법으로 StackprofileData 라는 매크로 사용 하 여 (추가 파일 참조).
      참고:이 매크로 https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt에 자유롭게 액세스할 수 있으며 다음과 같이 사용할 수 있습니다:
      1. 매크로 텍스트 파일에 붙여 및 저장 합니다
      .
      2. 모든 셀의 confocal 레이어가 포함 된 이미지 파일을 엽니다.
      3. 선 그리기, 단계 4.1.2에에서 설명 된 대로 매크로 가져올 새로운 창을 열고 (메뉴 모음 → 플러그인 → 매크로 → 실행)에 해당 하는 StackprofileData 매크로 이전에 저장 된 텍스트 파일을 선택 하 고 클릭 " 오픈. "
         참고: 다음 매크로 수입, 새 창 라는 " 결과 " 열리고 모든 결정된 축 따라 정량화의 각 z-평면 레이어 나열 됩니다 및 이미지 파일에 채널.
      4. 각 채널에 대 한 데이터를 복사 (메뉴 모음 → 편집 → 복사) 그래픽 프로 파일 표현에 해당 하는 신호 quantifications를. 스프레드시트 소프트웨어에 그것을 붙여 넣습니다. 각 z-평면 계층에 대 한 라인을 따라 각 픽셀에 대 한 각 채널의 합계 값을 계산 합니다. 이러한 값을 사용 하 여 그림 3에 제시 하는 것과 유사한 그래픽 표현을 만들.
2. 지정 된 세포질 영역 또는 볼륨에 신호의 정량화.
   1. ImageJ 소프트웨어 이미지 파일을 엽니다.
   2. 기하학적 양식 기능을 사용 하 여 관심 영역을 표시 하는 영역 그리기 (도구 모음 → " 사각형, " " 타원형, " 또는 " 다각형 ").
      참고: 정량화 값 그려진된 형태에 해당 하는 영역에 대 한 결정 됩니다.
   3. 조정 임계값을 피하기 위해 어떤 배경 신호 (메뉴 모음 → 이미지 조정 → 임계값); 픽셀 농도 막대 그래프 형태로 표현 하기 위해 새 창이 나타납니다. 슬라이더를 사용 하 여 정량화에 픽셀을 포함 하거나 제외할 값을 변경 합니다. 픽셀을 빨간색으로 강조 표시는 정량화에 포함 될 셀을 밖에 서 빨간색 픽셀을 제거 하는 임계값을 선택.
   4. 배경 신호 없이 선택 된 영역 내에서 픽셀 신호 척도를 측정 매개 변수 정의 (메뉴 모음 → 분석 → 측정 설정), 확인 하 고 있는지는 " 임계값 제한 "와 " 통합 밀도 " 상자.
   5. 측정 선택 된 영역에 대 한 정량적 값 (메뉴 모음 → 분석 → 측정).
      참고: 새 창 아래에 표시 됩니다 신호 강도 정량화는 " IntDen " 평균 회색 값과 선택된 영역 내의 픽셀 수의 제품을 나타내는 식별.
   6. 기하학적 형태를 사용 하 여 전체 셀을 포함 하는 영역 그리기 (도구 모음 → " 사각형, " " 타원형, " 또는 " 다각형 ") 총 신호에 해당 값을 가져오는 단계 4.2.3-4.2.5와 함께 진행. 관심의 영역 내에서 신호 비율을 얻기 위해 전체 신호 선택 된 영역 내에서 신호 비율 계산.
   7. 각 z-비행기에 대 한 셀 볼륨의 정량화를 반복 단계 4.2.2-4.2.6. 필요에 따라 기하학적 형태를 적응.
   8. 복사/붙여넣기에서 얻은 데이터는 " 결과 " 그래픽 묘사 및 평균 값을 찾기 위해 스프레드시트에 각 z-평면 계층에 대 한 윈도우.

결과

관찰 하기 위해 정확 하 게 번역 이벤트 puromycin 관을 사용 하 여, 그것은 각각 다른 puromycin 법인 활동 (그림 1)^{9,11 보여주기 때문에 각 셀 라인에 대 한 최적의 조건을 결정 하는 중요 한 ,,1218}. 따라서, puromycin 설립의 유효성을 검사, 그것은 puromycin의 농도 ...

토론

최근의 기술 진보는 변환 upregulation에 관련 된 메커니즘의 이해 또는 신경 개발, 약물 반응 및 전이 등의 생물학적 프로세스에서 특정 한 mRNAs의 억압에 대 한 수 있다. 여기에 설명 된 비용 효율적인 방법론 번역 이벤트를 RNA 의무적인 단백질 세포 접착, 마이그레이션, 및 침략 등의 전이성 프로세스를 규제 하는 방법을 공부 하는 셀에 구상 될 수 있습니다.

수많은 방법은 de ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	wisent	319-005-CL
Trypsine	wisent	325-043 EL
FBS	Thermo Fisher Scientific	12483020
Puroycin antibody 12D10	EMD millipore	MABE343	western blot dilution 1:25,000 Immunofluoresence dilution 1:10,000
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	cell signaling technology	7076	western blot dilution 1:8,000
Western Lightning Plus-ECL	Perkin Elmer	NEL104001EA
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate)	cell signaling technology	4408	immunofluoresecence dilution 1:400
CF568 Phalloidin	biotium	00044	immunofluoresecence dilution 1:400
Cyclohexmide	Sigma	C1988-1G	50µg/ml final concentration
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	final concentration 1µg/ml
Puromycin	bio-Basic	PJ593	2.5µg/ml to 10µg/ml
Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat	Ibidi	81156
MRC-5 cells	ATCC	CCL-171
HeLa cells	ATCC	CCL-2
Huh-7 cells	from Dr. Mazroui (Université Laval)
Fv1000	olympus		confocal imaging system
Fiji software			http://fiji.sc
PBS (Phosphate BuffeRed Saline)	bio-Basic	PD8117
Formaldehyde 37% Solution	bio-Basic	C5300-1
Triton X-100	bio-Basic	TB0198
BSA	Fisher Bioreagents	BP9702-100
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500