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要約

本稿では、可視化し、細胞内コンパートメントのローカライズされた翻訳イベントを定量化する方法について説明します。本稿で提案する手法は基本的な共焦点イメージング システムと試薬が必要です、迅速かつ費用対効果。

要約

MRNA の翻訳を規定しているメカニズムは、複数の疾患だけでなく生殖細胞形成、細胞分化と器官形成などの様々 な生物学的過程に関与しています。多数の出版物は説得力のある特定のメカニズムがしっかりと mRNA の翻訳を調節する示されています。蛋白質の表現の翻訳による規制の高められた興味は調査し次のde novoタンパク質合成cellulo の新規手法の開発につながっています。ただし、これらのメソッドのほとんどは複雑で、高価なそれらを作ると、よく学ぶことができます mRNA ターゲット数の制限します。この原稿は、のみ基本的な試薬とを測定し、様々 な条件の下で任意のセルの行で発生する mRNA の翻訳の変化を可視化する共焦点蛍光イメージング システム必要とする手法を提案します。このメソッドはさまざまな生物の中に短い期間のde novo翻訳を可視化する可能性を提供しています、時間の短い期間で付着性のセルの細胞内の構造にローカライズした訳語を表示する最近使用されました。プロセスまたは特定の刺激への応答の橋渡し活動の変更を検証します。

概要

翻訳さまざまな細胞機能の調節は、新しいツールや mRNA の翻訳と規制タンパク質合成1,2 の細胞レベル下の局在を決定する方法を開発する多くの研究チームを求めています。、3,4。これらの最近の技術の進歩により翻訳アップレギュレーションや神経の開発、薬剤応答、5 転移などの生物学的プロセスの間に特定の Mrna の抑圧のメカニズムの理解の改善 ,6,7,8。ただし、これらのメソッドのほとんどは、高価なまたは危険な試薬およびほとんどの実験室にできない可能性があります特定の機器を必要。など、翻訳イベントの迅速な評価を可能にするコスト効果の高い方法は、具体的には、これらの潜在的な問題を回避するために開発されました。このメソッドは、特定の細胞プロセス中に発生する急性の並進変調を検出し、共焦点顕微鏡を用いた翻訳の局在化のためことができます。

ここで説明した方法は、拡散開始センター (SIC)5と呼ばれる細胞レベル下コンパートメント内にあるローカライズされた翻訳を監視する使用されました。Sic は、シード細胞初期接着複合体の上にローカライズされる一時的な構造です。Sic および接着複合体が異なるが、彼らの運命は密接に関連します。確かに、接着の初期段階で密着サイトへと焦点接着の複雑な成熟化に徐々 に消えてしまう Sic が知られています。分かった mRNA 翻訳 (例えばSam68、FMRP、および G3BP1) を具体的に制御する知られている RNA 結合蛋白質と Rna は、これらの濃縮した polyadenylated 構造5。ここで説明する方法を使用して、細胞接着の統合セルを SIC 関連 mRNA の翻訳ができるようにチェックポイントとして行為の規制にシードを紹介しました。翻訳の試金 (日没) の表面検出の適応バージョン ピューロマイシン定款に基づいて、このメソッドが考えられます。もともと非放射能標識アミノ酸を使用した世界のタンパク質合成速度を測定するために開発され、蛋白質 puromycilation はde novoタンパク質合成9を可視化する効率的な方法を提供しています。このメソッドは、ピューロマイシン、リボソーム10で時期尚早鎖終結経由で翻訳をブロックする抗生物質の固有の動作に依存します。確かに、ピューロマイシンはペプチド結合の形成によるペプチド鎖の伸長に混入の可能チロシル tRNA に構造的に似ています。しかし、成長しているペプチド鎖にピューロマイシン結合は、ピューロマイシン Trna の加水分解性エステル結合ではなく非加水分解性アミド結合を持っているので、次のアミノアシル tRNA が形成されてから新しいペプチド結合を防ぎます。したがって、ポリペプチド鎖の伸長にピューロマイシン定款の9,mRNA 積極的に翻訳された11,12 に対応する多数の切り捨てられた puromycilated ポリペプチドの早期リリースで結果します。.

このメソッドを使用すると、短時間未亡人内でアクティブな翻訳を評価することが可能だった (など5 分) 5 分期間の抗生物質と補われた細胞ピューロマイシンに対して指示される抗体を用いた細胞接着中細胞接着中に異なる時点で5を処理します。本法の精度は puromycilated 部位に対する特異性の高い抗体に依存しています。Puromycilated ポリペプチドの蛍光検出では、共焦点イメージング システムを使用して非常に正確に定量化することができますも新たに翻訳された mRNA の一般的な細胞レベル下の再パーティション化を提供します。

したがって、このメソッドは、神経肉芽6,13,14,などのプロセスに関与する並進運動の調節機構を調査する実験室の多数の関連するオプションを提供しています15、モルフォゲン mRNA の局在、および開発16,17時に翻訳。それはまた急速な生命現象、細胞遊走、接着、浸潤などまたは単に並進変更5,を誘導するかもしれない薬物治療を評価するために中にローカライズ済みまたは区分の翻訳の勉強にも適しています7,18. 全体的にみて、この方法は迅速かつ正確でコスト効果の高い方法でローカライズ済みまたは制御された翻訳イベントの可視化すること。

プロトコル

1 です。 Puromycilation 条件の定量

注: この手法 MRC 5 セル接着プロセス 5 中にローカライズされた翻訳を評価する方法について説明します。Puromycilation は、任意のセルで行うことができます、処理条件が各セルライン ピューロマイシン濃度と目的の面で同一ではないので、使用する特定のセル行の puromycilation 条件を最適化することが重要です。インキュベーション時間。ピューロマイシン濃度の異なるインキュベーション時間の増加で処理した 3 例のセル行 (すなわち、 hela 細胞、MRC-5、およびホ-7)、これらの条件を定義する方法を表示する ( 図 1).

  1. 成長の適切な 0.5 mL で 24 ウェル プレート内のセルの同じ数字を培 16 h テストの前に完了します。種 30,000 MRC 5 セル、50,000 の HeLa 細胞あるいはウェルあたり 50,000 の許 7 セル。60-70% 合流点 (図 1 a) を超えないようにすることを確認します
    2. 。
  2. 準備 6 ピューロマイシン (0、5、10、15、20、および 30 μ g/mL) の濃度の増加との完全な細胞培養液 1.5 ml チューブします。37 ° C であらかじめ暖かい
  3. は、ピューロマイシン媒体 (の準備ステップ 1.2) の各濃度転送から 0.5 mL のそれぞれは 6 の新しいチューブにチューブ、最終 50 μ G/ml の濃度ですべて 6 新しいチューブ シクロヘキシミドを追加します。37 ° C であらかじめ暖かい
  4. は、0.5 ml の完全培地 (行 1 および 2) の媒体を変更します。3 行目、シクロヘキシミド ( 図 1 b) の 50 μ g/mL を添加した完全な培養液 0.5 mL を追加します
    。 注: シクロヘキシミド治療法は、翻訳伸長をブロックする機能のための蛋白質の puromycilation の最高のネガティブ コントロールとして確立されています。シクロヘキシミド処理が puromycilated 蛋白質信号 5 , 18 の損失につながるピューロマイシン定款翻訳伸長する必要があるためです
    5. 。
  5. 37 ° c (5% CO 2) 15 分間インキュベートします
    6. 。
  6. は、それぞれ列 A、B、C、D、E、および F の最終濃度 0、2.5、5、7.5、10、15 μ G/ml を取得する 2 番目の行に手順 1.2 で調製したピューロマイシン培地の 0.5 mL を追加します。同時にシクロヘキシミド添加培地に (手順 1.3) ( 図 1) の 3 番目の行の後 0.5 mL を追加します
    7. 。
  7. 37 ° C (5% CO 2) で 5 分間インキュベートします
    8. 。
  8. 0.0、2.5、5、7.5、10、15 μ G/ml ( 図 1) の最終濃度を取得する最初の行にステップ 1.2 で調製したピューロマイシン培地の 0.5 mL 追加します
    9. 。
  9. 37 ° C (5% CO 2) で 5 分間インキュベートします
    10. 。
  10. は、それぞれ洗ってリン酸緩衝の冷たい 1 X ml の 1 行 1 に 3 生理食塩水 (PBS) 添加後 5 分 (二度洗い) の最初の行の井戸を後からも。1 X Laemmli バッファーを 75 μ l 添加 (4% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、4 %2-メルカプトエタノール、0.120 M トリス塩酸 pH 6.8, 0.004% ブロモフェノールの青、および 10% グリセロール) 条件ごとに全体セル lysates を取得する
    11. 。
  11. 実行 10 %sds ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) ピューロマイシン定款を評価するために作製した試料の 1/3 を使用しています。
    1. 1:25,000、一次抗体の孵化のバッファー (2% ウシ血清アルブミン (BSA))、430 mM の NaCl、10 mM Tris pH 7.4 では、0.01% の比率で希釈した反ピューロマイシン抗体 (12 D 10) を用いたウェスタンブロッティング ピューロマイシン定款のレベルを決定します。アジ化ナトリウム).
      注: 手順 1 で説明した別のセル行の抽出に対応する代表的なイメージは、 図 2 の例として表示されます
      2. 。

2。Cellulo でローカライズ翻訳可視化

注: ここで説明する手法は、接着プロセス 5 中に Sic MRC 5 細胞内のローカライズされた翻訳を評価するために使用されました。手順 2.1 で説明したのと同じ方法で他のセルの行を使用できます MRC 5 細胞はここで使われますが、.

  1. セル準備。 ハンクの 0.25% トリプシン/2.21 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を使用して
    1. デタッチ MRC 5 セル ' s バランスの取れた塩ソリューション (HBSS)。15 mL コニカル遠心管中 (200 x g で 5 分) 遠心分離によって細胞をペレットし、ダルベッコのそれらを停止 ' s 修正イーグル培 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS) 40,000 セル/ml でカウントを納めたカウント後
      2. 。
    2. 孵化緩やかな回転の懸濁液でそれらを維持するために 20 分間チューブ回転子を使用して下の 37 ° C で浮遊細胞
      。 注: この手順は焦点接着複合体の完全な分離を可能にするために重要です
      3. 。
    3. 中断された MRC 5 細胞 (40,000 セル/mL) 2 つの 35 mm ガラス底料理のプレート 2 mL。Puromycilation 試金のための最初の 35 mm ガラス底皿を使用 (手順 2.1.5 参照)、陰性対照として 2 番目を使用 (手順 2.1.6 参照).
    4. の細胞接着と SIC の形成を許可する 55 分の 37 ° c (5% CO 2) 細胞を維持します
      5. 。
    5. 以前セクション 1 で定義された濃度を使用して 35 mm ガラス底培養皿 (法) におけるメディア追加ピューロマイシン。MRC 5 細胞を治療するために 37 ° C (5% CO 2) で 5 分間 10 μ G/ml ピューロマイシンを使用します
      6. 。
    6. ネガティブ コントロールとしてシクロヘキシミドを 2 番目の 35 mm ガラス底皿 40 分に 50 μ G/ml シクロヘキシミド ( 図 2 b) とそれらを扱う前に細胞を播種後追加。シクロヘキシミド添加後 15 分でピューロマイシンをステップ 2.1.5 (例えば、 使用 10 μ G/ml MRC 5 の 37 ° c (5% CO 2) 5 分後) のように同じ濃度と潜伏期間を使用してメディアに追加します
      7. 。
    7. 洗って冷たい 2 mL 2 回、各プレート 1 X の PBS と 1 ml 室温 (RT) で 15 分の 4% のホルムアルデヒド (1 × PBS で希釈) のセルを修復する
      。 注意: パラホルムアルデヒドされる必要があります厳密に化学フード
      8. 。
  2. 染色。
    1. パラホルムアルデヒドの固定、次 3 回 2 mL の 1x PBS で洗浄し、500 μ L の PBS-TritonX-100 (0.5%) でセルを permeabilize RT で 20 分間インキュベートします
      2. 。
    2. 非特異的な抗体の結合を防ぐためには、500 μ L の PBS でサンプルをブロック – 室温に 20 分間 BSA (1%)
    3. 2 ml の PBS Tween20 (0.1%) の 3 倍を洗って室温 1 時間 1x PBS で希釈反ピューロマイシン抗体 (12 D 10) 1:12,500 の 300 μ L でインキュベート
    4. 2 ml の PBS Tween20 (0.1%) の 3 倍を洗浄し、抗マウス IgG、fluorophore に共役の 300 μ L と孵化 (ここ、488 nm) 電子共役系と puromycilated ポリペプチドを視覚化する PBS で希釈別 fluorophore に (ここ、555 nm)F-アクチンを視覚化します。室温 1 時間孵化させなさい
    5. PBS Tween20 (0.1%) 2 mL で 3 回洗浄し、5 分間インキュベーション RT で 300 μ L の PBS Tween20 (0.1%) の 1 μ g/mL 4 を添加した '、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
    6. は、PBS Tween20 (0.1%) 2 mL で 3 回洗浄し、2 mL の 1x PBS で洗浄します。セルのイメージ取得中に 2 ml の 1x PBS のサンプルを維持することで乾燥を防止します
      7. 。

3。蛍光画像の取得

注: 次の方法は、市販の共焦点イメージング システムで使用できます

。 定量化のダイナミック レンジを最大化する各 fluorophore の
  1. を決定する適切な設定します
    。 注: 代表的な定量化は、ピクセルの彩度は避け、信号しきい値を正しく調整する場合にだけ取得することができます。これらの設定は、慎重に高電圧 (HV) のレーザー出力を調整することによって達成を得るため、オフセット。
    1. 調整、ズーム ファクター (5 X) とピクセル サイズを最適化する (512 x 512) ピクセル数
      。 注: これがナイキスト定理によると、少なくとも 2.3 倍未満の光学解像度をする必要があります
      2. 。
    2. スキャン スピード (12.5 20 μ s/ピクセル) が低下して上記の設定によると信号対雑音比を改善するために (2-3 回) の平均を使用します
      3. 。
  2. 手動で適切なトップを決定し、最適なステップ サイズ (0.4 μ m/スライス) の z 軸に沿って焦点面を下します
    。 注: ステップ サイズ面は、ナイキスト定理によると、2.3 で割った値軸の解像度によって決定されます。通常、20-25 層、付着性のセルのセル全体の深さをカバーするために必要な
    3. 。
  3. 、60 X Plan Apo 油浸対物レンズ (1.42 開口) と全体の単一細胞の共焦点画像を取得します
    4. 。

4。蛍光画像の定量化

  1. の濃縮定量。
    1. ImageJ ソフトウェア (フリーウェア http://fiji.sc で利用可能) を使用して取得したセル データ ファイルから興味を持つ z 平面層に対応するイメージを開きます
      2. 。
    2. は、線の描画ツールを使用して線を描く (ツール バー → ストレート) 定量化が必要なセルの領域を。ダブルクリックすると線幅を変更 " ストレート; " ( 図 3 の 8 で設定) の行の幅を平均照度値がなります
      。 注: 薄くラインが異なる構造から信号の重なりを避けるために好ましいです
      3. 。 行を正しく設定すると後の
    3. プロファイル決定の軸に沿って信号密度 (メニュー バー → 分析 → プロファイルのプロット).
      注: 新しいウィンドウが開きます選択した z 平面断面の線に沿って選択したチャネル (特定 fluorophore) の各ピクセルの輝度に対応するプロファイルを示しています。
      1. 使用蛍光に対応する各チャンネル (488 568、405 の 1 つ 1 つの すなわち、 1 つ数量) の処理を繰り返します
        。 注: 信号強度の値は、常に並べ替えられます次の描画の線の向き.
    4. 選択 z 平面レイヤーの数量に対応するプロファイルの各ピクセルの数値のグレースケール値を得るためには、プロファイル データをコピー (イメージ ウィンドウのメニュー バー → コピー) し、表計算ソフトに貼り付けます
      5. 。 取得した共焦点画像各 z 平面断面と定量化が必要な各チャネルのための
    5. 繰り返し手順 4.1.1-4.1.4.
      注: 各 z 平面レイヤーの線に沿って各ピクセルの合計値を計算することによって信号の特別な濃縮活動の一般的な評価を取得する別の z 平面レイヤーの定量化をプールできます。描画される線の平均値に含まれる z 平面レイヤーごとに同一である場合、このタイプのプールを達成のみことができます
      6. 。
    6. 、層の大規模な数と異なるチャンネルの全細胞の定量化のための代替方法として StackprofileData に呼び出されるマクロを使用して、(補足ファイル を参照してください).
      注: このマクロは https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt で自由にアクセスできる、次のように使用することができます:
      1. のテキスト ファイルにマクロを貼り付け、それを保存
      2. のすべてのセルの共焦点のレイヤーが含まれているイメージ ファイルを開きます
        3. 。
      3. は、線を描画、4.1.2 の手順に従って、マクロをインポートする新しいウィンドウが開きます (メニュー バー → プラグイン → マクロ → を実行)、StackprofileData マクロに対応する以前に保存したテキスト ファイルを選択し、クリックして、" 開く "
        。 注: 次のマクロ輸入新しいウィンドウという " 結果 " が開き、すべて決定の軸に沿って定量化の z 平面レイヤーごとに表示され、チャネルの画像ファイル内に存在します
        4. 。
      4. は、各チャンネルのデータをコピー (メニュー バー → 編集 → コピー) 信号の数量に対応するプロファイルのグラフィカルな表現を取得します。任意の表計算ソフトに貼り付けること。各 z 平面レイヤーの線に沿って各ピクセルの各チャンネルの合計値を計算します。 図 3 のようなグラフィカルな表現を作成するこれらの値を使用します
        5. 。
  2. 指定携帯電話エリアまたはボリュームで信号の定量化。
    1. ImageJ ソフトウェアで画像ファイルを開きます
      2. 。
    2. は、幾何学的なフォーム機能を使用して関心のある領域を示す領域を描画 (ツール バー → " 四角形、" " オーバル、" または " ポリゴン ").
      注: 定量化値がフォームに描画に対応する領域の決定されます
      3. 。
    3. は、任意のバック グラウンド信号を避けるためにしきい値レベルを調整 (メニュー バー → イメージ調整 → のしきい値); ヒストグラム形式でピクセル強度を表す新しいウィンドウが表示されます。スライダーを使用して定量化のピクセルを除外する値を変更します。定量化にピクセルが赤で強調表示されますが表示されます赤いピクセルが細胞外に排除するしきい値を選択します
      4. 。
    4. バック グラウンド信号なしの選択した領域内の画素信号を定量化する測定パラメーターを定義 (メニュー バー → 分析 → 設定測定)、確認してくださいと、" のしきい値の制限 " と " 集積密度" ボックス
      5. 。
    5. は、選択した領域の定量的な値を測定 (メニュー バー → 分析 → メジャー).
      注: 信号強度の定量化がの下で新しいウィンドウで表示されます、" IntDen " id は、製品の平均グレー値の選択した領域内のピクセルの数を表します
      6. 。
    6. は、幾何学的なフォームを使用してセル全体を含む領域を描画 (ツール バー → " 四角形、" " オーバル、" または " ポリゴン ")、全信号に対応する値を取得する 4.2.3-4.2.5 を手順に進みます。関心のある領域内の信号の割合を取得する全体の信号の選択した領域内の信号の比を計算します
      7. 。
    7. 繰り返しの手順 4.2.2-4.2.6 各 z 平面の細胞容積の定量化を取得します。必要に応じて、幾何学的形態を適応します
      8. 。
    8. コピー/貼り付けデータから取得、" 結果 " スプレッドシートをグラフィカルに表示、平均値を検索するに z 平面レイヤーごとに windows
      9. 。

結果

ピューロマイシン定款を使用して翻訳イベントを正確に観察するには、それぞれは異なるピューロマイシン定款動態 (図 1)9,11 を示していますので、各セルラインの最適条件を決めることが大事です。 ,12,18。したがって、ピューロマイシン定款を検?...

ディスカッション

最近の技術の進歩は、並進運動の発現に関与するメカニズムの理解または神経の開発、薬剤応答、転移などの生物学的プロセスの特定の Mrna の抑圧の許可しています。ここで説明したコスト効果の高い方法により、翻訳イベント RNA 結合蛋白質が細胞接着、移行、侵略などの転移プロセスを調節する方法を研究する細胞で可視化することです。

De novoタンパク質翻?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

原稿の批判的読解ありがとう博士ラシッド Mazroui (ラヴァル大学、ケベック、カナダ)。その技術支援研究センター細胞イメージング ユニットに感謝いたします。M. é Huot はフォン ・ デ ・ ジュニア 1 研究学者 Recherche du ケベック州健康 (周波数 S)。この作品は、(許可番号機構、M. É とモップ 286437 健康研究のカナダの協会によって支えられました。Huot)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMwisent319-005-CL
Trypsinewisent325-043 EL
FBSThermo Fisher Scientific12483020
Puroycin antibody 12D10EMD milliporeMABE343western blot dilution 1:25,000
Immunofluoresence dilution 1:10,000
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibodycell signaling technology7076western blot dilution 1:8,000
Western Lightning Plus-ECLPerkin ElmerNEL104001EA
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate)cell signaling technology4408immunofluoresecence dilution 1:400
CF568 Phalloidinbiotium00044immunofluoresecence dilution 1:400
CyclohexmideSigmaC1988-1G50µg/ml final concentration
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)InvitrogenD1306final concentration 1µg/ml
Puromycinbio-BasicPJ5932.5µg/ml to 10µg/ml
Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreatIbidi81156
MRC-5 cellsATCCCCL-171
HeLa cellsATCCCCL-2
Huh-7 cellsfrom Dr. Mazroui (Université Laval)
Fv1000olympusconfocal imaging system
Fiji softwarehttp://fiji.sc
PBS (Phosphate BuffeRed Saline)bio-BasicPD8117
Formaldehyde 37% Solutionbio-BasicC5300-1
Triton X-100bio-BasicTB0198
BSAFisher BioreagentsBP9702-100
Tween20Fisher BioreagentsBP337-500

参考文献

  1. Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
  2. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
  3. Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
  4. Halstead, J. M., et al. TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals. Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).
  5. Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration. J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).
  6. El Fatimy, R., et al. Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules. PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).
  7. Adjibade, P., et al. Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells. Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).
  8. Paronetto, M. P., et al. Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis. J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).
  9. Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. n. S. E. T. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6, 275-277 (2009).
  10. Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).
  11. Goodman, C. A., Hornberger, T. A. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques. Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).
  12. David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).
  13. Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation. Brain Res. 1462, 81-92 (2012).
  14. Costa-Mattioli, M., et al. Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2. Nature. 436, 1166-1173 (2005).
  15. Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory. Neuron. 61, 10-26 (2009).
  16. Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization. Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).
  17. Ephrussi, A., St Johnston, D. Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures. Cell. 116, 143-152 (2004).
  18. Mardakheh, F. K., et al. Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions. Dev Cell. 35, 344-357 (2015).
  19. Lacsina, J. R., et al. Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation. PLoS One. 7, e51968 (2012).
  20. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).
  21. Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5. Nature. 227, 168-170 (1970).
  22. Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), (2014).

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