Immunofluorescence quantitative de mesure globale localisée Translation

Résumé

Cet article décrit une méthode pour visualiser et quantifier les événements de traduction localisée dans les compartiments subcellulaires. L’approche proposée dans ce manuscrit nécessite un système d’imagerie confocal base et réactifs et est rapide et rentable.

Résumé

Les mécanismes régulant la traduction de l’ARNm sont impliqués dans divers processus biologiques, tels que le développement des lignes germe, la différenciation cellulaire et organogenèse, ainsi que dans plusieurs maladies. Convaincante, nombreuses publications ont montré que des mécanismes spécifiques réglementent étroitement traduction de l’ARNm. Un intérêt accru dans la régulation induite par la traduction de l’expression protéique a conduit à l’élaboration de nouvelles méthodes pour étudier et suivre de novo protéine synthèse en cellulo. Cependant, la plupart de ces méthodes est complexe, ce qui les rend plus coûteux et souvent limitant le nombre de cibles ARNm qui peuvent être étudiés. Cet article propose une méthode qui nécessite seulement de base réactifs et un système d’imagerie confocal fluorescence de mesurer et de visualiser les changements en traduction de l’ARNm qui se produisent dans n’importe quelle ligne de la cellule dans diverses conditions. Cette méthode a récemment été utilisée pour montrer la traduction localisée dans les structures subcellulaires des cellules adhérentes sur une courte période de temps, offrant ainsi la possibilité de visualiser de novo traduction pendant une courte période au cours de diverses biologiques processus ou de validation des modifications dans l’activité traductionnelle en réponse à des stimuli spécifiques.

Introduction

La régulation de la traduction par différentes fonctions cellulaires a incité de nombreuses équipes de recherche pour développer de nouveaux outils et méthodes pour déterminer la localisation subcellulaire de traduction de l’ARNm et de protéines réglementé synthèse^{1,2 ,3,4}. Ces progrès technologiques récents permettent une meilleure compréhension des mécanismes impliquant upregulation de traduction ou de la répression des ARNm spécifiques au cours de processus biologiques, tels que le développement neuronal, la réaction aux médicaments et la métastase^{5 ,6,7,8}. Cependant, la plupart de ces méthodes nécessite des réactifs coûteux ou dangereuses et des équipements spécifiques qui ne sont peut-être pas disponibles pour la plupart des laboratoires. À ce titre, il a développé une méthode rentable pour permettre l’évaluation rapide des événements de traduction pour précisément à contourner ces problèmes potentiels. Cette méthode détecte des modulations translationnelles aiguës qui se produisent au cours de processus cellulaires spécifiques et permet également la localisation de la traduction à l’aide de la microscopie confocale.

Les méthodes décrites ici ont été utilisés pour surveiller une traduction localisée dans les compartiments subcellulaires appelé épandage initiation centres (SIC)⁵. SICs sont transitoires structures trouvées dans les cellules ensemencées sont localisés sur le dessus de complexes d’adhérence naissante. Bien que SIC et complexes d’adhérence sont distinctes, leurs destins sont étroitement liés. En effet, SICs sont connus pour disparaître progressivement après maturation complexe adhérence focale dans un site d’adhésion au cours de la phase initiale de l’adhérence. Nous avons constaté que les protéines de liaison à l’ARN connues pour contrôler plus précisément traduction ARNm (p. ex., Sam68, FMRP et G3BP1) et polyadénylé RNAs sont enrichis au sein de ces structures⁵. En utilisant les méthodes décrites ici, nous avons montré que la régulation de l’ARNm associés à SIC traduction agit comme un point de contrôle permettant ensemencé les cellules afin de consolider l’adhésion cellulaire. Cette méthode basée sur l’incorporation de la puromycine, pourrait être considérée une version adaptée de la détection de surface d’essai de traduction (coucher du soleil). Développé à l’origine pour mesurer les taux de synthèse protéique globale à l’aide d’un acide aminé non-radioactivement marqué, protéine puromycilation offre un moyen efficace pour visualiser de la synthèse protéique de novo ⁹. Cette méthode repose sur le comportement intrinsèque de la puromycine, un antibiotique qui bloque la traduction via la terminaison de la chaîne prématurée dans le ribosome¹⁰. En effet, la puromycine est structurellement analogue aux tyrosyl-tRNA, qui permet de l’incorporer dans allongeant chaînes peptidiques via la formation d’une liaison peptidique. Cependant, liaison de puromycine à une chaîne peptidique croissante empêche une nouvelle liaison peptidique se forment avec la prochain aminoacyl-tRNA, puisque la puromycine a une liaison amide non hydrolysables au lieu de la liaison ester hydrolysables dans l’ARNt. Ainsi, l’incorporation de puromycine allongeant polypeptides se traduit par la sortie prématurée de nombreux polypeptides puromycilated tronqué correspondant à activement traduction ARNm^9,11,12 .

En utilisant cette méthode, il était possible d’évaluer la traduction au sein d’une veuve de peu de temps (par exemple, 5 min) au cours de l’adhésion cellulaire à l’aide d’un anticorps spécifique contre la puromycine sur les cellules qui ont été complétées par l’antibiotique pendant 5 min à différents moments au cours de l’adhésion cellulaire traiter⁵. La précision de ce test s’appuie sur les anticorps hautement spécifiques dirigés contre la portion puromycilated. Détection par immunofluorescence du polypeptide puromycilated fournit une répartition subcellulaire générale de l’ARNm nouvellement traduit, qui peut aussi être évalués avec une grande précision à l’aide de systèmes d’imagerie confocale.

Par conséquent, cette méthode offre une option pertinente pour un grand nombre de laboratoires d’étude des mécanismes de réglementation translationnelles impliqués dans des processus tels que la granulation neuronale^{6,13,14, 15}, localisation d’ARNm autocatalytiques et traduction au cours du développement^16,17. Il est aussi bien adapté à l’étude de traduction localisée ou compartimentée au cours rapides événements biologiques, tels que la migration cellulaire, adhérence ou invasion, ou simplement évaluer les traitements médicamenteux qui pourraient induire des changements translationnelle^{5, 7 , 18}. dans l’ensemble, cette méthode permet la visualisation des événements de traduction localisée ou contrôlé d’une manière rapide, précise et rentable.

Protocole

1. détermination des Conditions de Puromycilation

Remarque : cette technique décrit la méthode utilisée pour évaluer une traduction localisée au cours de la MRC-5 cell adhesion processus ⁵. Comme puromycilation peut être fait dans n’importe quelle cellule, il est important d’optimiser les conditions de puromycilation pour les lignées de cellules spécifiques à utiliser, parce que les conditions de traitement ne sont pas identiques pour chaque ligne de la cellule en fonction de la concentration de la puromycine et le désiré temps d’incubation. Pour montrer comment ces conditions sont définies, trois lignées de cellules exemple (c'est-à-dire, HeLa, MRC-5 et Huh-7) ont été traitées avec des concentrations croissantes de puromycine pour temps d’incubation différentes ( Figure 1).

1. Grow nombres identiques de cellules dans une plaque 24 puits dans 0,5 mL de la remplir le milieu de culture 16 h avant l’essai. Cellules MRC-5 graines 30 000, 50 000 cellules HeLa ou 50 000 HuH-7 cellules par puits. Veillez à éviter de dépasser les 60-70 % confluence (Figure 1 a).
2. Préparer 6 tubes avec 1,5 mL de milieu de culture cellulaire complet avec des concentrations croissantes de puromycine (0, 5, 10, 15, 20 et 30 µg/mL). Préchauffez à 37 ° C.
3. Pour chaque concentration du milieu puromycine (document établi en étape 1.2), de transférer 0,5 mL de chaque tuyau dans 6 nouveaux tubes et ajouter cycloheximide à une concentration finale de 50 µg/mL à tous les nouveaux tubes de 6. Préchauffez à 37 ° C.
4. Changer le milieu avec 0,5 mL de milieu de culture complet (rangs 1 et 2). Pour la troisième ligne, ajouter 0,5 mL de milieu de culture complet additionné de 50 µg/mL de cycloheximide ( Figure 1 b).
   NOTE : Traitement de Cycloheximide a été établie comme le meilleur contrôle négatif pour la protéine puromycilation en raison de sa capacité à bloquer l’élongation de la traduction. Car l’incorporation de la puromycine nécessite élongation de la traduction, traitement de cycloheximide entraîne une perte de puromycilated protéine signaux ^{5 , 18}.
5. Incuber pendant 15 min à 37 ° C (5 % de CO ₂).
6. Ajouter 0,5 mL de milieu puromycine préparé à l’étape 1.2 à la deuxième rangée pour obtenir la concentration finale de 0, 2.5, 5, 7.5, 10 et 15 µg/mL, respectivement, dans les colonnes A, B, C, D, E et F. Dans le même temps, ajouter 0,5 mL de puromycine au milieu additionné de cycloheximide (étape 1.3) dans la troisième rangée ( Figure 1).
7. Incuber pendant 5 min à 37 ° C (5 % de CO ₂).
8. Ajouter 0,5 mL de milieu puromycine préparé à l’étape 1.2 au premier rang pour obtenir la concentration finale de 0,0, 2.5, 5, 7.5, 10 et 15 µg/mL ( Figure 1).
9. Incuber pendant 5 min à 37 ° C (5 % de CO ₂).
10. Laver chaque bien à partir de salin rangées 1 à 3 avec 1 mL de glacé 1 X tamponnée au phosphate (PBS) 5 min après l’addition de puromycine aux puits de la première ligne (laver deux fois). Ajouter 75 µL de tampon de X Laemmli 1 (4 % dodécylsulfate de sodium (SDS), 4 % de 2-mercaptoéthanol, 0,120 M Tris-HCl pH 6,8, 0,004 % de bleu de bromophénol et 10 % de glycérol) afin d’obtenir des lysats de cellules entières pour chaque condition.
11. Run 10 % électrophorèse SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) en utilisant 1/3 des échantillons préparés à évaluer l’incorporation de la puromycine.
    1. Déterminer le taux d’incorporation de la puromycine par analyse par Western blot, en utilisant un anticorps anti-puromycine (12 D 10) dilué à raison de 1/25 000 au tampon d’incubation de l’anticorps primaire (2 % sérum d’albumine bovine (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.4 et 0,01 % azoture de sodium).
       NOTE : Les images représentatives correspondant aux différentes cellules ligne extraits faits tel que décrit à l’étape 1 sont montrées comme exemples dans la Figure 2.

2. En Cellulo Localisée traduction visualisation

Remarque : la technique décrite ici a été utilisée pour évaluer la traduction localisée au sein de la CSI dans les cellules MRC-5 durant le processus d’adhérence ⁵. Bien que les cellules MRC-5 sont utilisés ici, autres lignées cellulaires peuvent être utilisées avec la même méthodologie décrite à l’étape 2.1.

1. Cellule préparation.
   1. Détacher MRC-5 cellules à l’aide de l’acide éthylènediaminetétraacétique 0,25 % trypsine/2.21 mM (EDTA) dans Hank ' s Balanced Salt Solution (HBSS). Les cellules de granule par centrifugation (5 min à 200 x g) dans un tube à centrifuger conique de 15 mL et suspendez-les dans Dulbecco ' s Modified Eagle moyenne (DMEM) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (SVF) à 40 000 cellules/mL après comptage avec une chambre de comptage.
   Incuber les cellules suspendues à 37 ° C sous rotation douce utiliser un tube pendant 20 min pour les maintenir en suspension les
   2. .
      Remarque : Cette étape est essentielle afin de permettre la dissociation complète des complexes adhérence focale.
   3. Plaque 2 mL de suspension MRC-5 cellules (40 000 cellules/mL) dans les deux plats de fond en verre 35 mm. Utilisez le premier plat 35 mm fond en verre pour le dosage de la puromycilation (Voir l’étape 2.1.5) et utiliser la seconde comme un contrôle négatif (voir étape 2.1.6).
   4. Garder les cellules à 37 ° C (5 % CO ₂) pendant 55 min permettant l’adhésion cellulaire et la formation de SIC.
   5. Ajouter la puromycine au milieu dans les plats de fond en verre 35 mm (essai) en utilisant la concentration précédemment définie à l’article 1. Pour traiter les cellules MRC-5, utilisez la puromycine 10 µg/mL pendant 5 min à 37 ° C (5 % CO ₂).
   6. Comme témoin négatif, ajouter cycloheximide au deuxième plat 35 mm fond en verre 40 min après l’ensemencement les cellules pour prétraiter avec 50 cycloheximide µg/mL ( Figure 2 b). Puis, 15 minutes après l’addition de cycloheximide, ajoutez la puromycine au milieu en utilisant le même temps de concentration et d’incubation comme au point 2.1.5 (p. ex., utilisation de 10 µg/mL de puromycine pendant 5 min à 37 ° C (5 % CO ₂) de la MRC-5).
   7. Laver chaque assiette deux fois avec 2 mL de glacé 1 X PBS et fixer les cellules avec 1 mL de 4 % de formaldéhyde (diluée dans une solution 1 PBS X) pendant 15 min à température ambiante (RT).
      ATTENTION : Paraformaldéhyde doit être utilisé strictement dans une hotte chimique.
2. Immunostaining.
   1. Après fixation de paraformaldéhyde, laver trois fois avec 2 mL de solution 1 PBS X et incuber 20 min à ta pour permeabilize des cellules dans 500 µL de PBS-TritonX-100 (0,5 %).
   2. Pour empêcher les anticorps non spécifique, bloquer l’échantillon avec 500 µL PBS – BSA (1 %) pendant 20 min à température ambiante.
   3. Laver trois fois avec 2 mL de PBS-Tween20 (0,1 %) et incuber à 300 µL de 1:12,500 des anticorps anti-puromycine (12 D 10) dilué dans 1 X PBS pendant 1 h à température ambiante.
   4. Laver 3 fois avec 2 mL de PBS-Tween20 (0,1 %) et incuber à 300 µL de anti-souris IgG conjugué à un fluorophore (ici, 488 nm) dilué dans du PBS à visualiser les polypeptides puromycilated et avec la phalloïdine conjugué à un autre fluorophore (ici, 555 nm) pour visualiser l’actine F. Incuber pendant 1 heure à température ambiante.
   5. Laver trois fois avec 2 mL de PBS-Tween20 (0,1 %) et puis incuber pendant 5 min à RT dans 300 µL de PBS-Tween20 (0,1 %) additionné de 1 µg/mL 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI).
   6. Laver trois fois avec 2 mL de PBS-Tween20 (0,1 %) et laver ensuite avec 2 mL de solution 1 PBS X. Empêcher les cellules de séchage en gardant l’échantillon dans 2 mL de solution 1 PBS X lors de l’acquisition de l’image.

3. Acquisition d’images par immunofluorescence

Remarque : la méthode suivante peut être utilisée avec n’importe quel système d’imagerie confocale commercialement disponible.

1. Déterminer le cas échéant les paramètres pour chaque fluorophore pour maximiser la plage dynamique pour la quantification.
   NOTE : Quantification représentative ne peut être obtenue que si la saturation des pixels est évitée et le seuil de signal est correctement réglé. Ces réglages peuvent être atteints en ajustant soigneusement la puissance du laser, haute tension (HT), le gain, et l’offset. Facteur
   1. régler le zoom (5 X) et le nombre de pixels (512 x 512) afin d’optimiser la taille en pixels.
      Remarque : Cela devrait être au moins 2.3 - fois plus petite que la résolution optique, selon le théorème de Nyquist.
   2. Diminuer la vitesse de balayage (12.5-20 µs/pixel) et utiliser une moyenne (2 - 3 fois) pour améliorer le rapport signal-bruit selon les paramètres mentionnés ci-dessus.
2. Manuellement déterminer approprié haut et en bas des plans focaux le long de l’axe z avec la taille de palier optimale (0,4 µm/tranche).
   Remarque : Le plan étagé taille est déterminé par la résolution axiale divisée par 2.3, selon le théorème de Nyquist. En règle générale, 20-25 couches sont nécessaires pour couvrir la profondeur de la cellule entière de cellules adhérentes.
3. Acquérir une image confocale d’une cellule unique entière avec un objectif à immersion d’huile X Plan Apo 60 (ouverture numérique 1,42).

4. Par immunofluorescence Image Quantification

1. détermination d’enrichissement.
   1. Ouvrir une image correspondant à la couche de z-plane d’intérêt depuis le fichier de données de cellule acquise en utilisant le logiciel ImageJ (freeware disponible à http://fiji.sc).
   2. Tracer une ligne à l’aide de l’outil de ligne de démarcation (barre d’outils → droites) à travers les régions de la cellule où la quantification est souhaitée. Modifier la largeur de la ligne en double-cliquant sur " droite ; " les valeurs d’intensité seront en moyenne à travers la largeur de la ligne (fixé à 8 dans la Figure 3).
      Remarque : Une ligne plus fine est préférable pour éviter les chevauchements de signal de différentes structures.
   Profil de
   3. après que la ligne est correctement réglée, la densité du signal le long de l’axe déterminé (barre de menu → Analyze → tracer le profil).
      Remarque : Une nouvelle fenêtre s’ouvre qui affiche un profil correspondant à l’intensité du signal pour chaque pixel du canal sélectionné (fluorophore spécifique) le long de la ligne de la section sélectionnée du plan z.
      1. Répéter le processus pour chaque canal correspondant à la molécule utilisée (c'est-à-dire, une quantification pour 488, une pour 568 et 405).
         Remarque : La valeur d’intensité de signal sera toujours ordonnée suivant l’orientation de la ligne tracée.
   4. Pour obtenir les valeurs de gris-mise à l’échelle numériques de chaque pixel du profil correspondant à des analyses quantitatives du calque sélectionné plan z, copiez les données de profil (barre de menu dans la fenêtre d’image → copie) et collez-le dans n’importe quel tableur.
   4.1.1-4.1.4
   5. répéter les étapes pour chaque section de z-plane de l’image confocale acquise et chaque canal où la quantification est souhaitée.
      Remarque : La quantification des différentes couches de z-plane peut être mis en commun afin d’obtenir une évaluation générale de l’enrichissement spécial du signal en calculant la valeur de la somme de chaque pixel le long de la ligne pour chaque couche de plan z. Ce type de regroupement ne peut être atteint que si le tracé est identique pour chaque couche de plan z inclus dans les valeurs moyennes relevées.
   6. Comme une méthode alternative pour la quantification des cellules entières de canaux différents, avec un grand nombre de couches, utilisez la macro appelée StackprofileData (voir le Fichier supplémentaire).
      Remarque : Cette macro est accessible librement à https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt et peut être utilisée comme suit :
      1. coller la macro dans un fichier texte et enregistrez it.
      2. Ouvrir le fichier image qui comprend l’ensemble des couches de la cellule confocale.
      3. Tracer une ligne, comme indiqué au point 4.1.2, ouvrez une nouvelle fenêtre pour importer la macro (barre de menu → Plugins → Macros → Run), choisissez le fichier texte enregistré précédemment correspondant à la macro StackprofileData, puis cliquez sur " ouvert. "
         Remarque : Après l’importation de macro, une nouvelle fenêtre nommée " résultats " s’ouvrira et toutes la quantification sur l’axe déterminé seront affiché pour chaque couche de plan z et canal présents dans les fichiers image.
      4. Copier les données pour chaque canal (barre de menu → modifier → copie) pour obtenir la représentation graphique profil correspondant à des analyses quantitatives de signal. Collez-le dans n’importe quel tableur. Calculer la valeur de la somme de chaque canal pour chaque pixel le long de la ligne pour chaque couche de plan z. Utilisez ces valeurs pour créer une représentation graphique similaire à celle présentée dans la Figure 3.
2. Quantification du signal dans une zone désignée de cellulaire ou volume.
   1. Ouvrir le fichier image avec logiciel ImageJ.
   2. Tracer une zone pour indiquer la zone d’intérêt en utilisant la fonction de la forme géométrique (barre d’outils → " rectangle, " " ovale, " ou " polygone ").
      Remarque : La valeur de quantification sera déterminée pour la zone correspondant à la forme dessinée.
   3. Régler le niveau de seuil afin d’éviter tout signal de fond (barre de menu → ajustement d’Image → seuil) ; une nouvelle fenêtre s’affiche pour représenter les intensités de pixels sous forme d’histogramme. Modifiez les valeurs pour inclure/exclure des pixels dans la quantification à l’aide du curseur. Sélectionnez un seuil qui élimine les pixels rouges à l’extérieur de la cellule, comme pixels surlignés en rouge seront incluses dans la quantification.
   4. Définir les paramètres de mesure pour quantifier le signal de pixels dans la zone sélectionnée, sans signal de fond (barre de menu → Analyze → définir des mesures) et assurez-vous de vérifier la " jusqu’au seuil de " et le " densité intégrée " boîtes.
   5. Mesurer les valeurs quantitatives pour la zone sélectionnée (barre de menu → Analyze → mesure).
      NOTE : Quantification intensité de Signal sera présentée dans une nouvelle fenêtre sous le " IntDen " identification, ce qui représente le produit des valeurs de gris moyens et le nombre de pixels dans la zone sélectionnée.
   6. Tracer une zone qui comprend toute la cellule à l’aide d’une forme géométrique (barre d’outils → " rectangle, " " ovale, " ou " polygone ") et de procéder à des mesures 4.2.3-4.2.5 afin d’obtenir une valeur correspondant au signal total. Calculer le rapport du signal au sein de la zone sélectionnée sur le signal entier pour obtenir le pourcentage du niveau du signal dans la zone d’intérêt.
   7. 4.2.2-4.2.6 mesures répétées pour obtenir la quantification du volume des cellules pour chaque plan z. S’adapter à la forme géométrique suff.
   8. Copier/coller les données obtenues de la " des résultats " windows pour chaque couche de z-plane dans un tableur pour schéma explicatif et de trouver une valeur moyenne.

Résultats

Pour précisément observer les événements de traduction à l’aide d’incorporation de la puromycine, il est essentiel de déterminer les conditions optimales pour chaque lignée cellulaire car chacun montre différents puromycine incorporation cinétique (Figure 1)^{9,11 ,12,18}. Par conséquent, afin de valider l’incorporatio...

Discussion

Les progrès technologiques récents ont permis une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans l’upregulation translationnelle ou la répression d’ARNm spécifiques dans des processus biologiques, tels que le développement neuronal, la réaction aux médicaments et la métastase. La méthodologie économique décrite ici permet aux événements de traduction à visualiser dans les cellules afin d’étudier comment les protéines de liaison à l’ARN régulent les processus métastatiques, tels que l?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	wisent	319-005-CL
Trypsine	wisent	325-043 EL
FBS	Thermo Fisher Scientific	12483020
Puroycin antibody 12D10	EMD millipore	MABE343	western blot dilution 1:25,000 Immunofluoresence dilution 1:10,000
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	cell signaling technology	7076	western blot dilution 1:8,000
Western Lightning Plus-ECL	Perkin Elmer	NEL104001EA
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate)	cell signaling technology	4408	immunofluoresecence dilution 1:400
CF568 Phalloidin	biotium	00044	immunofluoresecence dilution 1:400
Cyclohexmide	Sigma	C1988-1G	50µg/ml final concentration
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	final concentration 1µg/ml
Puromycin	bio-Basic	PJ593	2.5µg/ml to 10µg/ml
Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat	Ibidi	81156
MRC-5 cells	ATCC	CCL-171
HeLa cells	ATCC	CCL-2
Huh-7 cells	from Dr. Mazroui (Université Laval)
Fv1000	olympus		confocal imaging system
Fiji software			http://fiji.sc
PBS (Phosphate BuffeRed Saline)	bio-Basic	PD8117
Formaldehyde 37% Solution	bio-Basic	C5300-1
Triton X-100	bio-Basic	TB0198
BSA	Fisher Bioreagents	BP9702-100
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500