Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

Özet

Bu el yazması görselleştirmek ve hücre altı bölmeleri olaylarda yerelleştirilmiş çeviri ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu el yazması önerilen yaklaşım temel confocal görüntüleme sistemi ve Kimyasalları gerektirir ve hızlı ve düşük maliyetlidir.

Özet

MRNA çeviri düzenleyen mekanizmalar mikrop çizgi geliştirme, hücre farklılaşma ve organogenesis, gibi çeşitli biyolojik süreçlerin yanı sıra birden çok hastalıklar söz konusu. Çok sayıda yayın inandırıcı belirli mekanizmaları sıkıca mRNA çeviri düzenleyici göstermiştir. Çeviri kaynaklı protein ifade Yönetmeliği artan ilgi çalışma ve de novo protein sentezi cellulo içindetakip roman yöntemleri gelişmesine neden olmuştur. Ancak, bu yöntemlerin çoğu pahalı yapım onları ve kez okudu olabilir mRNA hedef sayısını sınırlama, karmaşıktır. Bu makale yalnızca temel reaktifler ve ölçmek ve herhangi bir hücre satırında çeşitli koşullarda oluşan değişiklikleri mRNA çeviri görselleştirmek için bir confocal floresan görüntüleme sistemi gerektirir bir yöntem öneriyor. Bu yöntem son zamanlarda zaman böylece biyolojik çeşitli sırasında kısa bir süre için de novo çeviri görselleştirme imkanı sunan, kısa bir süre içinde yapışık hücreleri hücre altı yapıları yerelleştirilmiş çevirisini göstermek için kullanılan işlemler veya değişiklik translasyonel faaliyet belirli uyaranlara yanıt olarak doğrulanması.

Giriş

Farklı hücresel işlevler tarafından çeviri Yönetmeliği yeni araçlar ve mRNA çeviri ve düzenlenmiş protein sentezi^{1,2 hücre altı lokalizasyonu belirlemek için yöntemler geliştirmek için birçok araştırma ekipleri yol açtı ,3,4}. Bu son teknolojik gelişmeleri içeren çeviri upregulation veya belirli mRNA'ların baskı nöronal gelişim, uyuşturucu karşılığı ve metastaz^{5 gibi biyolojik süreçler sırasında mekanizmaları gelişmiş bir anlayış için izin ver ,6,7,8}. Ancak, bu yöntemlerin çoğu pahalı veya tehlikeli Kimyasalları ve çoğu laboratuvarları kullanılabilir olmayabilir belirli donanımları gerektirir. Bu nedenle, özellikle bu olası sorunları aşmak için çeviri olaylar hızlı değerlendirmesi için izin vermek için uygun maliyetli bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntem belirli hücresel süreçler sırasında ortaya çıkan akut translasyonel modülasyon algılar ve ayrıca confocal mikroskobu kullanarak Çeviri Yerelleştirme için sağlar.

Yöntem tanımlamak burada yerelleştirilmiş çeviri Yayilim başlatma merkezleri (SIC)⁵denilen hücre altı bölmeleri içinde izlemek için kullanılmıştır. SICs yeni doğmakta olan yapışma kompleksleri üzerine yerelleştirilmiş numaralı seribaşı hücrelerde bulunan geçici yapılar vardır. SICs ve yapışma kompleksler farklı olmakla birlikte, onların kaderi yakından bağlantılıdır. Gerçekten de, SICs giderek odak yapışma karmaşık olgunlaşma bir yapışma siteye yapışma başlangıç aşamasında ortadan olduğu bilinmektedir. Bulduk RNA bağlanıcı proteinler özellikle mRNA çeviri (Örneğin, Sam68, FMRP ve G3BP1) kontrol etmek için bilinen ve RNA'ların bunlar içinde zenginleştirilmiş poliadenile yapıları⁵. Burada açıklanan yöntemleri kullanarak, SIC ilişkili mRNA çeviri bir denetim noktası olanak verecek şekilde davranır düzenlenmesi hücre adezyon birleştirilecek hücreler seribaşı gösterdi. Bu yöntemi, puromisindir birleşme göre yüzey çeviri tahlil (SunSET) algılama adapte bir sürüm düşünülebilir. Aslında sigara radioactively etiketli bir amino asit kullanarak küresel protein sentezi oranları ölçmek için geliştirilmiş, protein puromycilation de novo protein sentezi⁹görselleştirmek için etkili bir yol sunar. Bu yöntem puromisindir, çeviri erken zinciri fesih ribozom¹⁰üzerinden engeller bir antibiyotik iç davranışını kullanır. Gerçekten de, puromisindir yapısal olarak tyrosyl-tRNA, peptid zincirleri bir peptit bağı oluşumu ile elongating içine şirketler için sağlar benzerdir. Ancak, puromisindir bağlama büyüyen bir peptit zincirine yeni bir peptit bağı puromisindir tRNA içinde bulunan hydrolysable ester bağı yerine hydrolysable Amid bağı olduğundan sonraki aminoasil tRNA ile oluşturulmaktadır engeller. Böylece, erken sürümü ile aktif olarak çevrilmiş mRNA^9,11' e^{,12 karşılık gelen çok sayıda kesilmiş puromycilated polipeptitler polipeptitler elongating içine puromisindir birleşmesiyle sonuçları} .

Bu yöntemi kullanarak, kısa sürede dul içinde aktif çeviri değerlendirmek mümkün (Örneğin, 5 min) hücresel yapışma antibiyotik ile 5 dk süre takviye hücrelerde puromisindir karşı spesifik bir antikor kullanarak sırasında hücre adezyon sırasında farklı zaman noktalarda⁵işlem. Çok özel antikorlar karşı puromycilated yan yönettiği bu tahlil duyarlığını güvenmektedir. Puromycilated polipeptid immünfloresan tespiti de confocal görüntüleme sistemleri kullanarak büyük bir hassasiyetle sayısal yeni çevrilmiş mRNA genel hücre altı yeniden bölümlenir sağlar.

Bu nedenle, bu yöntem çok sayıda translasyonel düzenleyici mekanizmaları nöronal granülasyon^6,13,14, gibi süreçleri dahil eğitim laboratuvarları için ilgili bir seçenek sunar ¹⁵, morphogen mRNA Yerelleştirme ve çeviri sırasında geliştirme^16,17. Ayrıca hızlı biyolojik olaylarda, hücre göç, yapışma veya işgal gibi veya sadece translasyonel değişiklikleri^5, neden ilaç tedavileri değerlendirmek için yerelleştirilmiş veya bölümlere çeviri eğitimi için de uygun olduğu ^{7 , 18}. genel olarak, bu yöntem, hızlı, hassas ve düşük maliyetli bir şekilde yerelleştirilmiş veya kontrollü çeviri olaylar görselleştirme için sağlar.

Protokol

1. Puromycilation koşullar belirlenmesi

Not: Bu teknik MRC-5 hücre adezyon işlemi ⁵ sırasında yerelleştirilmiş çeviri değerlendirmek için kullanılan yöntemi tanımlar. Puromycilation herhangi bir hücreyi yapılabilir gibi bu tedavi koşulları açısından puromisindir konsantrasyon ve istenen her hücre satırı için özdeş değil çünkü puromycilation koşulları kullanılmak üzere belirli hücre hatları için optimize etmek önemlidir kuluçka süresi. Bu koşullar nasıl tanımlandığını göstermek için üç örnek hücre hatları (Yani, HeLa, MRC-5 ve ha-7) için farklı kuluçka süreleri puromisindir konsantrasyonları artan ile tedavi edildi ( Resim 1).

1. Grow uygun 0.5 ml 24-şey plaka hücrelerde aynı sayıda kültür orta test önce 16 h tamamlayın. Tohum 30.000 MRC-5 hücre, 50.000 HeLa hücreleri veya iyi başına 50.000 ha-7 hücre. % 60-70 izdiham (şekil 1A) aşmasını önlemek emin olun.
2. Puromisindir (0, 5, 10, 15, 20 ve 30 µg/mL) konsantrasyonları artan tam hücre kültür ortamının 1,5 mL ile hazırlamak 6 tüpleri. Önceden sıcak 37 ° C'de
3. Puromisindir orta (hazırlanan adım 1.2), her toplama aktarmak için 0.5 mL her 6 yeni tüpler içine tüp ve sikloheksimit 50 µg/mL nihai bir konsantrasyon tüm 6 yeni tüpler için ekleyin. Önceden sıcak 37 ° C'de
4. Orta 0.5 mL tam kültür ortamının (satır 1 ve 2) ile değiştirin. İçin üçüncü satır, 0.5 mL 50 µg/mL ile sikloheksimit ( şekil 1B) takıma tam kültür ortamının ekleyin.
   Not: Sikloheksimit tedavi için protein puromycilation çeviri uzama engellemek için onun yetenek nedeniyle en iyi negatif kontrol olarak kurulmuştur. Puromisindir birleşme çeviri uzamasını gerektirdiği için sikloheksimit tedavi puromycilated protein sinyalleri ^{5 , 18} bir kaybına neden.
5. 15dk 37 ° C'de (%5 CO ₂) için kuluçkaya.
6. 0,5 mL 0, 2.5, 5, 7.5, 10 ve 15 µg/mL, son konsantrasyonları sırasıyla A, B, C, D, E ve F. sütunlarda elde etmek için ikinci sırada 1.2. adımda hazırlanan puromisindir orta ekleyin Aynı zamanda, üçüncü sıradaki ( şekil 1 c) sikloheksimit takıma orta (Adım 1.3) puromisindir 0.5 mL ekleyin.
7. 37 ° C'de (%5 CO ₂) 5 min için kuluçkaya.
8. 0.0, 2.5, 5, 7.5, 10 ve 15 µg/mL ( şekil 1 c) son konsantrasyonları elde etmek için ilk satırı 1.2. adımda hazırlanan puromisindir Orta 0.5 mL ekleyin.
9. 37 ° C'de (%5 CO ₂) 5 min için kuluçkaya.
10. Yıkama her de fosfat tamponlu 1-3 1 mL olan satırları buz gibi 1 X serum fizyolojik (PBS) 5 dk sonra eklenmesi için ilk satır (iki kez yıkama) kuyu puromisindir, dan. 1 X Laemmli arabelleği 75 µL ekleyin (%4 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), % 4 2-mercaptoethanol, 0.120 M Tris HCl pH 6.8, %0,004 bromophenol mavi ve % 10 gliserol) bütün hücreli lysates her koşul için elde etmek için.
11. Çalıştır % 10 SDS-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) puromisindir birleşme değerlendirmek için 1/3 hazır örnekleri kullanarak.
    1. Belirleme birincil antikor kuluçka arabellek (%2 sığır serum albumin (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4 ve %0.01 1:25,000 oranında sulandırılmış bir anti-puromisindir antikor (12 D 10) kullanarak Western blot analizi tarafından puromisindir şirketleşme düzeyi Sodyum azid).
       Not: Resim 2 örnek olarak temsili Resim 1. adımda açıklandığı gibi yapılan farklı hücre satırı özleri karşılık gelen gösterilir.

2. Cellulo içinde Çeviri görselleştirme lokalize

Not: Burada açıklanan tekniği SICs MRC-5 hücrelerdeki içinde yerelleştirilmiş çeviri sırasında yapışma işlemi ⁵ değerlendirmek için kullanıldı. MRC-5 hücreleri burada kullanılmasına rağmen diğer hücre hatları 2.1. adımda açıklanan aynı metodolojisi ile kullanılabilir.

1. Hücre hazırlık.
   1. Ayırmak MRC-5 hücrelerin % 0.25 tripsin/2.21 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) Hank kullanarak ' s dengeli tuz çözüm (HBSS). Santrifüjü (200 x g de 5 dk) 15 mL konik santrifüj tüpü içinde tarafından hücreleri cips ve onları Dulbecco içinde askıya ' s sayım odası ile sayım sonra % 10 fetal sığır serum (FBS) 40.000 hücre/mL, ile takıma modifiye kartal orta (DMEM).
   2. Süspansiyon korumak için bir tüp rotator 20 dk için kullanarak nazik döndürme altında 37 ° C'de askıya alınan hücreler kuluçkaya.
      Not: Bu odak yapışma kompleksleri tam ayrılma için izin vermek için kritik bir adımdır.
   3. Askıya alınmış MRC-5 (40.000 hücre/mL) hücrelerde iki 35-mm cam alt tabak tabak 2 mL. İlk 35-mm cam alt çanak puromycilation tahlil için kullanın (bkz. Adım 2.1.5) ve ikinci bir negatif kontrol kullanın (bkz. Adım 2.1.6).
   4. Hücreleri hücre adezyon ve SIC oluşumu için izin vermek 55 dk. 37 ° C'de (%5 CO ₂) tutmak.
   5. Ekle puromisindir orta önceden tanımlanmış 1 bölümünde konsantrasyon kullanarak 35-mm cam alt yemekleri (tahlil). MRC-5 hücreleri tedavi etmek için 10 µg/mL puromisindir 37 ° C'de (%5 CO ₂) 5 min için kullanın.
   6. Bir negatif kontrol sikloheksimit ikinci 35-mm cam alt çanak 40dakika hücreleri onları önceden 50 µg/mL sikloheksimit ( şekil 2B) ile tedavi etmek için tohum sonra ekleyin. Sonra sikloheksimit ek olarak sonra 15 dk ekleyin puromisindir aynı konsantrasyonu kuluçka bu kez adım 2.1.5 (Örneğin, kullanım 10 µg/mL puromisindir 37 ° c (%5 CO ₂) MRC-5 için 5 min için) gibi orta.
   7. Yıkama her plakalı iki kez buz gibi 2 mL 1 X PBS hücreleri ile ve 1 mL (1 X PBS içinde seyreltilmiş) % 4 formaldehit 15 dakika oda sıcaklığında (RT) düzeltin.
      Dikkat: Paraformaldehyde kesinlikle kimyasal bir mahallede kullanılmalıdır.
2. Immunostaining.
   1. Pimlerle yapılan fiksasyon ardından paraformaldehyde, yıkama ile üç kez 2 mL 1 X PBS ve PBS-TritonX-100 (% 0.5) 500 µL içinde 20 dk RT hücreleri permeabilize az için kuluçkaya.
   2. Spesifik olmayan antikor bağlama önlemek için 500 µL PBS ile örnek blok – BSA (% 1) için dik, 20 dk
   3. PBS-Tween20 (% 0,1) 2 mL ile üç kez yıkayın ve 1 X PBS RT. 1 h için anti-puromisindir antikor (12 D 10) seyreltilmiş 1:12,500 300 µL ile kuluçkaya
   4. Yıkama PBS-Tween20 (% 0,1) 2 mL ile 3 kez ve anti-fare IgG Birleşik bir fluorophore 300 µL ile kuluçkaya (burada, 488 nm) puromycilated polipeptitler görselleştirmek için PBS ve phalloidin Birleşik ile seyreltilmiş başka bir fluorophore için (burada, 555 nm) F-aktin görselleştirmek için. Dik, 1 h için kuluçkaya
   5. Yıkama PBS-Tween20 (% 0,1) 2 mL ile üç kez ve daha sonra 5 1 µg/mL ile 4 takıma min için RT, içinde 300 µL PBS-Tween20 (% 0,1), kuluçkaya ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
   6. 2 mL PBS-Tween20 (% 0,1) ile üç kez yıkayın ve 2 mL 1 X PBS ile yıkayın. Hücreleri örnek 2 mL 1 X PBS resim alma sırasında tutarak kurumasını önlemek.

3. İmmünfloresan resim alma

Not: aşağıdaki metodoloji-ebilmek var olmak kullanılmış ile piyasada bulunan herhangi bir confocal görüntüleme sistemi.

Miktar için dinamik alanı en üst düzeye çıkarmak için

1. belirleme uygun ayarları için her fluorophore.
   Not: Temsilcisi miktar yalnızca piksel doygunluk kaçınılması ve sinyal eşik düzgün ayarlanır elde edilebilir. Bu ayarları, dikkatle lazer gücü, yüksek voltaj, ayarlayarak elde kazanç, ve ofset.
   1. Ayarlama yakınlaştırma faktörü (5 X) ve piksel boyutunu optimize etmek için piksel (512 x 512).
      Not: Bu Nyquist teoremi göre optik çözünürlük, en azından 2,3 - kat daha küçük olmalıdır.
   2. İnceden inceye gözden geçirmek hız (12,5-20 µs/piksel) azaltmak ve yukarıda belirtilen ayarlara göre sinyal-gürültü oranı artırmak için (2 - 3 kez) ortalama kullanın.
2. El ile uygun üst belirlemek ve odak uçaklar en uygun adım boyu (0.4 µm/dilim) ile z ekseni boyunca alt.
   Not: Adım boyutu uçak 2.3 tarafından bölünmüş Aksiyel çözünürlük Nyquist teoremi göre belirlenir. Genellikle 20-25 katmanları yapışık hücreleri tüm hücre derinliği karşılamak gereklidir.
3. Tüm bir tek hücre bir 60 X Apo planı yağı daldırma hedefi (1,42 sayısal diyafram) ile confocal bir görüntüsünü elde.

4. İmmünfloresan görüntü miktar

1. zenginleştirme belirlenmesi.
   1. ImageJ yazılım (freeware http://fiji.sc kullanılabilir) kullanarak alınan hücre veri dosyasından faiz z-uçak katmanına karşılık gelen bir görüntüyü açmak.
   2. Çizgi çizme aracını kullanarak çizgi çizin (araç çubuğu → düz) nerede miktar isteniyorsa hücre bölgelerinde aracılığıyla. Üzerinde çift tıklatarak çizgi genişliğini değiştirmek " düz; " yoğunluk değerleri (8 şekil 3 ' de ayarla) çizginin genişliğini üzerinden ortalama olarak.
      Not: Daha ince bir çizgi sinyal örtüşme farklı yapılardan önlemek için tercih edilir.
   Yolun doğru şekilde ayarladıktan sonra
   3. profil kararlı eksen boyunca sinyal yoğunluğu (menü çubuğu → analiz → arsa profil).
      Not: Seçili z-uçak bölümü için hattı boyunca sinyal yoğunluğu (özel fluorophore) seçilen kanalın her piksel için karşılık gelen bir profili gösteren yeni bir pencere açılacaktır.
      1. Tekrar işlem için kullanılan fluorophore karşılık gelen her kanal (Yani, bir miktar için 488, 568 ve 405 için bir tane).
         Not: Sinyal yoğunluk değeri her zaman çizilmiş çizgiyi yönünü takip sıralanır.
   4. Gri ölçekli sayısal değerler seçili z-uçak katman quantifications için karşılık gelen profil her piksel için elde etmek için profil verileri kopyalayın (Görüntü penceresinin menü çubuğundan → kopya) ve herhangi bir elektronik tablo yazılımı yapıştırın.
   Confocal elde edilen görüntünün her z-uçak bölüm ve miktar istendiği nerede her kanal için
   5. Yinele adımları 4.1.1-4.1.4.
      Not: Farklı z-uçak katmanları miktar toplam değeri her z-uçak katman hattı boyunca her pikselin hesaplayarak sinyal özel zenginleştirme genel bir değerlendirmesini elde etmek için havuza alınmış. Çizilen çizgi ortalama değerlerde dahil her z-uçak katman aynı ise bu tür havuz sadece elde edilebilir.
   6. Farklı kanalları çok sayıda Katmanlar ile bütün hücreli miktar için alternatif bir yöntem, StackprofileData olarak adlandırılan makroyu kullanmak (bkz. Ek dosya).
      Not: Bu makro https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt serbestçe erişilebilir ve aşağıdaki gibi kullanılabilir:
      1. makro bir metin dosyasına yapıştırın ve bunu kaydedin
      2. Hücre confocal katmanları içerir görüntü dosyasını açın.
      3. Bir çizgi çizin, 4.1.2. adımda açıklandığı gibi makro almak için yeni bir pencere açın (menü çubuğu → eklentileri → makroları → çalıştırmak), StackprofileData makro karşılık gelen önceden kaydettiğiniz metin dosyasını seçin ve tıklatın " açık. "
         Not: makro ithalat, yeni bir pencere adlı " sonuçları "-ecek açık ve tüm miktar kararlı eksen boyunca her z-uçak katmanı için listelenen ve resim dosyalarında mevcut kanal.
      4. Her kanal için veri kopyala (menü çubuğu → düzenleme → kopya) sinyal quantifications karşılık gelen grafik profili temsil elde etmek için. Herhangi bir elektronik tablo yazılımı yapıştırın. Her kanal boyunca her z-uçak katmanı için yolun her piksel için toplam değerini hesaplamak. Grafik şekil 3 ' te sunulan benzer oluşturmak için bu değerleri kullanın.
2. Sinyal belirlenmiş hücresel alanda veya birim miktar.
   1. ImageJ yazılımı ile belgili tanımlık imge eğe açık.
   2. Çizmek geometrik form işlevini kullanarak ilgi alanı belirtmek için bir alan (araç çubuğu → " dikdörtgen, " " oval, " veya " çokgen ").
      Not: Çizilmiş forma karşılık gelen alan için miktar değeri belirlenecektir.
   3. Herhangi bir arka plan sinyal önlemek için eşik düzeyi ayarlamak (menü çubuğu → görüntü ayarı → eşik); piksel yoğunluklarda çubuk grafik formunda temsil etmek için yeni bir pencere açılacaktır. Kaydırıcıyı kullanarak miktar piksellerindeki içerme/dışlama üzere değerleri değiştirin. Kırmızı renkte piksel miktar dahil olarak, hücre dışında kalan kırmızı pikseller ortadan kaldıran bir eşik seçin.
   4. Arka plan sinyal olmadan seçili alanı içinde piksel sinyal ölçmek için ölçü parametrelerini tanımlamak (menü çubuğu → analiz → ayarla ölçümleri) ve kontrol etmek emin olun " Eşik sınırı " ve " entegre yoğunluk " kutuları.
   5. Seçili alan için sayısal değerleri ölçmek (menü çubuğu → analiz → ölçü birimi).
      Not: Sinyal şiddeti miktar-ecek sunulmak altında yeni bir pencerede " IntDen " ürün ortalama gri değerleri ve seçili alanı içinde piksel sayısını temsil eden kimlik.
   6. Çizmek geometrik formu kullanarak hücrenin tamamını içeren bir alanı (araç çubuğu → " dikdörtgen, " " oval, " veya " çokgen ") ve toplam sinyal için karşılık gelen bir değer elde etmek için adımlar 4.2.3-4.2.5 ile devam edin. İlgi alanı içinde sinyal yüzde elde etmek için tüm sinyal üzerinde seçili alanı içinde sinyal oranını hesaplamak.
   7. Miktar her z-uçak için hücre hacmi elde etmek için Yinele adımları 4.2.2-4.2.6. Geometrik formu gerektiği gibi uyum.
   8. Kopyala/Yapıştır üzerinden elde edilen veriler " sonuçları " windows için grafik tasvir ve ortalama bir değer bulmak için bir elektronik tabloya her z-uçak katmanı için.

Sonuçlar

Doğru bir şekilde puromisindir birleşme kullanarak çeviri olayları gözlemlemek için her farklı puromisindir birleşme Kinetik (şekil 1)^{9,11 gösterir çünkü her hücre satırı için en uygun koşulları belirlemek için önemlidir ,12,18}. Bu nedenle, puromisindir birleşme doğrulamak için istenen hücre kültürünü ...

Tartışmalar

Son teknolojik gelişmeler mekanizmaları translasyonel upregulation ilgili daha iyi bir anlayış ya da nöronal gelişim, uyuşturucu karşılığı ve metastaz gibi biyolojik süreçleri içinde belirli mRNA'ların baskı için izin vermiş. Burada açıklanan düşük maliyetli metodoloji nasıl RNA bağlanıcı proteinler hücre adezyon, geçiş ve işgali gibi metastatik işlemleri düzenleyen çalışma hücrelerdeki görüntülenmeyecektir çeviri olayları sağlar.

De novo pr...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	wisent	319-005-CL
Trypsine	wisent	325-043 EL
FBS	Thermo Fisher Scientific	12483020
Puroycin antibody 12D10	EMD millipore	MABE343	western blot dilution 1:25,000 Immunofluoresence dilution 1:10,000
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	cell signaling technology	7076	western blot dilution 1:8,000
Western Lightning Plus-ECL	Perkin Elmer	NEL104001EA
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate)	cell signaling technology	4408	immunofluoresecence dilution 1:400
CF568 Phalloidin	biotium	00044	immunofluoresecence dilution 1:400
Cyclohexmide	Sigma	C1988-1G	50µg/ml final concentration
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	final concentration 1µg/ml
Puromycin	bio-Basic	PJ593	2.5µg/ml to 10µg/ml
Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat	Ibidi	81156
MRC-5 cells	ATCC	CCL-171
HeLa cells	ATCC	CCL-2
Huh-7 cells	from Dr. Mazroui (Université Laval)
Fv1000	olympus		confocal imaging system
Fiji software			http://fiji.sc
PBS (Phosphate BuffeRed Saline)	bio-Basic	PD8117
Formaldehyde 37% Solution	bio-Basic	C5300-1
Triton X-100	bio-Basic	TB0198
BSA	Fisher Bioreagents	BP9702-100
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500