La inmunofluorescencia cuantitativa a medida Global localizada traducción

Resumen

Este manuscrito describe un método para visualizar y cuantificar eventos traducción localizada en compartimientos subcelulares. El enfoque propuesto en este manuscrito requiere un sistema de proyección de imagen confocal básico y reactivos y es rápida y rentable.

Resumen

Los mecanismos de regulación de la traducción del mRNA están implicados en varios procesos biológicos, como el desarrollo de líneas germinales, diferenciación celular y organogénesis, así como en múltiples enfermedades. Numerosas publicaciones han demostrado convincentemente que mecanismos específicos bien regulan la traducción del mRNA. Creciente interés en la regulación inducida por la traducción de la expresión de la proteína ha llevado al desarrollo de nuevos métodos para estudiar y seguir de nuevo proteína síntesis de cellulo. Sin embargo, la mayoría de estos métodos es compleja, haciéndolos costosos y a menudo limitar el número de objetivos de mRNA que pueden estudiarse. Este manuscrito propone un método que requiere sólo reactivos básicos y un sistema de imagen confocal de la fluorescencia para medir y visualizar los cambios en la traducción de ARNm que se producen en cualquier línea celular en diversas condiciones. Este método fue utilizado recientemente para mostrar traducción localizada en las estructuras subcelulares de las células adherentes durante un período corto de tiempo, ofreciendo así la posibilidad de visualizar traducción de novo durante un corto período durante una variedad de biológico procesos o de validar cambios en actividad traslacional en respuesta a estímulos específicos.

Introducción

La regulación de la traducción de diversas funciones celulares ha llevado a muchos equipos de investigación para desarrollar nuevas herramientas y métodos para determinar la localización subcelular de la traducción del mRNA y proteína regulada síntesis^{1,2 ,3,4}. Estos avances tecnológicos recientes permiten una mejor comprensión de los mecanismos que implican el upregulation de la traducción o la represión de los mRNAs específicos durante los procesos biológicos, como el desarrollo neuronal, la respuesta de la droga y metástasis^{5 ,6,7,8}. Sin embargo, la mayoría de estos métodos requieren reactivos caros o peligrosos y equipamiento específico que podría no estar disponible para la mayoría de los laboratorios. Como tal, fue desarrollado un método rentable para permitir la evaluación rápida de los eventos de traducción para específicamente evitar estos posibles problemas. Este método detecta agudas modulaciones traslacionales que se producen durante procesos celulares específicos y también permite la localización de la traducción usando microscopia confocal.

Se utilizaron los métodos descritos aquí para supervisar la traducción localizada dentro de compartimentos subcelulares llamado difusión de centros (SIC) de iniciación⁵. SICs son estructuras transitorias encontradas células sembradas que se localizan encima de los complejos de adhesión naciente. Aunque SICs y complejos de adhesión son distintos, sus destinos están íntimamente ligados. De hecho, SICs conocen a desaparecer poco a poco sobre maduración complejos de adhesión focal en un sitio de adherencia durante la fase inicial de adhesión. Hemos encontrado que las proteínas de unión de ARN conocidas para controlar específicamente la traducción del mRNA (p. ej., Sam68, FMRP y G3BP1) y cofia RNAs fueron enriquecidos dentro de estas estructuras⁵. Utilizando los métodos descritos aquí, demostramos que la regulación del mRNA SIC asociados traducción actúa como un punto de control que permite sembrar células para consolidar la adhesión celular. Este método, basado en la incorporación de puromicina, podría considerarse una versión adaptada de la detección superficial de prueba de traducción (SunSET). Originalmente desarrollado para medir las tasas de síntesis de proteína global utilizando un aminoácido marcado no radiactivo, proteína puromycilation ofrece una manera eficiente para visualizar de novo de síntesis de proteínas⁹. Este método se basa en el comportamiento intrínseco de puromicina, un antibiótico que bloquea la traducción a través de terminación prematura de la cadena en el ribosoma¹⁰. De hecho, la puromicina es estructuralmente análogo a Tirosil-ARNt, que permite la incorporación en alargar las cadenas de péptido a través de la formación de un enlace peptídico. Sin embargo, Unión de puromicina a una cadena creciente del peptide impide que un nuevo enlace peptídico formándose con el aminoacil-tRNA siguiente, puesto que la puromicina tiene un enlace de amida no hidrolizable en vez del enlace de éster hidrolizable en tRNAs. Así, la incorporación de puromicina alarga polipéptidos resulta en la liberación prematura de numerosos polipéptidos puromycilated truncada correspondiente a mRNA activamente traducido^9,11,12 .

Usando este método, fue posible evaluar la traducción activa dentro de una viuda de corto plazo (por ejemplo, 5 minutos) durante la adhesión celular usando un anticuerpo específico contra puromicina en células que fueron complementados con el antibiótico durante períodos de 5 minutos en diferentes momentos durante la adhesión celular proceso⁵. La precisión de este ensayo se basa en anticuerpos altamente específicos dirigidos contra la molécula de puromycilated. Detección inmunofluorescente del polipéptido puromycilated proporciona una distribución subcelular general del mRNA recién traducida, que también se puede cuantificar con gran precisión utilizando sistemas de proyección de imagen confocales.

Por lo tanto, este método ofrece una opción relevante para un gran número de laboratorios estudio traslacionales mecanismos implicados en procesos como la granulación neuronal^{6,13,14, 15}, morfogen mRNA, traducción y localización durante el desarrollo de^16,17. También es idóneo para estudiar traducción localizada o compartimentada durante rápidos acontecimientos biológicos, como la migración celular, adherencia o invasión, o simplemente evaluar los tratamientos con fármacos que pueden inducir cambios traslacional^{5, 7 , 18}. en general, este método permite la visualización de eventos de traducción localizada o controlados de una manera rápida, precisa y rentable.

Protocolo

1. determinación de las condiciones de Puromycilation

Nota: esta técnica describe el método utilizado para evaluar la traducción localizada durante la MRC-5 adhesión celular proceso ⁵. Como puromycilation se puede hacer en cualquier celular, es importante optimizar las condiciones de puromycilation para las líneas celulares específicas a utilizar, porque las condiciones de tratamiento no son idénticas para cada línea celular en cuanto a la concentración de puromicina y deseado tiempo de incubación. Para mostrar cómo se definen estas condiciones, tres líneas de células de ejemplo (es decir, HeLa, MRC-5 y Huh-7) fueron tratadas con el aumento de las concentraciones de puromicina para tiempos de incubación diferentes ( figura 1).

1. Crecer idéntico número de células en un plato 24-well en 0,5 mL de la apropiada completa cultura medio 16 h antes de la prueba. Semilla de 30.000 células MRC-5, 50.000 células HeLa o 50.000 HuH-7 células por pocillo. Asegúrese de evitar superar la confluencia de 60-70% (figura 1A).
2. Preparar 6 tubos con 1,5 mL de medio de cultivo de célula completa con el aumento de las concentraciones de puromicina (0, 5, 10, 15, 20 y 30 μg/mL). Previamente caliente a 37 ° C.
3. Para cada concentración de medio de puromicina (preparado en el paso 1.2), transferir 0,5 mL de cada tubo en 6 nuevos tubos y añadir cicloheximida en una concentración final de 50 μg/mL a los 6 nuevos tubos. Previamente caliente a 37 ° C.
4. Cambiar el medio con 0,5 mL de medio de cultivo completo (fila 1 y 2). Para la tercera fila, agregar 0,5 mL de medio de cultivo completo suplementado con 50 μg/mL de cicloheximida ( figura 1B).
   Nota: Tratamiento de la cicloheximida se ha establecido como el mejor control negativo para proteína puromycilation debido a su capacidad para bloquear la elongación de la traducción. Debido a incorporación de puromicina requiere elongación de la traducción, cicloheximida tratamiento conduce a una pérdida de puromycilated proteína señales ^{5 , 18}.
5. Incubar por 15 min a 37 ° C (5% CO ₂).
6. Añadir 0,5 mL del medio de puromicina preparado en el paso 1.2 para la segunda fila para obtener concentraciones finales de 0, 2.5, 5, 7.5, 10 y 15 μg/mL, respectivamente, en las columnas A, B, C, D, E y f el. Al mismo tiempo, Añadir 0,5 mL de puromicina al medio suplementada con cicloheximida (paso 1.3) en la tercera fila ( figura 1).
7. Incubar 5 min a 37 ° C (5% CO ₂).
8. Añadir 0,5 mL del medio de puromicina preparado en el paso 1.2 a la primera fila para obtener concentraciones finales de 0.0, 2.5, 5, 7.5, 10 y 15 μg/mL ( figura 1).
9. Incubar 5 min a 37 ° C (5% CO ₂).
10. Lavar cada una de las filas 1 a 3 con 1 mL de helado 1 X tamponada fosfato solución salina (PBS) 5 min después de la adición de puromicina en los pocillos de la fila primera (colada dos veces). Añadir 75 μl de tampón de X Laemmli 1 (4% sodio dodecil sulfato (SDS), 4% 2-Mercaptoetanol, 0.120 M Tris HCl pH 6.8, 0.004% azul de bromofenol y un 10% de glicerol) para obtener Lisados celulares para cada condición de.
11. Carrera 10% electroforesis en gel SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) utilizando 1/3 de las muestras preparadas para evaluar la incorporación de puromicina.
    1. Determinar el nivel de incorporación de puromicina por análisis de Western blot utilizando un anticuerpo anti-puromicina (12 D 10) diluido en una proporción de 1: 25,000 en tampón de incubación del anticuerpo primario (2% albúmina de suero bovino (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7.4 y 0.01% azida de sodio).
       Nota: Imágenes representativas correspondientes a células diferentes extractos de línea como se describe en el paso 1 se muestran como ejemplos en la figura 2.

2. En Cellulo Localizada traducción de visualización

Nota: se utilizó la técnica descrita aquí para evaluar traducción localizada en SICs en células MRC-5 durante el proceso de adhesión ⁵. Aunque las células MRC-5 se usan aquí, pueden utilizarse otras líneas celulares con la misma metodología descrita en el paso 2.1.

1. Preparación de la célula.
   1. Separar MRC-5 células en 0.25% tripsina/2,21 mM ácido etilendiaminotetracético (EDTA) de Hank ' s solución sal balanceada (HBSS). Sedimenten las células por centrifugación (5 min a 200 x g) en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL y suspender en Dulbecco ' s medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con 10% suero fetal bovino (FBS) 40.000 células/ml después de contar con una cámara de conteo.
   2. Incubar las células suspendidas a 37 ° C bajo rotación suave usando un agitador de tubo por 20 min para mantener en suspensión.
      Nota: Este paso es vital para permitir la completa disociación de los complejos de adhesión focal.
   3. Placa 2 mL de suspensión células MRC-5 (40.000 células/mL) en dos platos de fondo de cristal de 35 mm. Utilice el primer plato de fondo de cristal de 35 mm para el ensayo de puromycilation (ver paso 2.1.5) y utilizar la segunda como un control negativo (ver paso 2.1.6).
   4. Mantener las células a 37 ° C (5% CO ₂) por 55 min permitir la adhesión celular y SIC formación.
   5. Puromicina agregar al medio en los platos de fondo de cristal de 35 mm (ensayo), utilizando la concentración previamente definida en la sección 1. Para el tratamiento de las células MRC-5, use 10 puromicina μg/mL durante 5 minutos a 37 ° C (5% CO ₂).
   6. Como un control negativo, añadir cicloheximida al segundo plato de fondo de cristal de 35 mm 40 min después de la siembra de las células para tratarlas previamente con cicloheximida 50 de μg/mL ( figura 2B). Luego, 15 minutos después de la adición de cicloheximida, añade puromicina al medio utilizando al mismo tiempo de incubación y concentración como en el paso 2.1.5 (p. ej., uso 10 μg/mL de puromicina durante 5 minutos a 37 ° C (5% CO ₂) por MRC-5).
   7. Lave cada plato dos veces con 2 mL de helado 1 X PBS y fijar las células con 1 mL de formaldehído al 4% (diluido en 1 X PBS) durante 15 min a temperatura ambiente (RT).
      PRECAUCIÓN: Paraformaldehido debe utilizarse estrictamente en una campana química.
2. Immunostaining.
   1. Tras fijación de paraformaldehido, lavar tres veces con 2 mL de 1 X PBS e incubar en 500 μl de PBS-TritonX-100 (0,5%) por 20 min a temperatura ambiente para permeabilizar las células.
   2. Para evitar la Unión de anticuerpos no específicos, bloquean la muestra con 500 μl PBS – BSA (1%) por 20 min a TA.
   3. Lavar tres veces con 2 mL de PBS-Tween20 (0,1%) e incubar con 300 μL de 1:12,500 de anticuerpos anti-puromicina (12 D 10) diluida en 1 X PBS para 1 h a TA.
   4. Lave 3 veces con 2 mL de PBS-Tween20 (0,1%) e incubar con 300 μL de anti-ratón IgG conjugado con un fluoróforo (aquí, 488 nm) diluido en PBS para visualizar puromycilated polipéptidos y con phalloidin-conjugado a otro fluoróforo (aquí, 555 nm) para visualizar la F-actina. Incubar durante 1 h a RT.
   5. Lavar tres veces con 2 mL de PBS-Tween20 (0.1%) y luego incubar 5 min a temperatura ambiente en 300 μL de PBS-Tween20 (0.1%) suplementado con 1 μg/mL 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
   6. Lavar tres veces con 2 mL de PBS-Tween20 (0.1%) y luego lavar con 2 mL de 1 X PBS. Evitar que las células de secado, manteniendo la muestra en 2 mL de 1 X PBS durante la adquisición de la imagen.

3. Adquisición de imagen inmunofluorescente

Nota: la siguiente metodología se puede utilizar con cualquier sistema de imagen confocal disponible en el mercado.

Configuración

1. determinar el apropiado para cada fluoróforo para aprovechar al máximo el rango dinámico para la cuantificación.
   Nota: Representante cuantificación sólo puede obtener si se evita la saturación de píxeles y el umbral de señal se ajusta correctamente. Esta configuración puede ser logrado ajustando cuidadosamente la energía del laser, alto voltaje (HV), ganancia, y el desplazamiento. Factor de
   1. ajuste el zoom (5 X) y el número de píxeles (512 x 512) para optimizar el tamaño del pixel.
      Nota: Esto debe ser por lo menos 2.3 - veces más pequeño que la resolución óptica, según el teorema de Nyquist.
   2. Disminuir la velocidad de escaneo (12.5-20 μs/pixel) y promedio (2 - 3 veces) para mejorar la relación señal a ruido según la configuración mencionada.
2. Manualmente determinar el más apropiado e inferior planos focales a lo largo del eje z con el tamaño de paso óptimo (0,4 μm/slice).
   Nota: El plano del tamaño de paso es determinado por la resolución axial dividida por 2,3, según el teorema de Nyquist. Por lo general, son necesarias para cubrir la profundidad de toda la célula de células adherentes capas de 20-25.
3. Adquirir una imagen confocal de una sola célula entera con un objetivo de inmersión de aceite X Plan Apo 60 (apertura numérica 1.42).

4. Cuantificación de imagen inmunofluorescente

1. determinación del enriquecimiento.
   1. Abra una imagen correspondiente a la capa z-plano de interés desde el archivo de datos de celular adquirida utilizando el software ImageJ (freeware disponible en http://fiji.sc).
   2. Dibujar una línea usando la herramienta de línea de dibujo (barra de herramientas → recto) a través de las regiones de la celda donde se desea la cuantificación. Modificar el ancho de la línea haciendo doble clic en " recta; " los valores de intensidad se media a través de la anchura de la línea (a las 8 en la figura 3).
      Nota: Una línea más delgada es preferible para evitar la superposición de la señal de diferentes estructuras.
   3. Después de la línea correctamente, perfil de la densidad de la señal en el eje determinado (barra de menús → análisis → Perfil de parcela).
      Nota: Nuevo se abrirá una ventana que muestra un perfil correspondiente a la intensidad de la señal de cada píxel del canal seleccionado (fluoróforo específico) a lo largo de la línea de la sección seleccionada del plano z.
      1. Repetir el proceso para cada canal corresponde al fluoróforo utilizado (es decir, una cuantificación de 488, uno para 568 y uno de 405).
         Nota: El valor de la intensidad de la señal siempre se ordenará siguiendo la orientación de la línea dibujada.
   4. Para obtener los valores numéricos escala de gris de cada píxel del perfil correspondiente a las cuantificaciones de la capa seleccionada del plano z, copiar los datos del perfil (barra de menús en la ventana de la imagen → Copy) y pegar en cualquier programa de hoja de cálculo.
   4.1.1-4.1.4
   5. Repita los pasos para cada sección del plano z de la imagen confocal adquirida y cada canal que se desee cuantificación.
      Nota: La cuantificación de diferentes capas de plano z puede combinarse para obtener una evaluación general del enriquecimiento especial de la señal de calculando el valor de la suma de cada píxel a lo largo de la línea para cada capa del plano z. Este tipo de agrupación sólo se logra si la línea es idéntica para cada capa del plano z en los valores medios.
   6. Como un método alternativo para la cuantificación de células completas de diferentes canales con un gran número de capas, utilice la macro llamada StackprofileData (véase el Archivo suplementario).
      Nota: Esta macro es accesible libremente en https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt y puede ser utilizada como sigue:
      1. pega la macro en un archivo de texto y guardar todo
      2. Abrir el archivo de imagen que incluye todas las capas confocales de la célula.
      3. Dibujar una línea, como se describe en el paso 4.1.2, abrir una nueva ventana para importar la macro (barra de menús → Plugins → Macros → ejecutar), elegir el archivo de texto guardado anteriormente correspondiente a la macro StackprofileData y haga clic en " abierto "
         Nota: Después de la importación de macro, una nueva ventana llamada " resultados " se abrirá y todos la cuantificación a lo largo del eje determinado se mostrará para cada plano z capa y canal presentes en los archivos de imagen.
      4. Copiar los datos para cada canal (barra de menú → editar → copia) para obtener la representación gráfica del perfil correspondiente a las cuantificaciones de la señal. Pegar en cualquier programa de hoja de cálculo. Calcular el valor de la suma de cada canal de cada pixel a lo largo de la línea para cada capa del plano z. Use estos valores para crear una representación gráfica similar a la que se presenta en la figura 3.
2. Cuantificación de la señal en un área designada para celular o.
   1. Abrir el archivo de imagen con el software ImageJ.
   2. Dibujar un área para denotar el área de interés con la función de la forma geométrica (barra de herramientas → " rectángulo, " " oval, " o " polígono ").
      Nota: Se determinará el valor de cuantificación para el área correspondiente a la forma dibujada.
   3. Ajustar el nivel de umbral para evitar cualquier señal de fondo (menú → ajuste de la imagen → umbral); aparecerá una nueva ventana para representar las intensidades de píxeles en forma de histograma. Cambiar los valores para incluir/excluir los píxeles de la cuantificación mediante el control deslizante. Seleccionar un umbral que elimina píxeles rojos fuera de la célula, como píxeles resaltados en rojo serán incluidos en la cuantificación.
   4. Definir los parámetros de medición para cuantificar la señal de píxeles dentro de la zona seleccionada, sin señal de fondo (menú → analizar → establecer medidas) y asegúrese de comprobar la " límite umbral " y la " densidad integrada " cajas de.
   5. Medir los valores cuantitativos del área seleccionada (barra de menús → análisis → medida).
      Nota: La cuantificación de intensidad de señal se presentará en una ventana nueva en la " IntDen " identificación, que representa el producto de los valores promedio de gris y el número de píxeles dentro de la zona seleccionada.
   6. Dibujar un área que incluye a toda la célula mediante una forma geométrica (barra de herramientas → " rectángulo, " " oval, " o " polígono ") y proceder con los pasos 4.2.3-4.2.5 para obtener un valor correspondiente a la señal total. Calcular el cociente de la señal dentro de la zona seleccionada sobre toda la señal para obtener el porcentaje de la señal dentro del área de interés.
   7. Repetir pasos 4.2.2-4.2.6 para obtener la cuantificación del volumen de la célula para cada plano z. Adaptar la forma geométrica según sea necesario.
   8. Copiar y pegar los datos obtenidos de la " resultados " windows para cada capa del plano z en una hoja de cálculo para la representación gráfica y para encontrar un valor medio.

Resultados

Para observar con precisión eventos de traducción mediante la incorporación de puromicina, es fundamental para determinar las condiciones óptimas para cada línea celular porque cada uno demuestra diferentes puromicina incorporación cinética (figura 1)^{9,11 ,12,18}. Por lo tanto, para validar la incorporación de puromicina, es...

Discusión

Avances tecnológicos recientes han permitido una mejor comprensión de los mecanismos implicados en el upregulation traslacional o la represión de los mRNAs específicos en procesos biológicos, como metástasis, respuesta de la droga y desarrollo neuronal. La metodología rentable aquí descrita permite eventos de traducción para ser visualizados en las células para el estudio de cómo las proteínas RNA-que ata regulan procesos metastásicos, como la adhesión celular, la migración y la invasión.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	wisent	319-005-CL
Trypsine	wisent	325-043 EL
FBS	Thermo Fisher Scientific	12483020
Puroycin antibody 12D10	EMD millipore	MABE343	western blot dilution 1:25,000 Immunofluoresence dilution 1:10,000
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody	cell signaling technology	7076	western blot dilution 1:8,000
Western Lightning Plus-ECL	Perkin Elmer	NEL104001EA
Anti-mouse IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate)	cell signaling technology	4408	immunofluoresecence dilution 1:400
CF568 Phalloidin	biotium	00044	immunofluoresecence dilution 1:400
Cyclohexmide	Sigma	C1988-1G	50µg/ml final concentration
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	final concentration 1µg/ml
Puromycin	bio-Basic	PJ593	2.5µg/ml to 10µg/ml
Ibidi µ-Dish 35 mm, high, ibiTreat	Ibidi	81156
MRC-5 cells	ATCC	CCL-171
HeLa cells	ATCC	CCL-2
Huh-7 cells	from Dr. Mazroui (Université Laval)
Fv1000	olympus		confocal imaging system
Fiji software			http://fiji.sc
PBS (Phosphate BuffeRed Saline)	bio-Basic	PD8117
Formaldehyde 37% Solution	bio-Basic	C5300-1
Triton X-100	bio-Basic	TB0198
BSA	Fisher Bioreagents	BP9702-100
Tween20	Fisher Bioreagents	BP337-500