Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

חלבונים משפחתי קטן הקשורות אוביקוויטין צירוף (סומו) הם מצומדת ל ליזין שאריות לחלבונים היעד כדי לווסת תהליכים תאיים שונים. מאמר זה מתאר פרוטוקול איתור רטינובלסטומה (Rb) חלבון SUMOylation בתנאים אנדוגני, אקסוגני בתאים אנושיים.

Abstract

השינויים post-translational של חלבונים חיוניים לוויסות תקין של אותות תאיים. בין השינויים האלה, צירוף הקשורות אוביקוויטין קטן (סומו) הוא חלבון כמו אוביקוויטין שאליו מחובר covalently שאריות ליזין מגוון רחב של חלבונים היעד כדי לווסת תהליכים תאיים, שעתוק גנים, תיקון ה-DNA, חלבונים האינטראקציה השפלה, תחבורה subcellular ו מעבר אותות. הגישה הנפוצה ביותר כדי זיהוי חלבונים SUMOylation מבוסס על הביטוי ולטיהור מתויג חומרים של חיידקים, המאפשרות במבחנה הביוכימי לתגובה וזה פשוט מתאימים למיעון מכניסטית שאלות. עם זאת, בשל המורכבות של התהליך של SUMOylation ויוו, זה יותר מאתגר כדי לזהות ולנתח חלבון SUMOylation בתאים, במיוחד כאשר תחת תנאים אנדוגני. מחקר שנערך לאחרונה על ידי מחברי המאמר חשף רטינובלסטומה אנדוגני (רובידיום) חלבון, מדכאי מהווה מרכיב ברגולציה השלילית של ההתקדמות מחזור התא, הוא במיוחד SUMOylated בשלב G1 מוקדם. מאמר זה מתאר פרוטוקול זיהוי, ניתוח של Rb SUMOylation בתנאים אנדוגני והן אקסוגני בתאים אנושיים. פרוטוקול זה מתאים החקירה פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר ופונקציונליים של הסומו-השינוי של Rb, כמו גם רבים אחרים, ממוקדות סומו חלבונים, בתאים אנושיים.

Introduction

שליטה מדויקת של מחזור התא. להתקדם בתוך התאים האיקריוטים מבוסס על רשת רגולציה הדוקה, אשר מבטיח כי האירועים מתקיימים בצורה מסודרת1,2. אחד השחקנים מפתח רשת זו הוא החלבון רטינובלסטומה (Rb), הראשון משובטים הגידול משתיק קול1,3. חלבון Rb נחשב מווסת שלילי של התקדמות מחזור התא, במיוחד עבור ה-G0/G1 מעבר פאזה S ולאחר גידול צמיחה4,5. כישלון של פונקציה Rb גם ישירות מוביל גידול ממאיר תוך-עיני הנפוצות ביותר אצל ילדים, רטינובלסטומה, או תורם להתפתחות של סוגים רבים אחרים של סרטן5. יתר על כן, Rb מעורב משעולים הסלולר רבים כולל תאית התמיינות, כרומטין שיפוץ של אפופטוזיס המיטוכונדריה בתיווך3,6,7.

שינויים post-translational לשחק תפקיד מרכזי בוויסות RB פונקציה8,9. זרחון הוא אחד שינוי כזה, זה בדרך כלל מוביל Rb איון. בתאים G0 השבתה הדרגתית, Rb פעילה עם רמה נמוכה זירחון. כמו תאים התקדמות דרך שלב G0/G1, Rb הוא ברצף היפר-phosphorylated על ידי סדרה של חלבון cyclin תלוית kinases (CDKs), cyclins, כגון cyclin E/CDK2, cyclin D/CDK4/6, אשר בטל Rb ולחסל את יכולתו לדכא את מחזור התא הקשורים גנים ביטוי4,10. Rb יכול גם להיות שונה על-ידי צירוף הקשורות אוביקוויטין קטן (סומו)11,12,13.

סומו הוא חלבון כמו אוביקוויטין שאליו מחובר covalently מגוון רחב של חלבונים היעד. . זה קריטי עבור תהליכים תאיים מגוונים, כולל תקנה מחזור התא, שעתוק, לוקליזציה הסלולר חלבון, השפלה, תחבורה ו DNA תיקון14,15,16, 17 , 18. סומו ההטיה מסלול מורכב dimeric סומו E1 הפעלת האנזים SAE1/UBA2, יחיד E2 conjugating האנזים Ubc9, ligases E3 מרובים, פרוטאזות סומו ספציפיים. באופן כללי, חלבונים סומו nascent יש לעבד proteolytically כדי ליצור את הטופס בוגרת. בגלל הסומו בוגרת מופעל על ידי heterodimer E1, הועבר לאחר מכן האנזים E2 Ubc9. בסופו של דבר, גליצין C-מסוף של סומו הוא covalently מצומדת על פי ליזין היעד של מצע, תהליך זה בדרך כלל בהנחייתם של E3 ligases. החלבון סומו ניתן להסיר את המצע ששונה על-ידי פרוטאזות ספציפיים. מחקר קודם על ידי מחברי המאמר חשף כי SUMOylation של Rb מגביר שלה מחייב CDK2, שמוביל hyper-זרחון בשלב G1 מוקדם, תהליך אשר יש צורך מחזור התא התקדמות13. גם להדגים כי האובדן של Rb SUMOylation גורמת שגשוג תאים ירד. יתר על כן, לאחרונה הוכח כי SUMOylation של Rb מגן על חלבון Rb תחלופת proteasomal, ובכך מגדילים את רמת חלבון Rb תאים19. לכן, SUMOylation ממלא תפקיד חשוב בתפקוד Rb בתהליכים הסלולר השונות. כדי להמשיך לחקור תוצאה פונקציונלית והרלוונטיות פיזיולוגיים של Rb SUMOylation, חשוב לפתח שיטה יעילה כדי לנתח את מצב סומו Rb תאים אנושיים או רקמות החולה.

SUMOylation הוא תהליך הפיך, דינמי מאוד. לכן בדרך כלל קשה לזהות את החלבונים סומו-השתנה בתנאים לחלוטין אנדוגני. מאמר זה מציג שיטה לגילוי SUMOylation Rb אנדוגני. יתר על כן, זה מראה איך מזהים SUMOylation Rb אקסוגני של פראי-סוג Rb והן המוטציה שלה לקויה סומו11. בפרט, ג'ייקובס. ואח תיאר שיטה להגדיל את השינוי סומו של מצע נתון במיוחד על ידי SUMOylation (UFDS) מכוון היתוך של Ubc920. מבוסס על שיטה זו, פרוטוקול זה מתאר כיצד לנתח SUMOylation כפויה של Rb והשלכותיה פונקציונלי. בהתחשב בכך מאות סומו סובסטרטים שתוארו קודם לכן, נוסף בשם דיאלקטריים סומו זוהו של מבחני רבים מבוססי פרוטיאומיה מבנית, פרוטוקול זה ניתן להחיל לנתח הסומו-השינוי של אלה חלבונים בתאים אנושיים.

Protocol

1-זיהוי של אנדוגני Rb SUMOylation בשלב G1 מוקדם

  1. תא סינכרון תרבות, מחזור התא.
    1. HEK293 לשמור על תאים מדיום הגידול המכיל Dulbecco ' s השתנה נשר בינוני (DMEM) בתוספת 1% עט-דלקת ו-10% עוברית שור סרום (FBS)-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 בתוך אינקובטור.
    2. לסנכרן את התאים HEK293 בשלב G0.
      1. ספירת התאים HEK293 משתמש של hemocytometer וזרע ~1.5 x 10 7 תאים 15 ס מ צלחת עם 25 מ ל מדיום הגידול עבור 24 שעות לפני הטיפול. כשמגיעים זרימה של 70% - 80%, לשאוב את המדיום ואת שטיפת התאים פעמיים עם 5 מ"ל prewarmed באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
      2. להוסיף 25 מ ל DMEM המכיל 1% פניצילין-סטרפטומיצין דגירה התאים ב 37 ° C עבור ה 72 לשטוף את התאים מהצלחת באמצעות 3 מ"ל PBS קר כקרח. להעביר את התאים לתוך צינור 5 מ ל.
      3. נושא חלק קטן של תאים ניתוח מחזור התא על ידי cytometry זרימה (שלב 1.2); איסוף רוב התאים הנותרים על ידי צנטריפוגה-200 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לאחסן אותם במקפיא טמפרטורה האולטרה-נמוך עד ניתוח של Rb SUMOylation.
    3. כדי להשיג שלב G1 תאים, בסופו של תהליך הסינכרון G0, להסיר את DMEM ולהוסיף מדיום הגידול חוזרים רעננים, ובכך מאפשר את התאים HEK293 להזין מחדש את מחזור התא. לאחר מכן, לאסוף את התאים ב G1 לויזה (G1 מוקדם: 30 דקות; G1: 2 h) עבור מחזור התא ניתוח וסומו נוספת assay.
    4. לסנכרן את התאים HEK293 בשלב S בשיטת כפול-תימידין בלוק. תאים
      1. לתאים לגדול HEK293 confluency של 50%, לשטוף עם prewarmed PBS. לאחר מכן להוסיף את מדיום הגידול בתוספת 2.5 מ"מ תימידין עבור 18 h (רחוב הראשונים).
      2. להסיר את המדיום המכיל תימידין, ולאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים עם prewarmed PBS. הוסף את מדיום הגידול טריים עבור 14 h לשחרר את התאים.
      3. למחוק את המדיום עם פיפטה ולהוסיף מדיום הגידול בתוספת 2.5 מ"מ תימידין עבור עוד 18 h (בלוק השני) לפני ביצוע ניתוח של מחזור התא, Rb SUMOylation.
    5. הסינכרון עבור ה G2/M, צלחת ~1.5 × 10 7 HEK293 לתאים מאכל 15 ס מ עם 25 מ ל מדיום הגידול במשך 24 שעות ביממה. לאחר מכן להוסיף nocodazole המדיום עד ריכוז סופי של 400 ננוגרם למ"ל, מתקבל. לבסוף, דגירה את התאים עבור 16 h לפני ביצוע הניתוח של מחזור התא, Rb SUMOylation.
  2. ניתוח מחזור התא על ידי cytometry זרימה.
    1. מחדש להשעות את HEK293 מסונכרנות ב- PBS ולאחר מכן לתקן התליה תא באמצעות אתנול 70% קר כקרח עבור 2 h-4 מעלות צלזיוס. שים לב כי כדי למזער תא קיבוץ באשכולות, להוסיף התליה תא dropwise קר כקרח האתנול 100% בריכוז סופי של 70% אתנול תוך בעדינות vortexing.
    2. Centrifuge את התאים עבור 5 דקות ב 500 x g, ואז למחוק את תגובת שיקוע בקפידה-לשטוף את התאים פעמיים עם PBS. חזור על השלב צנטריפוגה.
      3. 50 המכיל
    3. להוסיף 500 µL PBS µg/mL חומצת גרעין כתם propidium יודיד, 0.1% טריטון X-100 ו- 1 µg/mL RNase A לתאים ומערבבים היטב. דגירה התאים למשך 15 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
    4. לאחסן את הדגימות ב 4 ° C עד ניתוח על ידי cytometry זרימה.
  3. Immunoprecipitation של חלבון Rb אנדוגני. Lysates תא
    1. להכין HEK293.
      1. Lyse התאים HEK293 מסונכרן על ידי בעדינות השעיית אותם מחדש ב 1 מ"ל של רדיו כקרח-immunoprecipitation assay (ריפה) פירוק מאגר (טבלה 1) המכיל טרי הוסיף 20 מ מ N-Ethylmaleimide, מעכב isopeptidase יכול לחסום סומו פרוטאזות ולייצב את הסומו conjugates.
      2. עוד homogenize את התאים על הקרח על ידי דאונס המגון, sonication או פשוט עובר עשר פעמים דרך מחט 21 G המחובר מזרק 2 מ"ל. לאחר מכן, דגירה התאים על קרח 5 דק
        הערה: anionic דטרגנט נתרן dodecyl גופרתי (מרחביות) במאגר ריפה הוא קריטי עבור קביעת מאוחר יותר Rb-הסומו, כמו זה יכול לחסל את האות סומו לא ספציפי זה נגזרת מהאינטראקציה הלא-קוולנטיות בין חלבון Rb לבין השני סומו-מינים שאינם Rb.
    2. Centrifuge את lysates תא ב g x 18,000 למשך 30 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס להעביר supernatants את צינורות חדשים של מיקרו-צנטריפוגה 1.5 mL-
      הערה: הפרוטוקול אפשר לעצור כאן. ניתן לאחסן את החלבונים ב-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 חודשים.
    3. להכין את השליטה כל מדגם קלט תספיג מאוחר יותר, לשמור חלק קטן תגובת שיקוע שתוארו לעיל שפופרת חדשה בעלת החנות ב-80 מעלות צלזיוס
    4. כדי supernatants הנ ל, להוסיף µg 1 של העכבר לא ספציפית אימונוגלובולין G (IgG) של מינים, isotype אותו כמו הנוגדן monoclonal Rb ו 20 µL של 50% חלבון A/G-sepharose slurry. לאחר מכן, תקופת דגירה של h 1 ב 4 ° C עם סיבוב עדין.
    5. Centrifuge הדגימות ב 3000 g x במשך 3 דקות ב-4 ° C. בזהירות לאסוף את supernatants מבלי להפריע את החרוזים, ומעבירים אותם אל צינורות מיקרו-צנטריפוגה 1.5 mL החדש. לכל אחד הדגימות, מוסיפים נוגדן ראשוני Rb µL 5 µL 40 50% חלבון slurry A/G-sepharose. לאחר מכן, דגירה בין לילה ב 4 ° C עם סיבוב עדין.
    6. לאסוף את החרוזים על ידי צנטריפוגה ב g x 3000 דקות 3-4 מעלות צלזיוס, הסר בזהירות את תגובת שיקוע על-ידי pipetting. שימו לב כי על מנת למנוע אובדן חרוז, לא תשאף היבשה חרוזים.
    7. לרחוץ את החרוזים ארבע פעמים עם 1 מ"ל של המאגר ריפה. כל הזמן, לערבב הצינורות על ידי סיבוב אותם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות לאסוף את החרוזים על ידי צנטריפוגה מהירות נמוכה ב x 3000 g למשך 3 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן למחוק את supernatants.
    8. לאחר הסרת supernatants בכביסה הסופי, מחדש להשעות את החרוזים ב 30 µL 1 x נתרן dodecyl סולפט-לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (מרחביות-עמוד) טעינת מאגר (טבלה 1) ומערבבים היטב.
      1. Incubate הצינורות ב 100 ° C בחום לחסום עבור 10 דקות Centrifuge את הדגימות-g x 12,000 עבור 1 דקות הצניפה החרוזים. בזהירות לאסוף את supernatants מבלי להפריע את החרוזים, ולהעביר אותם ל 1.5 mL מיקרו-צנטריפוגה צינורות.
    9. נתח הדגימות מאת 4-20% הדרגתיות מרחביות-דף ג'ל ומערביות כתם או לאחסן אותם ב-20 ° C לשימוש מאוחר יותר.

2. ניתוח של מתויג 6XHis SUMOylation Rb אקסוגני בתאי אדם

  1. תא תרבות, תרביות תאים. 6 HEK293
    1. זרע ~ 6 × 10 בתאים 10 ס מ צלחת, תקופת דגירה של 24 שעות ביממה במדיום הגידול בתנאים התרבות תאים נורמליים לרכוש תאים confluent 75-85%. לפני תרביות תאים, הסר את מדיום הגידול ולהוסיף 6 מ של מדיום מופחת סרום prewarmed (ראה טבלה של חומרים) ולאחר מכן מקם את הכלים בחזרה לתוך החממה.
    2. עבור Rb קונסטיטוטיביות SUMOylation assay, להוסיף 15 µg כל 6XHis מתויג Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT, Ubc9-C93S פלסמידים במדיום מופחת סרום µL 500 1.5 mL מיקרו-צנטריפוגה צינורות, בהתאמה.
      1. כדי לנתח את הסומו-ההטיה של פראי סוג Rb ואת המוטציה שלה תקינה SUMOylation, לערבב µg 10 של גם מתויג 6XHis Rb-WT או Rb-K720R פלסמיד יחד עם GFP-SUMO1 (10 µg) ב- 500 µL מופחת סרום במדיום 1.5 mL מיקרו-צנטריפוגה צינורות 13.
    3. בינתיים, בשפופרת נפרדת, מערבבים 50 ריאגנט תרביות תאים µL (ראה טבלה של חומרים) ב- 500 µL מופחת סרום בינוני, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דק
    4. לשלב את שני הצינורות נפרד שתוארה לעיל, ואת דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות הוספה תרביות תאים מתחמי ריאגנט/פלסמיד לתאים באופן מלא להמשיך תרבות 8 h ב- 5% CO 2 ו- 37 מעלות צלזיוס.
    5. להחליף מופחת סרום בינוני עם צמיחה בינוני ולאחר דגירה את התאים בתנאים נורמליים תרבות במשך 48 שעות לאחר תרביות תאים.
  2. ניקל זיקה לנתץ חלבון Rb מתויג 6XHis.
    1. Lyse התאים HEK293 transfected ולחלץ את החלבונים הכולל המתואר בסעיף 1.3.1.
    2. צנטריפוגה lysates תא ב g 18,000 x למשך 30 דקות ב-4 ° C. בזהירות לאסוף את supernatants ומעבירים אותם אל צינורות נקיים.
      הערה: החלבון שיכול להיות קפוא בנקודה זו במשך יותר מ-6 חודשים ב-80 מעלות צלזיוס
    3. להכין את השליטה כל מדגם קלט תספיג מאוחר יותר, לחסוך חלק קטן supernatants המתואר לעיל צינור חדש ו החנות ב-80 מעלות צלזיוס
    4. שטיפת 25 µL של 50% ניקל nitrilotriacetic חומצה agarose (Ni-נ) חרוזים עם מאגר ריפה פעמיים ב שפופרת מיקרו-צנטרפוגה 1.5 mL עבור כל דגימה. לאסוף את החרוזים על ידי צנטריפוגה ב g x 3000 דקות 3-4 מעלות צלזיוס
    5. Imidazole להוסיף 1 מ' כל מדגם בריכוז הסופי של 10 מ מ. לאחר מכן, להוסיף כל מדגם הצינור המכיל את החרוזים agarose מוכן Ni-נ. ת.
    6. דגירה החרוזים, את lysates עבור 2 h ב 4 ° C עם סיבוב עדין. לסובב את החרוזים ב g x 3000 דקות 3-4 מעלות צלזיוס, הסר בזהירות את supernatants על ידי pipetting. כדי להימנע מאבדן חרוז, לא תשאף היבשה חרוזים.
    7. לרחוץ את החרוזים עם 1 מ"ל של שטיפת מאגר המכיל 20 מ מ imidazole (טבלה 1). כל זמן, לערבב הצינורות על ידי סיבוב ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות לאסוף את החרוזים על ידי ספינינג ב g x 3000 דקות 3-4 מעלות צלזיוס, ולמחוק את supernatants.
    8. לאחר השטיפה הסופית להוסיף 30 µL של • תנאי מאגר המכיל 250 מ מ imidazole (טבלה 1) כל דגימה, קפיצי לערבב. לאחר מכן, תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 ° C כדי elute את החלבונים.
    9. מערבבים כל דגימה עם × מרחביות-דף 6 טעינת מאגר (טבלה 1). לאחר מכן, דגירה הצינורות ב 100 מעלות צלזיוס בתוך גוש חום במשך 10 דקות
    10. צנטריפוגה-12,000 x g עבור 1 דקות הצניפה החרוזים. בזהירות לאסוף את supernatants מבלי להפריע את החרוזים, ולהעביר את הדגימות 1.5 ml מיקרו-צנטריפוגה צינורות. הדגימות ניתן נותחו על ידי תספיג או המאוחסנים ב-20 ° C לשימוש מאוחר יותר.

3. כתם המערבי

  1. טען את immunoprecipitation או להוריד דוגמאות המתקבל השלבים הקודמים על גבי 4-20% ג'ל מרחביות-דף הדרגתיים. אלקטרופורזה-120 V במשך 90 דקות להפריד את החלבונים לנהל.
  2. להעביר את החלבונים בג'ל קרום difluoride (PVDF) polyvinylidene על ידי electroblotting 300 אמא במשך 90 דקות ב 4 ° C באמצעות שיטת ההעברה טנק. לחסום את הקרום PVDF במאגר בלוק המכיל 5% חלב דל שומן (טבלה 1) לשעה בטמפרטורת החדר.
  3. Incubate הקרום עם נוגדן ראשוני נוגדן דילול מאגר המכיל 3% אלבומין שור (BSA) (טבלה 1) לילה ב 4 º C. נוגדנים העיקרי, להשתמש ריכוז העבודה של 0.5 µg/mL (נוגדן anti-SUMO1), או לדילול 1:2000 (נוגדנים anti-Rb וטובולין נגד), או 1:5,000 (anti-GFP, נוגדן אנטי שלו).
  4. לרחוץ את הקרום 3 x 10 דקות בכל פעם באמצעות 1 x באגירה טריס תמיסת מלח עם מאגר Tween (TBST) (טבלה 1). דגירה הקרום עם 1:5,000 מדולל נוגדנים ספציפיים מצומדת חזרת Peroxidase HRP משני המינים במאגר בלוק המכיל 5% חלב דל שומן (טבלה 1). לשטוף את הקרום 3 x 10 דקות בכל פעם באמצעות מאגר x TBST 1-
  5. דגירה הקרום עם chemiluminescence משופרת (ECL) עובד פתרון. מכסה את הקרום בניילון נצמד, לחשוף אותם בפני לסרטי רנטגן תלוי בכח אות.

תוצאות

לזיהוי SUMOylation Rb אנדוגני במהלך מחזור התא התקדמות, מחקר זה קודם מסונכרנים תאים HEK293-חמישה שלבים שונים של מחזור התא (G0, מוקדם G1, G1, S ו- G2/M) כמתואר בסעיף פרוטוקול של מאמר זה. האיכות של סינכרון אושר באמצעות חומצות גרעין הכתם עם יודיד propidium שלאחריה יבוא ניתוח cytometry זרימה (...

Discussion

מאמר זה מתאר פרוטוקול לזהות ולנתח SUMOylation אנדוגני של Rb בתאים אנושיים. כפי בשיטה זו מתמקדת באופן ספציפי חלבון Rb אנדוגני ללא כל ההתחלפות של האות הגלובלית הקשורות סומו, זה כלי חשוב עבור חוקרים Rb-סומו שינוי בנסיבות הפיזיולוגיות טבעי לחלוטין.

כדי להשיג מטרה זו, חשוב לזכור כי: 1) למר?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מן המדע, הטכנולוגיה עמלה של שנגחאי (מענק מס 14411961800) הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (מענק מס 81300805).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995065
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific31985070
Fetal Bovine Serum (FBS)Thermo Fisher Scientific26140079
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122
Phosphate-buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200056
ThymidineSigmaT9250
NocodazoleSigmaM1404
propidium iodideThermo Fisher ScientificP3566
Triton X-100 AMRESCO694
RNase A Thermo Fisher ScientificEN0531
N-EthylmaleimideSigmaE3876 
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)AMRESCOM107
Nonidet P-40 Substitute (NP-40)AMRESCOM158
protease inhibitorRoche5892970001
Mouse Immunoglobulin G (IgG)Santa Cruz Biotechnologysc-2025
Rb antibodyCell Signaling Technology#9309
Protein A/G-Sepharose BeadsSanta Cruz Biotechnologysc-2003
Lipofectamine-2000 Thermo Fisher Scientific11668019
Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose BeadsQiagen30230
ImidazoleSigmaI0250
4%-20% Gradient SDS-PAGE GelBIO-RAD4561096
Polyvinylidene Difluoride (PVDF) MembraneMilliporeIPVH00010
Tween-20AMRESCOM147
Tubulin antibodyAbmartM30109
SUMO1 antibodyThermo Fisher Scientific33-2044
GFP antibodyAbmartM20004
Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibodyJackson ImmunoResearch Laboratories715-035-150
enhanced chemiluminescence (ECL) KitThermo Fisher Scientific32106

References

  1. Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 518-528 (2013).
  2. Massague, J. G1 cell-cycle control and cancer. Nature. 432 (7015), 298-306 (2004).
  3. Weinberg, R. A. The retinoblastoma protein and cell cycle control. Cell. 81 (3), 323-330 (1995).
  4. Giacinti, C., Giordano, A. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25 (38), 5220-5227 (2006).
  5. Burkhart, D. L., Sage, J. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8 (9), 671-682 (2008).
  6. Ferreira, R., Naguibneva, I., Pritchard, L. L., Ait-Si-Ali, S., Harel-Bellan, A. The Rb/chromatin connection and epigenetic control: opinion. Oncogene. 20 (24), 3128-3133 (2001).
  7. Hilgendorf, K. I., et al. The retinoblastoma protein induces apoptosis directly at the mitochondria. Genes Dev. 27 (9), 1003-1015 (2013).
  8. Munro, S., Carr, S. M., La Thangue, N. B. Diversity within the pRb pathway: is there a code of conduct. Oncogene. 31 (40), 4343-4352 (2012).
  9. Macdonald, J. I., Dick, F. A. Posttranslational modifications of the retinoblastoma tumor suppressor protein as determinants of function. Genes Cancer. 3 (11-12), 619-633 (2012).
  10. Ezhevsky, S. A., et al. Hypo-phosphorylation of the retinoblastoma protein (pRb) by cyclin D:Cdk4/6 complexes results in active pRb. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10699-10704 (1997).
  11. Ledl, A., Schmidt, D., Muller, S. Viral oncoproteins E1A and E7 and cellular LxCxE proteins repress SUMO modification of the retinoblastoma tumor suppressor. Oncogene. 24 (23), 3810-3818 (2005).
  12. Li, T., et al. Expression of SUMO-2/3 induced senescence through p53- and pRB-mediated pathways. J Biol Chem. 281 (47), 36221-36227 (2006).
  13. Meng, F., Qian, J., Yue, H., Li, X., Xue, K. SUMOylation of Rb enhances its binding with CDK2 and phosphorylation at early G1 phase. Cell Cycle. 15 (13), 1724-1732 (2016).
  14. Geiss-Friedlander, R., Melchior, F. Concepts in sumoylation: a decade on. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 947-956 (2007).
  15. Flotho, A., Melchior, F. Sumoylation: a regulatory protein modification in health and disease. Annu Rev Biochem. 82, 357-385 (2013).
  16. Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
  17. Wilkinson, K. A., Henley, J. M. Mechanisms, regulation and consequences of protein SUMOylation. Biochem J. 428 (2), 133-145 (2010).
  18. Gill, G. SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms. Genes Dev. 18 (17), 2046-2059 (2004).
  19. Sharma, P., Kuehn, M. R. SENP1-modulated sumoylation regulates retinoblastoma protein (RB) and Lamin A/C interaction and stabilization. Oncogene. 35 (50), 6429-6438 (2016).
  20. Jakobs, A., et al. Ubc9 fusion-directed SUMOylation (UFDS): a method to analyze function of protein SUMOylation. Nat Methods. 4 (3), 245-250 (2007).
  21. Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
  22. Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
  23. Saitoh, H., Hinchey, J. Functional heterogeneity of small ubiquitin-related protein modifiers SUMO-1 versus SUMO-2/3. J Biol Chem. 275 (9), 6252-6258 (2000).
  24. Ayaydin, F., Dasso, M. Distinct in vivo dynamics of vertebrate SUMO paralogues. Mol Biol Cell. 15 (12), 5208-5218 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

129Rbpost translational PTMHKE293

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved