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  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Protéines de la famille petit axés sur l’ubiquitine modificateur (SUMO) sont conjugués aux résidus lysine de protéines cibles pour réglementer divers processus cellulaires. Cet article décrit un protocole pour la détection de la protéine du rétinoblastome (Rb) SUMOylation conditions endogènes et exogènes dans les cellules humaines.

Résumé

Les modifications post-traductionnelles des protéines sont cruciales pour la règlementation propre de transduction de signaux intracellulaires. Parmi ces modifications, petit axés sur l’ubiquitine modificateur (SUMO) est une protéine d’ubiquitin-comme qui est de façon covalente aux résidus lysine d’une variété de protéines cibles pour réguler les processus cellulaires, tels que la transcription des gènes, la réparation de l’ADN, protéine interaction et la dégradation, transport intracellulaire et transduction du signal. L’approche la plus courante à la détection des protéines SUMOylation est basé sur l’expression et purification de protéines recombinantes marqués chez les bactéries, ce qui permet une réaction in vitro biochimique qui est simple et adapté pour l’adressage mécaniste questions. Toutefois, en raison de la complexité du processus de SUMOylation in vivo, il est plus difficile à détecter et analyser les protéines SUMOylation dans les cellules, surtout lorsque des conditions endogènes. Une étude récente menée par les auteurs de cette étude a révélé que la protéine du rétinoblastome endogène (Rb), un suppresseur de tumeur qui est essentiel à la régulation négative de la progression du cycle cellulaire, est spécifiquement SUMOylated au début de la phase G1. Cet article décrit un protocole pour la détection et l’analyse de SUMOylation Rb conditions endogènes et exogènes dans les cellules humaines. Ce protocole est approprié pour l’étude phénotypique et fonctionnelle du SUMO-modification du Rb, ainsi que plusieurs autres protéines SUMO ciblées, dans les cellules humaines.

Introduction

Le contrôle précis de la progression du cycle cellulaire dans les cellules eucaryotes repose sur un réseau serré de réglementation, qui s’assure que des événements particuliers se déroulent dans une manière ordonnée1,2. Un des principaux acteurs de ce réseau est la protéine du rétinoblastome (Rb), la première tumeur clonés suppresseur1,3. La protéine Rb est considérée comme un régulateur négatif de la progression du cycle cellulaire, en particulier pour le G0/G1 à transition de phase S et la croissance de tumeur4,5. Défaillance de la fonction de Rb soit conduit directement à la malignité intraoculaire plus courante chez les enfants, rétinoblastome, ou contribue au développement de nombreux autres types de cancer,5. En outre, Rb est impliqué dans plusieurs voies cellulaires dont la différenciation cellulaire, remodelage de la chromatine et l’apoptose médiée par les mitochondries3,6,7.

Modifications post-traductionnelles jouent un rôle essentiel dans la régulation de RB fonction8,9. La phosphorylation est une telle modification, et il conduit généralement à l’inactivation de Rb. Dans les cellules quiescentes G0, Rb est actif avec un niveau faible de phosphorylation. Comme les cellules franchiront phase G0/G1, Rb est séquentiellement hyper-phosphorylés par une série de kinases cycline-dépendante de protéine (CDKs) et cyclines, tels que de la cycline E/CDK2 et cycline D/CDK4/6, qui inactivent Rb et éliminer sa capacité à réprimer le cycle cellulaire associés de gene expression4,10. RB peut également être modifié par petit axés sur l’ubiquitine modificateur (SUMO)11,12,13.

SUMO est une protéine d’ubiquitin-comme qui est de façon covalente à une variété de protéines cibles. Il est crucial pour divers processus cellulaires, y compris la régulation du cycle cellulaire, la transcription, la localisation cellulaire des protéines et dégradation, transport et ADN réparation14,15,16, 17 , 18. voie de conjugaison le SUMO se compose de l’enzyme activatrice E1 SUMO dimère SAE1/UBA2, la seule enzyme de conjugaison E2 Ubc9, multiples E3 ligases et protéases spécifiques SUMO. En règle générale, les protéines SUMO naissantes doivent être traitées de clivage protéolytique pour générer la forme mature. Le SUMO mature est activé par l’hétérodimère E1 et ensuite transféré à l’enzyme E2 Ubc9. Enfin, la glycine C-terminale du SUMO est par covalence conjugué à la lysine de la cible d’un substrat, et ce processus est généralement facilité par l’E3 ligases. La protéine SUMO peut être supprimée de la mis à jour le substrat par des protéases spécifiques. Une étude antérieure par les auteurs de cette étude a révélé que la SUMOylation de Rb augmente sa liaison à CDK2, conduisant à la phosphorylation hyper à la phase précoce de la G1, un processus qui est nécessaire pour la progression de cycle cellulaire13. Nous avons aussi démontré que la perte de SUMOylation Rb provoque une prolifération cellulaire réduite. En outre, il a été démontré récemment que la SUMOylation de Rb protège la protéine Rb de proteasome chiffre d’affaires, ce qui augmente le taux de protéine Rb en cellules19. Par conséquent, la SUMOylation joue un rôle important en fonction de la Rb dans divers processus cellulaires. Afin d’étudier les conséquences fonctionnelles et pertinence physiologique de SUMOylation Rb, il est important de développer une méthode efficace pour analyser l’État SUMO de Rb dans les cellules humaines ou les tissus du patient.

SUMOylation est un processus réversible, très dynamique. Ainsi, il est généralement difficile de détecter les protéines SUMO-modifiées dans des conditions totalement endogènes. Cet article présente une méthode pour détecter la SUMOylation endogène de Rb. En outre, il montre comment détecter exogène Rb SUMOylation de Rb sauvage et sa mutation de SUMO-deficient11. En particulier, Jacobs et coll. décrit une méthode pour augmenter la modification de SUMO d’un substrat donné spécifiquement par Ubc9 fusion dirigée SUMOylation (UFD)20. Selon cette méthode, ce protocole décrit comment analyser la SUMOylation forcé de Rb et ses conséquences fonctionnelles. Étant donné que des centaines de substrats SUMO ont été décrits précédemment et plusieurs substrats SUMO présumés ont été identifiés de nombreuses analyses protéomiques, ce protocole peut être appliqué pour analyser la SUMO-la modification de ces protéines dans les cellules humaines.

Protocole

1. détection de la SUMOylation Rb endogène au début de la Phase G1

  1. Cell culture et cycle cellulaire synchronisation.
    1. Cellules HEK293 maintenir en milieu de culture contenant Dulbecco ' s Modified Eagle moyenne (DMEM) additionné de 1 % Strep-Pen et 10 % bovin sérum fœtal (SVF) à 37 ° C et 5 % de CO 2 dans un incubateur.
    2. Synchroniser les cellules HEK293 lors de la phase G0.
      1. Comte les cellules HEK293 utilisant un hémocytomètre et semences ~1.5 x 10 7 cellules dans un 15 cm plat avec 25 ml de milieu de croissance pendant 24 h avant le traitement. Après avoir atteint une confluence d’aspirat de 70-80 %, le moyen et le lavage des cellules deux fois avec 5 mL préchauffé solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
      2. Ajouter 25 mL DMEM contenant 1 % pénicilline-streptomycine et incuber les cellules à 37 ° C pendant 72 h. laver les cellules de la plaque à l’aide de 3 mL de PBS glacée. Les cellules de transfert dans un nouveau tube de 5 mL.
      3. Sous réserve une petite partie des cellules à l’analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux (étape 1.2), recueillant la majorité restante des cellules par centrifugation à 200 x g pendant 5 min à température ambiante et puis les stocker dans un congélateur ultra basse température jusqu'à l’analyse de Rb SUMOylation.
    3. Pour obtenir la phase G1 cellules, à la fin du processus de synchronisation G0, retirer le DMEM et ajouter milieu dos frais, permettant ainsi les cellules HEK293 à réintégrer le cycle cellulaire. Ensuite, recueillir les cellules à différentes phases G1 (début G1 : 30 min ; G1 : 2 h) pour le cycle cellulaire analyse et autre SUMO dosage.
    4. Synchroniser les cellules HEK293 lors de la phase de S à l’aide de la méthode de double-thymidine bloc. Cellules
      1. cellules HEK293 poussent à une confluence de 50 % et de lavage avec du PBS préchauffée. Ajoutez ensuite additionné de croissance avec la thymidine 2,5 mM pour 18 h (premier bloc).
      2. Enlever le milieu de la thymidine contenant et laver les cellules deux fois avec du PBS préchauffée. Ajouter le milieu de croissance fraîche pendant 14 h libérer les cellules.
      3. Jeter le milieu avec une pipette et ajouter le milieu additionné de thymidine 2,5 mM pour encore 18 h (second bloc) avant de procéder à une analyse du cycle cellulaire et Rb SUMOylation.
    5. La synchronisation pour le G2/M, plaque ~1.5 × 10 7 HEK293 cellules à un plat de 15 cm avec 25 mL de milieu de croissance pendant 24 h. Ajoutez ensuite le nocodazole au milieu jusqu'à l’obtention d’une concentration finale de 400 ng/mL. Enfin, incuber les cellules pendant 16 h avant d’effectuer l’analyse du cycle cellulaire et Rb SUMOylation.
  2. Analyse du cycle cellulaire par cytométrie.
    1. Remettre en suspension les HEK293 synchronisée dans du PBS et fixer ensuite la suspension de cellules à l’aide de glacee éthanol à 70 % pendant 2 h à 4 ° C. Notez que pour minimiser la cellule mise en cluster, la suspension cellulaire, ajouter quelques gouttes à l’éthanol glacé de 100 % pour obtenir une concentration finale de éthanol à 70 % tout en douceur Vortex.
    2. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 500 x g, puis soigneusement éliminer le surnageant et laver les cellules deux fois avec du PBS. Répétez l’étape de centrifugation.
    3. Ajouter 500 µL PBS contenant 50 µg/mL nucleic acid tacher l’iodure de propidium, 0,1 % Triton X-100 et 1 µg/mL RNase A aux cellules et bien mélanger. Incuber les cellules pendant 15 min à 37 ° C.
    4. Conserver les échantillons à 4 ° C jusqu'à l’analyse par cytométrie.
  3. Immunoprécipitation de protéine Rb endogène.
    1. Prepare la HEK293 lysats de cellules.
      1. Lyse les cellules HEK293 synchronisées doucement, re-suspension eux dans 1 mL de tampon de lyse dosage (RIPA) glacee radio-immunoprécipitation (tableau 1) fraîchement ajouté 20 mM N-éthylmaléimide, un inhibiteur de l’isopeptidase qui pourrait bloquer les protéases SUMO et stabiliser SUMO conjugués.
      2. Encore homogénéiser les cellules sur la glace selon Dounce homogénéisation, sonication ou simplement au travers de 10 fois à travers une aiguille 21 G, attachée sur une seringue de 2 mL. Puis, incuber les cellules sur la glace pendant 5 min.
        Remarque : Le dodécylsulfate de sodium détergent anionique (SDS) dans la mémoire tampon RIPA est crucial pour la détermination ultérieure de la Rb-SUMO, car il pourrait éliminer le signal SUMO imprécis qui est dérivé de l’interaction non covalentes entre la protéine Rb et d’autres non-Rb SUMO-espèce.
    2. Centrifuger les lysats cellulaires à 18 000 x g pendant 30 min à 4 ° C. transférer les surnageants dans de nouveaux tubes de micro-centrifugeuse de 1,5 mL.
      Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. Les protéines peuvent être stockées à-80 ° C pendant au moins 6 mois.
    3. Pour préparer le contrôle d’entrée de chaque échantillon la tache occidentale plus tard, enregistrer une petite partie du liquide surnageant décrite ci-dessus dans un nouveau tube et les conserver à -80 ° C.
    4. Pour le cas ci-dessus, ajouter 1 µg d’immunoglobulines non spécifiques souris G (IgG) de la même espèce et isotype comme l’anticorps monoclonal de Rb et 20 µL du lisier de 50 % protéine A/G-Sépharose. Puis, incuber pendant 1 heure à 4 ° C, avec une légère rotation.
    5. Centrifuger les échantillons à 3 000 x g pendant 3 min à 4 ° C. soigneusement recueillir le surnageant sans déranger les perles et de les transférer dans de nouveaux tubes de micro-centrifugeuse de 1,5 mL. Pour chaque échantillon, ajouter 5 µL Rb l’anticorps primaire et 40 µL de 50 % de protéine A/G-Sépharose lisier. Puis, incuber une nuit à 4 ° C, avec une légère rotation.
    6. Recueillir les perles par centrifugation à 3 000 x g pendant 3 min à 4 ° C et retirer délicatement le surnageant de pipetage. Notez que pour éviter la perte de la perle, ne pas aspirer le perles sec.
    7. Laver les billes quatre fois avec 1 mL de tampon RIPA. Chaque fois, les tubes bien mélanger en rotation à 4 ° C pendant 15 min. collecter les perles par centrifugation à faible vitesse à 3 000 x g pendant 3 min à 4 ° C et le jeter les surnageants.
    8. Après avoir enlevé les surnageants du lavage final, remettre en suspension les perles dans 30 µL 1 x tampon de chargement électrophorèse (SDS-PAGE) de sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel (tableau 1) et bien mélanger.
      1. Incuber les tubes à 100 ° C, dans une chaleur bloquent pour 10 min. centrifuger les échantillons à 12 000 x g pendant 1 min granuler les perles. Soigneusement recueillir le surnageant sans déranger les perles et de les transférer aux tubes de micro-centrifugeuse de 1,5 mL.
    9. Analyser les échantillons de 4-20 % dégradé SDS-PAGE de gel et Western blot ou stockez-les à-20 ° C pour une utilisation ultérieure.

2. Analyse de 6XHis-tag de SUMOylation de Rb exogène dans les cellules humaines

  1. Cell culture et transfection.
    1. Graines ~ 6 × 10 6 HEK293 cellules dans un 10 cm plat et incuber pendant 24 h dans un milieu de croissance dans des conditions de culture cellulaire normale d’acquérir confluentes à 75-85 %. Avant la transfection, enlevez le milieu de croissance et ajouter 6 mL de sérum réduit préchauffée milieu (voir Table des matières) et puis replacez la vaisselle dans l’incubateur.
    2. Essai de SUMOylation constitutive pour le Rb, ajouter 15 µg de chacun des émetteurs 6XHis Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT et plasmides Ubc9-C93S dans 500 µL de milieu de sérum réduit en tubes de 1,5 mL de micro-centrifuge, respectivement.
      1. Pour analyser la conjugaison-SUMO de type sauvage Rb et son mutant de SUMOylation défectueux, mélanger 10 µg de chaque plasmide de Rb-WT ou Rb-K720R 6XHis-tag avec GFP-SUMO1 (10 µg) dans 500 µL réduit moyen de sérum dans 1,5 mL micro-centrifugeuse tubes de 13.
    3. Pendant ce temps, dans une éprouvette, mélanger 50 µL de réactif de transfection (voir Table des matières) dans 500 µL réduit moyen de sérum et incuber à température ambiante pendant 5 min.
    4. Entièrement combinent les deux tubes distincts décrits ci-dessus et incuber à température ambiante pendant 15 min. ajouter la transfection des complexes de réactif/plasmide dans les cellules et continuer à la culture pour 8 h-5 % CO 2 et 37 ° C.
    5. Remplacer le moyen de sérum réduit avec le milieu de croissance et incuber les cellules dans des conditions de culture normale pendant 48 h après la transfection.
  2. Nickel déroulant affinité de la protéine Rb-le tag 6XHis.
    1. Lyser les cellules HEK293 transfectées et extraire les protéines totales, comme le décrit la Section 1.3.1.
    2. Centrifuger les lysats cellulaires à 18 000 x g pendant 30 min à 4 ° C. soigneusement collecter les surnageants et transférez-la sur tubes propres.
      Remarque : La protéine peut être figée à ce point pendant plus de 6 mois à -80 ° C.
    3. Pour préparer le contrôle d’entrée de chaque échantillon la tache occidentale plus tard, sauver une petite partie des surnageants décrites ci-dessus pour un nouveau tube et conserver à -80 ° C.
    4. Lavage 25 µL de 50 % de nickel nitrilotriacétique acides perles de gel d’agarose (Ni-NTA) avec un tampon RIPA deux fois dans un tube à centrifuger-micro 1,5 mL pour chaque échantillon. Collecter les perles par centrifugation à 3 000 x g pendant 3 min à 4 ° C.
    5. Ajouter 1 M imidazole à chaque échantillon pour obtenir une concentration finale de 10 mM. Puis, ajoutez chaque échantillon dans le tube contenant les billes de gel d’agarose préparés Ni-NTA.
    6. Incuber les perles et les lysats pendant 2 h à 4 ° C, avec une légère rotation. Tourner les talons à 3 000 x g pendant 3 min à 4 ° C et retirer délicatement les surnageants de pipetage. Pour éviter la perte de la perle, ne pas aspirer le perles sec.
    7. Laver les billes avec 1 mL de tampon de lavage contenant imidazole de 20 mM (tableau 1). Chaque fois, les tubes bien mélanger en rotation à 4 ° C pendant 15 min. collecter les perles de la filature à 3 000 x g pendant 3 min à 4 ° C et jeter les surnageants.
    8. Après le lavage final, ajouter 30 µL d’élution tampon imidazole contenant de 250 mM (tableau 1) pour chaque échantillon et balayer pour mélanger. Puis, incuber pendant 20 min à 4 ° C pour éluer les protéines.
    9. Mélanger chaque échantillon avec tampon de charge 6 × SDS-PAGE (tableau 1). Puis, incuber les tubes à 100 ° C dans un bloc chauffant pendant 10 min.
    10. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 1 min granuler les perles. Soigneusement recueillir le surnageant sans déranger les perles et transférer les échantillons pour tubes de centrifugeuse-micro 1,5 ml. Les échantillons peuvent être analysés par Western blot ou conservés à-20 ° C pour une utilisation ultérieure.

3. Western Blot

  1. charger l’immunoprécipitation ou tirer vers le bas des échantillons prélevés dans les étapes précédentes sur gel SDS-PAGE dégradé de 4 à 20 %. Procéder à l’électrophorèse à 120 V pendant 90 min séparer les protéines.
  2. Transfert des protéines du gel sur une membrane de polyvinylidène difluoride (PVDF) en electroblotting à 300 mA pendant 90 min à 4 ° C à l’aide de la méthode de transfert du réservoir. Bloquer la membrane en PVDF dans un tampon de bloc contenant 5 % de lait écrémé (tableau 1) pendant 1 h à température ambiante.
  3. Incuber la membrane avec l’anticorps primaire dans un tampon de dilution d’anticorps contenant 3 % d’albumine sérique bovine (BSA) (tableau 1) pour la nuit à 4 ° C. Pour les anticorps primaires, utilisez une travail concentration de 0,5 µg/mL (anticorps anti-SUMO1), ou une dilution de 1 : 2000 (anticorps anti-Rb et anti-tubuline) ou 1:5,000 (anti-GFP et anticorps anti-His).
  4. Laver la membrane 3 x 10 min chaque fois à l’aide de 1 x tampon tris salin avec tampon de Tween (TBST) (tableau 1). Incuber la membrane avec des espèces spécifiques anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort HRP 1:5,000 dilué dans un tampon de bloc contenant 5 % de lait (tableau 1). Laver la membrane 3 x 10 min chaque fois à l’aide de la mémoire tampon x TBST 1.
  5. Incuber la membrane avec la chimiluminescence améliorée (ECL), solution de travail. Couvrir la membrane d’une pellicule plastique et l’exposer à la radiographie en fonction sur la force de signal.

Résultats

Pour détecter endogène Rb SUMOylation au cours de la progression du cycle cellulaire, cette étude a tout d’abord synchronisé cellules HEK293 à cinq stades différents du cycle cellulaire (G0, début G1, G1, S et G2/M) tel que décrit dans la section protocole du présent document. La qualité de synchronisation a été confirmée à l’aide de la tache d’acide nucléique avec l’iodure de propidium suivie d’analyse en cytométrie en flux (Figure 1

Discussion

Cet article décrit un protocole visant à détecter et analyser la SUMOylation endogène de Rb dans les cellules humaines. Comme cette méthode est spécifiquement axée sur la protéine Rb endogène sans aucune modification du signal global de SUMO, c’est un outil important pour enquêter sur les modification de Rb-SUMO dans des circonstances tout à fait naturelles physiologiques.

Pour atteindre cet objectif, il est important de garder à l’esprit que : 1) bien que SUMO comprend quatre...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été financée par des subventions de la Science et la technologie Commission de Shanghai (concession no 14411961800) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Grant no 81300805).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995065
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific31985070
Fetal Bovine Serum (FBS)Thermo Fisher Scientific26140079
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122
Phosphate-buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200056
ThymidineSigmaT9250
NocodazoleSigmaM1404
propidium iodideThermo Fisher ScientificP3566
Triton X-100 AMRESCO694
RNase A Thermo Fisher ScientificEN0531
N-EthylmaleimideSigmaE3876 
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)AMRESCOM107
Nonidet P-40 Substitute (NP-40)AMRESCOM158
protease inhibitorRoche5892970001
Mouse Immunoglobulin G (IgG)Santa Cruz Biotechnologysc-2025
Rb antibodyCell Signaling Technology#9309
Protein A/G-Sepharose BeadsSanta Cruz Biotechnologysc-2003
Lipofectamine-2000 Thermo Fisher Scientific11668019
Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose BeadsQiagen30230
ImidazoleSigmaI0250
4%-20% Gradient SDS-PAGE GelBIO-RAD4561096
Polyvinylidene Difluoride (PVDF) MembraneMilliporeIPVH00010
Tween-20AMRESCOM147
Tubulin antibodyAbmartM30109
SUMO1 antibodyThermo Fisher Scientific33-2044
GFP antibodyAbmartM20004
Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibodyJackson ImmunoResearch Laboratories715-035-150
enhanced chemiluminescence (ECL) KitThermo Fisher Scientific32106

Références

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