Na Vivo Detecção e análise de SUMOylation de proteína Rb em células humanas

Resumo

Família proteínas pequenas relacionadas à ubiquitina modificador (SUMO) são conjugadas aos resíduos de lisina das proteínas alvo regular de vários processos celulares. Este artigo descreve um protocolo para a detecção da proteína do retinoblastoma (Rb) SUMOylation sob condições endógenas e exógenas em células humanas.

Resumo

As modificações pós-tradução de proteínas são essenciais para a regulação adequada da transdução do sinal intracelular. Entre estas modificações, pequeno modificador ubiquitin-relacionados (SUMO) é uma proteína de ubiquitina-como que é covalentemente ligada aos resíduos de lisina de uma variedade de proteínas do alvo para regular os processos celulares, tais como a transcrição do gene, reparo do DNA, proteínas interação e degradação, transporte subcelular e transdução de sinal. A abordagem mais comum para detectar proteínas SUMOylation baseia-se na expressão e purificação de proteínas recombinantes marcadas em bactérias, permitindo uma em vitro reação bioquímica que é simples e adequada para endereçamento mecanicista perguntas. No entanto, devido à complexidade do processo de SUMOylation na vivo, é mais difícil de detectar e analisar proteínas SUMOylation em células, especialmente quando sob condições endógenas. Um estudo recente dos autores deste trabalho revelou que a proteína endógena retinoblastoma (Rb), um supressor de tumor que é vital para a regulação negativa da progressão do ciclo celular, é especificamente SUMOylated na fase inicial do G1. Este artigo descreve um protocolo para a detecção e análise de Rb SUMOylation sob condições endógenas e exógenas em células humanas. Este protocolo é apropriado para a investigação fenotípica e funcional da SUMO-modificação do Rb, bem como muitos outras sumô-alvo proteínas, nas células humanas.

Introdução

O controle exato da progressão do ciclo celular em células eucarióticas é baseado em uma rede reguladora apertada, que garante que determinados eventos ocorrem em uma forma ordenada^1,2. Um dos principais intervenientes nesta rede é a proteína do retinoblastoma (Rb), o primeiro tumor clonado supressor^1,3. A proteína Rb é pensada para ser um regulador negativo da progressão do ciclo celular, especialmente para o G0/G1 para transição de fase S e tumor crescimento^4,5. Falha da função de Rb também diretamente leva à malignidade intraocular mais comum em crianças, retinoblastoma, ou contribui para o desenvolvimento de muitos outros tipos de câncer⁵. Além disso, Rb está envolvido em muitos caminhos celulares incluindo diferenciação celular, cromatina remodelação e apoptose mediada por mitocôndrias^3,6,7.

Modificações borne-translational desempenham um papel crucial na regulação da função de RB^8,9. A fosforilação é a uma tal modificação, e geralmente leva à inactivação de Rb. Nas células quiescentes de G0, Rb está ativo com um nível baixo de fosforilação. Como células de progresso por fase G0/G1 Rb é sequencialmente hiperfosforilada por uma série de quinases proteína cyclin-dependente (CDKs) e ciclinas, como ciclina E/CDK2 e ciclina D/CDK4/6, que inactivate Rb e eliminar sua capacidade de reprimir o ciclo celular relacionados ao gene expressão^4,10. RB também pode ser modificado por pequenas relacionadas à ubiquitina modificador (SUMO)^11,12,13.

SUMÔ é uma proteína do ubiquitin-como que é covalentemente ligada a uma variedade de proteínas do alvo. É crucial para diversos processos celulares, incluindo a regulação do ciclo celular, transcrição, a localização da proteína celular e degradação, transporte e DNA reparo^{14,15,16, 17 , 18}. caminho de conjugação o sumô consiste a enzima ativando dimérica sumô E1 SAE1/UBA2, a única enzima de conjugação E2 Ubc9, múltiplas E3 ligases e proteases específicas sumô. Em geral, proteínas de sumô nascentes devem ser processadas proteoliticamente para gerar a forma madura. O sumô maduro é ativado pelo heterodímero E1 e em seguida, transferido para a enzima E2 Ubc9. Finalmente, a glicina C-terminal do sumô é covalentemente conjugada com o lisina de destino de um substrato, e este processo é geralmente facilitado pela E3 ligases. A proteína de sumô pode ser removida do substrato modificado por proteases específicas. Um estudo anterior pelos autores deste trabalho revelou que SUMOylation de Rb aumenta sua ligação a CDK2, levando a hiperfosforilação na fase inicial do G1, um processo que é necessário para a progressão de ciclo celular¹³. Também demonstramos que a perda de Rb SUMOylation provoca uma proliferação de diminuição da célula. Além disso, recentemente foi demonstrado que o SUMOylation de Rb protege a proteína Rb proteasomal volume, aumentando assim o nível de proteína Rb em células¹⁹. Portanto, SUMOylation desempenha um papel importante na função de Rb em vários processos celulares. Para um estudo mais aprofundado a consequência funcional e relevância fisiológica do Rb SUMOylation, é importante desenvolver um método eficaz para analisar o status de sumô de Rb em células ou tecidos doentes.

SUMOylation é um processo reversível, altamente dinâmico. Assim, é geralmente difícil de detectar as proteínas modificadas de sumô em condições completamente endógenas. Este trabalho apresenta um método para detectar endógena Rb SUMOylation. Além disso, ele mostra como detectar exógena Rb SUMOylation do selvagem-tipo Rb e sua mutação de sumô-deficientes¹¹. Em particular, Jacobs et al descreveram um método para aumentar a modificação de sumô de um determinado substrato especificamente por fusão-dirigido Ubc9 SUMOylation (UFDS)²⁰. Com base neste método, este protocolo descreve como analisar o SUMOylation forçada de Rb e suas consequências funcionais. Tendo em conta que centenas de substratos de sumô têm sido descritas anteriormente e foram identificados mais substratos de sumô putativos de muitos ensaios baseados em proteômica, este protocolo pode ser aplicado para analisar a sumô-modificação destas proteínas em células humanas.

Protocolo

1. deteção de Rb endógena SUMOylation na fase inicial do G1

1. celular sincronização entre cultura e ciclo celular.
   1. HEK293 manter as células em um meio contendo Dulbecco ' s Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 1% caneta-Strep e 10% fetal de soro bovino (FBS) a 37 ° C e 5% CO ₂ em uma incubadora.
   2. Sincronizar as células HEK293 na fase G0.
      1. a contagem das células HEK293 usando um hemocytometer e sementes ~1.5 x 10 ⁷ células em um 15 cm do prato com 25 ml de meio de crescimento por 24 h antes do tratamento. Depois de atingir uma confluência de aspirado de 70-80%, a médio e a lavagem das células duas vezes com 5 mL pré-aquecido tampão fosfato salino (PBS).
      2. Adicionar 25 mL DMEM contendo 1% penicilina-estreptomicina e incube as celulas a 37 ° C por 72 h. lavar as células no prato usando 3 mL PBS gelado. As células de transferência para um novo tubo de 5 mL.
      3. Assunto uma pequena porção de células para análise de ciclo celular por citometria de fluxo (etapa 1.2); recolher a maioria remanescente das células por centrifugação a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente e em seguida, armazene-os em um freezer de ultra baixa temperatura até análise de Rb SUMOylation.
   3. Para obter a fase G1 células, no final do processo de sincronização de G0, remover o DMEM e adicionar meio de crescimento volta fresca, permitindo assim que as células HEK293 para re-introduzir o ciclo celular. Em seguida, recolher as células em diferentes fases do G1 (G1 início: 30 min; G1: 2 h) para o ciclo celular, análise e sumô mais ensaio.
   4. Sincronizar as células HEK293 na fase S, usando o método de bloco duplo-timidina. Células
      1. células HEK293 crescer para uma confluência de 50% e lavagem com PBS escaldadas. Em seguida, adicione o meio de cultura suplementado com timidina de 2,5 mM para 18 h (primeiro bloco).
      2. Remover o meio contendo timidina e depois lavar as células duas vezes com PBS escaldadas. Adicionar o meio de cultura fresco para 14 h liberar as células.
      3. Descartar o meio com uma pipeta e adicionar o meio de cultura suplementado com timidina de 2,5 mM para outro 18 h (segundo bloco) antes de realizar uma análise do ciclo celular e Rb SUMOylation.
   5. Sincronização para o G2/M, placa ~1.5 × 10 ⁷ HEK293 as células para um prato de 15 cm com 25 mL de meio de crescimento por 24 h. Em seguida, adicione nocodazole ao meio, até à obtenção de uma concentração final de 400 ng/mL. Finalmente, Incube as celulas para 16 h antes de realizar a análise do ciclo celular e Rb SUMOylation.
2. Análise de ciclo celular por citometria de fluxo.
   1. Re-suspender o HEK293 sincronizado em PBS e então consertar a suspensão de células usando etanol a 70% gelado por 2 h em 4 ° C. Observe que para minimizar a célula de clustering, a suspensão de célula Adicionar gota a gota o etanol 100% gelada para obter uma concentração final de etanol a 70% enquanto suavemente num Vortex.
   2. Centrifugar as células por 5 min a 500 x g, então, cuidadosamente, desprezar o sobrenadante e lavar as células duas vezes com PBS. Repita a etapa centrifuga.
   3. Adicionar 500 µ l de PBS contendo 50 µ g/mL ácido nucleico mancha iodeto de propidium, 0.1% Triton X-100 e 1 µ g/mL RNase A para as células e misture bem. Incubar as células durante 15 minutos a 37 ° C.
   4. Armazenar as amostras em 4 ° C até análise por citometria de fluxo.
3. Imunoprecipitação da proteína endógena Rb. Lisados celulares de
   1. preparar a HEK293.
      1. Lyse as células HEK293 sincronizadas, gentilmente re-suspendendo-os em 1 mL de tampão de lise de ensaio (RIPA) rádio-imunoprecipitação gelada (tabela 1) contendo recém adicionado 20 mM N-proteÃ, um inibidor de isopeptidase que poderia bloquear proteases de sumô e estabilizar o cojugado sumô.
      2. Mais homogeneizar as células no gelo por homogenizacao homogeneização, sonication ou simplesmente passando por 10 vezes através de uma agulha 21G anexada em uma seringa de 2 mL. Incubar em seguida, as células no gelo por 5 min.
         Nota: O aniônico detergente Dodecil sulfato de sódio (SDS) no buffer de RIPA é crucial para a posterior determinação do Rb-sumô, como ele poderia eliminar o sinal de sumô inespecíficos que é derivado da interação entre a proteína Rb e outros não-covalente SUMÔ-espécie de não-Rb.
   2. Centrifugar os lisados celulares a 18.000 x g durante 30 min a 4 ° C. transferir os sobrenadantes para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
      Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. As proteínas podem ser armazenadas a-80 ° C durante pelo menos 6 meses.
   3. Para preparar o controle de entrada de cada amostra para posterior Western blot, salvar uma pequena porção do líquido sobrenadante descritas acima para um novo tubo e conservar a -80 ° C.
   4. Para os sobrenadantes acima, adicionar 1 µ g de rato específico da imunoglobulina G (IgG) da mesma espécie e isotype como o anticorpo monoclonal de Rb e 20 µ l de pasta de um/G-sepharose 50% proteína. Em seguida, incubar durante 1 h a 4 ° C, com rotação suave.
   5. Centrifugar as amostras a 3.000 x g por 3 min a 4 ° C. cuidadosamente coletar os sobrenadantes sem perturbar os grânulos e transferi-los para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Para cada uma das amostras, adicione 5 anticorpo primário da Rb µ l e 40 µ l de 50% de proteína um/G-sepharose chorume. Em seguida, incubar durante uma noite a 4 ° C, com rotação suave.
   6. Recolher os grânulos por centrifugação a 3.000 x g, durante 3 min a 4 ° C e remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem. Observe que, para evitar perda de talão, não Aspire o seco grânulos.
   7. Lave os grânulos quatro vezes com 1 mL de tampão de RIPA. Sempre, misturar os tubos bem pela rotação-los a 4 ° C, durante 15 min. recolher os grânulos por centrifugação de baixa velocidade a 3.000 x g durante 3 minutos a 4 ° C e em seguida, descartar os sobrenadantes.
   8. Após retirar sobrenadantes da lavagem final, re-suspender as contas em 30 µ l 1 x amortecedor do carregamento do sódio Dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida gel de eletroforese (SDS-PAGE) (tabela 1) e misture bem.
      1. Incubar os tubos a 100 ° C, em um calor bloqueiam por 10 min. Centrifugar as amostras a 12.000 x g por 1 min granular os grânulos. Cuidadosamente coletar os sobrenadantes sem perturbar os grânulos e transferi-los para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
   9. Analisar as amostras por 4% - 20% gradiente SDS-PAGE gel e Western blot ou armazená-los em-20 ° C para uso posterior.

2. Análise de 6XHis-tag exógena Rb SUMOylation em células humanas

1. cultura e transfecção celular.
   1. Semente ~ 6 × 10 ⁶ HEK293 células em um de 10 cm do prato e incubam por 24 h no meio de crescimento sob condições de cultura celular normal para adquirir 75% - 85% confluentes. Antes de transfeccao, remover o meio de crescimento e adicionar 6 mL de meio de escaldadas soro reduzida (ver Tabela de materiais) e, em seguida, coloque os pratos para a incubadora.
   2. Ensaio de SUMOylation constitutivo para o Rb, adicione µ g 15 cada do 6XHis-tag Rb-Ubc9-WT, Rb-Ubc9-C93S, Ubc9-WT e plasmídeos Ubc9-C93S 500 médio / µ l soro reduzida em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL, respectivamente.
      1. Para analisar a sumô-conjugação de tipo selvagem Rb e seu mutante SUMOylation com defeito, misture 10 µ g de qualquer plasmídeo com tag 6XHis Rb-WT ou Rb-K720R juntamente com GFP-SUMO1 (10 µ g) em 500 µ l reduzida média de soro em microcentrífuga de 1,5 mL tubos de ¹³.
   3. Enquanto isso, em um tubo separado, misturar o reagente de Transfeccao de 50 µ l (veja a Tabela de materiais) em 500 µ l reduzida média de soro e incubar a temperatura ambiente por 5 min.
   4. Totalmente combinar os dois tubos separados descritos acima e incubar a temperatura ambiente por 15 min. Adicionar o transfeccao complexos de reagente/plasmídeo para as células e continuar a cultura para 8 h em 5% de CO ₂ e 37 ° C.
   5. Substituir soro reduzida medium com meio de cultura e incube as células sob condições normais de cultura durante 48 h depois do transfection.
2. Níquel afinidade puxa para baixo da proteína Rb com tag 6XHis.
   1. Lisar as células HEK293 transfectadas e extrair as proteínas totais como descrita seção 1.3.1.
   2. Centrífuga os lisados celulares a 18.000 x g durante 30 min à 4 ° C. cuidadosamente coletar os sobrenadantes e transferi-los para limpos tubos.
      Nota: A proteína pode ser congelada neste momento por mais de 6 meses a -80 ° C.
   3. Para preparar o controle de entrada de cada amostra para posterior Western blot, salvar uma pequena porção dos sobrenadantes descrito acima para um novo tubo e conservar a -80 ° C.
   4. Lavagem de 25 µ l de 50% de níquel nitrilotriacético ácidos grânulos de agarose (Ni-NTA) com buffer de RIPA duas vezes em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para cada amostra. Recolher os grânulos por centrifugação a 3.000 x g por 3 min a 4 ° C.
   5. Imidazol adicionar 1 M para cada amostra para obter uma concentração final de 10 mM. Em seguida, adicione cada amostra para o tubo contendo os grânulos de agarose preparados Ni-NTA.
   6. Incubar os grânulos e os lysates durante 2 h a 4 ° C, com rotação suave. Girar os grânulos a 3.000 x g por 3 min a 4 ° C e Retire cuidadosamente os sobrenadantes pipetando. Para evitar perda de talão, não Aspire o seco grânulos.
   7. Lave os grânulos com 1 mL de tampão de lavagem contendo imidazole 20mm (tabela 1). Cada vez, misturar os tubos bem pela rotação a 4 ° C, durante 15 min. coletar os grânulos girando a 3.000 x g por 3 min a 4 ° C e descartar os sobrenadantes.
   8. Após a lavagem final, adicionar 30 µ l de eluição do buffer contendo imidazole 250 mM (tabela 1) para cada amostra e agite para misturar. Em seguida, incubar por 20 min a 4 ° C para eluir as proteínas.
   9. Misturar cada amostra com tampão de carregamento 6 × SDS-PAGE (tabela 1). Em seguida, incubar os tubos a 100 ° C, em um bloco de calor durante 10 min.
   10. Centrifugar a 12.000 x g por 1 min granular os grânulos. Cuidadosamente coletar os sobrenadantes sem perturbar os grânulos e transferir as amostras para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. As amostras podem ser analisadas por Western blot ou armazenadas a-20 ° C para uso posterior.

3. Western Blot

1. carregar a imunoprecipitação ou puxar para baixo as amostras obtidas das etapas anteriores para gradientes geles de SDS-PAGE 4-20%. Realizar a eletroforese em 120 V para 90 min separar as proteínas.
2. Transferir as proteínas do gel para uma membrana (PVDF) de difluoreto de polivinilideno por eletroblotting a 300 mA para 90 min a 4 ° C, usando o método de transferência do tanque. Bloquear a membrana PVDF no buffer do bloco que contém leite desnatado 5% (tabela 1) por 1h à temperatura ambiente.
3. Incubar a membrana com anticorpo primário em tampão de diluição de anticorpo contendo 3% albumina de soro bovino (BSA) (tabela 1) durante a noite a 4 ° C. Para os anticorpos primários, usar uma concentração de trabalho de 0,5 µ g/mL (anticorpo anti-SUMO1), ou uma diluição de 1: 2000 (anticorpos anti-Rb e antitubulina) ou 1:5,000 (anti-GFP e anticorpo antisua).
4. Lavar a membrana 3 x por 10 min cada tempo usando 1x tris salino com buffer Tween (TBST) (tabela 1). Incube a membrana com espécie específica de anticorpos secundarios conjugados a HRP Peroxidase de rábano 1:5,000 diluído em tampão de bloco contendo leite desnatado 5% (tabela 1). Lavar a membrana 3 x por 10 min cada vez usando 1 buffer x TBST.
5. Incubar a membrana com quimioluminescência reforçada (ECL) solução de trabalho. Cobrir a membrana com o envoltório plástico e expô-la a película de raio x, dependendo da força do sinal.

Resultados

Para detectar endógena Rb SUMOylation durante a progressão do ciclo celular, este estudo primeiro sincronizado células HEK293 em cinco diferentes fases do ciclo celular (G0, cedo G1, G1, S e G2/M) conforme descrito na seção de protocolo deste documento. A qualidade de sincronização foi confirmada usando a mancha de ácido nucleico com iodeto de propidium seguido por análise de citometria de fluxo (Figura 1). Em seguida, as células foram coletadas e l...

Discussão

Este artigo descreve um protocolo para detectar e analisar as SUMOylation endógena de Rb em células humanas. Como esse método é especificamente orientado para a proteína endógena Rb sem qualquer alternância de sinal global de sumô-relacionados, é uma importante ferramenta para a investigação de modificação de Rb-sumô sob circunstâncias fisiológicas completamente naturais.

Para atingir este objectivo, é importante ter em mente que: 1) apesar de sumô compreende quatro isoformas...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	11995065
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	31985070
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	26140079
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
Thymidine	Sigma	T9250
Nocodazole	Sigma	M1404
propidium iodide	Thermo Fisher Scientific	P3566
Triton X-100	AMRESCO	694
RNase A	Thermo Fisher Scientific	EN0531
N-Ethylmaleimide	Sigma	E3876
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	AMRESCO	M107
Nonidet P-40 Substitute (NP-40)	AMRESCO	M158
protease inhibitor	Roche	5892970001
Mouse Immunoglobulin G (IgG)	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025
Rb antibody	Cell Signaling Technology	#9309
Protein A/G-Sepharose Beads	Santa Cruz Biotechnology	sc-2003
Lipofectamine-2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads	Qiagen	30230
Imidazole	Sigma	I0250
4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel	BIO-RAD	4561096
Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane	Millipore	IPVH00010
Tween-20	AMRESCO	M147
Tubulin antibody	Abmart	M30109
SUMO1 antibody	Thermo Fisher Scientific	33-2044
GFP antibody	Abmart	M20004
Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody	Jackson ImmunoResearch Laboratories	715-035-150
enhanced chemiluminescence (ECL) Kit	Thermo Fisher Scientific	32106