In Vivo Detektion und Analyse von Rb Protein Sumoylierung in menschlichen Zellen

Zusammenfassung

Kleine Ubiquitin-bezogene Modifikator (SUMO) Familie Proteine sind an Lysin-Reste von Zielproteine, verschiedene zelluläre Prozesse regulieren konjugiert. Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für den Nachweis von Retinoblastom (Rb) Protein Sumoylierung endogene und exogene Bedingungen in menschlichen Zellen.

Zusammenfassung

Die post-translationalen Modifikationen von Proteinen sind entscheidend für die richtige Regulierung der intrazellulären Signaltransduktion. Unter diesen Änderungen ist kleine Ubiquitin-bezogene Modifikator (SUMO) ein Ubiquitin-wie Protein, das die Lysin-Rückstände verschiedener Zielproteine zu regulieren zelluläre Prozesse wie Gentranskription, DNA-Reparatur, Protein kovalent verbunden ist Interaktion und Abbau, subzelluläre Transport und Signaltransduktion. Die gängigste Methode zur Erkennung von Protein Sumoylierung basiert auf den Ausdruck und die Reinigung von rekombinanten tagged Proteinen in Bakterien, so dass für eine in-vitro- biochemische Reaktion, die ist einfach und eignet sich für den Umgang mit mechanistischen Fragen. Aufgrund der Komplexität des Prozesses der Sumoylierung in Vivoist es jedoch schwieriger zu erkennen und zu analysieren, Protein Sumoylierung in Zellen, vor allem unter endogenen Bedingungen. Eine aktuelle Studie von den Autoren dieses Artikels ergeben, dass endogene Retinoblastom (Rb) Protein, ein Tumorsuppressor, die entscheidend für die negative Regulierung des Zellzyklus Progression, speziell sumoyliert in der frühen G1-Phase. Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll für die Erkennung und Analyse von Rb Sumoylierung endogene und exogene Bedingungen in menschlichen Zellen. Dieses Protokoll eignet sich für die phänotypische und funktionelle Untersuchung der SUMO-Änderung der Rb, sowie viele andere SUMO-gezielte Proteine in menschlichen Zellen.

Einleitung

Die genaue Steuerung der Zellzyklus Progression in eukaryontischen Zellen beruht auf einer engen regulatorischen Netzwerk sorgt dafür, dass bestimmte Ereignisse in einer geordneten Art und Weise^1,2stattfinden. Einer der wichtigsten Akteure in diesem Netzwerk ist das Retinoblastom (Rb)-Protein, das erste geklonte Tumorsuppressor^1,3. Das Rb-Protein wird angenommen, dass ein negativer Regulator der Zellzyklus Progression, vor allem für die G0/G1 S Phasenübergang und Tumor Wachstum^4,5. Ausfall der

Protokoll

1. Erkennung von endogenen Rb Sumoylierung in der Frühphase G1

1. Zell-Kultur und Zellzyklus Synchronisation.
   1. Pflegen HEK293 Zellen im Dulbecco-haltigem Wachstumsmedium ' s Modified Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 1 % Pen-Strep und 10 % fetalen bovine Serum (FBS) bei 37 ° C und 5 % CO ₂ in einem Inkubator.
   2. Synchronisieren der HEK293 Zellen in der G0-Phase.
      1. Zählen die HEK293 Zellen mit einem Hemocytometer und Samen ~1.5 X 10 ⁷ Zellen in ein 15 cm mit 25 ml Wachstumsmedium für 24 h vor der Behandlung Schüssel. Nach dem Erreichen eines Zusammenfluss von 70-80 %, Absaugen, Medium und waschen

Ergebnisse

Um endogene Rb Sumoylierung während Zellzyklus Progression zu erkennen, synchronisiert diese Studie zunächst HEK293 Zellen in fünf verschiedenen Phasen des Zellzyklus (G0, frühe G1, G1, S und G2/M), wie im Abschnitt "Protokoll" dieses Artikels beschrieben. Die Qualität der Synchronisation wurde bestätigt, indem die Nukleinsäure-Fleck mit Propidium Jodid gefolgt von Flow-Zytometrie-Analyse (Abbildung 1). Als nächstes wurden die Zellen gesammelt und dur...

Diskussion

Dieses Whitepaper beschreibt ein Protokoll zum erkennen und analysieren der endogenen Sumoylierung Rb in menschlichen Zellen. Da diese Methode speziell auf das endogene Rb-Protein ohne jede Abwechslung der globalen SUMO-bezogenen Signal ausgerichtet ist, ist es ein wichtiges Instrument für die Untersuchung von Rb-SUMO Modifikation unter völlig natürlichen physiologischen Umständen.

Um dieses Ziel zu erreichen, ist es wichtig, im Hinterkopf behalten, dass: 1) Obwohl SUMO vier Isoformen (SUM...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	11995065
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	31985070
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	26140079
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122
Phosphate-buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200056
Thymidine	Sigma	T9250
Nocodazole	Sigma	M1404
propidium iodide	Thermo Fisher Scientific	P3566
Triton X-100	AMRESCO	694
RNase A	Thermo Fisher Scientific	EN0531
N-Ethylmaleimide	Sigma	E3876
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	AMRESCO	M107
Nonidet P-40 Substitute (NP-40)	AMRESCO	M158
protease inhibitor	Roche	5892970001
Mouse Immunoglobulin G (IgG)	Santa Cruz Biotechnology	sc-2025
Rb antibody	Cell Signaling Technology	#9309
Protein A/G-Sepharose Beads	Santa Cruz Biotechnology	sc-2003
Lipofectamine-2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose Beads	Qiagen	30230
Imidazole	Sigma	I0250
4%-20% Gradient SDS-PAGE Gel	BIO-RAD	4561096
Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membrane	Millipore	IPVH00010
Tween-20	AMRESCO	M147
Tubulin antibody	Abmart	M30109
SUMO1 antibody	Thermo Fisher Scientific	33-2044
GFP antibody	Abmart	M20004
Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibody	Jackson ImmunoResearch Laboratories	715-035-150
enhanced chemiluminescence (ECL) Kit	Thermo Fisher Scientific	32106