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要約

小さなユビキチン関連の修飾子 (相撲) ファミリー蛋白質は様々 な細胞プロセスを調整するターゲット蛋白質のリジン残基に抱合します。本稿では、rb タンパク質 sumo 化ひと細胞の内因性と外因性の条件下での検出のためのプロトコルについて説明します。

要約

タンパク質の翻訳後修飾は、細胞内シグナル伝達の適切な規則のために重要です。これらの変更の間で小さなユビキチン関連の修飾子 (相撲) は様々 な遺伝子の転写、DNA 修復、タンパク質などの細胞プロセスを調整するターゲットたんぱく質のリジン残基に共有結合で結合されているユビキチン様タンパク質相互作用と低下、細胞内輸送、およびシグナル伝達。タンパク質 sumo 化を検出する最も一般的な方法は、体外で生化学的反応は、シンプルで機械的に対処するために適しているを可能にする、細菌の遺伝子組換えの付けられた蛋白質の浄化、表現に基づいてください。質問。しかし、生体内でsumo 化のプロセスの複雑さのためそれは検出細胞、特に内因性条件下で sumo 化阻害を分析してより困難です。この論文の著者らによる最近の研究では、内因性網膜芽細胞腫 (Rb) 蛋白質、細胞周期の進行の負の調節に不可欠である腫瘍のサプレッサーでは、G1 初期の特に SUMOylated を明らかにしました。本稿では、検出とひと細胞の内因性と外因性の条件下で Rb sumo 化の分析のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは多く他相撲ターゲット蛋白質、ヒトの細胞と同様に、Rb、SUMO 化の表現型および機能調査に適しています。

概要

真核細胞の細胞周期の進行の正確な制御は、順序付けられた方法1,2で特定のイベントが起こることにより、タイトな規制のネットワークに基づいています。このネットワークの主要なプレーヤーの 1 つは、最初のクローンとして作られた腫瘍サプレッサー1,3(Rb) 網膜芽細胞腫タンパク質です。Rb タンパク質は、細胞周期の進行、特に S 相転移と腫瘍成長4,5に G0/G1 のための負の調節因子と考えられています。Rb 機能のエラーどちらかに直結する子供たちは、最も一般的な眼内悪性腫瘍、網膜芽細胞腫または癌5の他の多くのタイプの開発に貢献。また、Rb は、細胞の分化、クロマチン再構築、およびミトコンドリアを介したアポトーシス3,6,7を含む多くの携帯電話経路に関与しています。

ポスト翻訳の修正は、RB 関数8,9の調節に重要な役割を果たします。リン酸化はこのような 1 つの変更、それは通常 Rb 不活化につながります。Rb は、静止の G0 細胞低リン酸化レベルでアクティブ。G0/G1 期で細胞、Rb は順番にハイパー-リン酸化 Rb を不活性化し、細胞周期を抑制する能力を排除するサイクリン E/CDK2 とサイクリン D/CDK4/6 などのサイクリンとサイクリン依存性キナーゼ (Cdk) のシリーズで関連の遺伝子式4,10。Rb は、小さなユビキチン関連の修飾子 (相撲)11,12,13で変更でした。

相撲は、様々 な標的タンパク質に共有されているユビキチン様タンパク質です。それは細胞周期制御を含む多様な細胞プロセスのために重大、転写、タンパク質局在と劣化、トランスポート、および DNA 修復14,15,16,17,18.、相撲活用経路から成っている二量体相撲 E1 活性化酵素 SAE1/UBA2、単一の E2 抱合酵素 Ubc9、複数の E3 リガーゼ、相撲特定プロテアーゼ。一般的に、成熟したフォームを生成する生初期の相撲の蛋白質を処理しなければなりません。成熟した相撲は E1 ヘテロダイマーによって活性化し、E2 酵素 Ubc9 に転送します。最後に、相撲の C 末端のグリシンは、基板ターゲット リジンに共役したし、このプロセスは通常 E3 リガーゼによって促進されます。SUMO タンパク質は、特定のプロテアーゼによって変更された基板から削除できます。本稿の著者による前の調査では、Rb の sumo 化に対して、G1 期は細胞周期進行13に必要なプロセスにおけるハイパー リン酸化につながる CDK2、バインディングを増加することを明らかにしました。我々 はまた、Rb sumo 化の損失が減少した細胞の増殖を引き起こすことを示した。また、最近 Rb sumo 化を保護すること Rb タンパク質プロテアソーム売り上げ高からこうして細胞19Rb 蛋白のレベルを上げることが示された.したがって、sumo 化は、様々 な細胞プロセスの Rb 機能に重要な役割を果たしています。Rb sumo 化の生理学的な関連性と機能的な結果の研究をするひと細胞または忍耐強いティッシュで Rb の相撲状態を分析する手法を開発することが重要です。

Sumo 化リバーシブル、非常にダイナミックなプロセスであります。したがって、通常完全に内因性の条件下で相撲修正された蛋白質を検出することは困難です。内因性 Rb sumo 化を検出する手法を提案します。さらに、それは、その相撲欠損変異11および野生型 Rb の外因性の Rb sumo 化を検出する方法を示します。特に、ジェイコブスらは Ubc9 融合監督 sumo 化 (UFD)20によって指定された基質の SUMO 化を増加させる方法を説明します。この方法に基づき、この議定書は Rb の強制 sumo 化とその機能の結果を分析する方法をについて説明します。相撲基板の何百もを以前に記載されているより多くの推定される相撲基板が多くプロテオミクスに基づく試金から識別されている、このプロトコルはひと細胞のこれらの蛋白質の SUMO 化を分析する適用できます。

プロトコル

1 G1 期における内因性 Rb sumo 化の検出

  1. 細胞培養と細胞周期同期。。
    1. ダルベッコを含んでいる成長媒体の維持 HEK293 細胞 ' s 修正イーグル培 (DMEM) 1% ペン連鎖球菌と 10% 牛胎児血清 (FBS) 37 ° C、5% CO 2 インキュベーターで
      2. 。
    2. は、G0 段階で HEK293 細胞を同期します。
      1. 15 cm で、検定と種子 ~1.5 x 10 7 細胞を用いた HEK293 細胞治療前に、24 h の 25 ml の培地で皿数。媒体および洗浄 70%-80%、吸引の合流点に達した後、セル 2 回 5 ml prewarmed リン酸緩衝生理食塩水 (PBS).
      2. 25 mL 1% を含む DMEM を追加しペニシリン-ストレプトマイシンと 72 h 洗浄を 3 mL の氷冷 PBS を使用するプレートからの 37 ° C でセルを孵化させなさい。新しい 5 mL チューブにセルを転送します
        3. 。
      3. フローサイトメトリー (ステップ 1.2) によって細胞周期解析細胞のごく一部の対象;、室温で 5 分間 200 × g で遠心分離によって細胞の残りの大半を収集し、分析まで超低温冷凍庫で保存Rb わかった
        4. 。
    3. G1 期を取得する G0 同期プロセスの終わりに、セル、DMEM を削除し、HEK293 細胞が細胞周期を再入力できるように戻って新鮮な培を追加。さまざまな G1 段階で細胞を収集 (早い G1: 30 分まで。G1: 2 h) 細胞周期の解析、さらに相撲アッセイします
      4. 。
    4. 二重チミジン ブロック法を用いた S 相 HEK293 細胞を同期します。
      1. 成長 HEK293 細胞を十分に洗うと 50% の confluency prewarmed PBS のセルです。18 h (最初のブロック) のための 2.5 mM のチミジン成長培を加えます
        2. 。
      2. は、チミジンを含む培地を取り除き、prewarmed PBS で 2 回細胞を洗います。セルを解放する 14 時間、新鮮な成長媒体を追加します
        3. 。
      3. ピペットで培地を除去し、細胞周期と Rb sumo 化の分析を行う前に別 18 h (第 2 ブロック) の 2.5 mM チミジンを添加した培を追加します
        4. 。
    5. G2/M の同期、24 h の 25 mL の培地で 15 cm 皿プレート ~1.5 × 10 7 HEK293 細胞。媒体に追加ノコダゾール 400 ng/mL の最終濃度が得られるまで。最後に、Rb sumo 化と細胞周期の分析を実施する前に 16 時間細胞をインキュベートします
      6. 。
  2. フローサイトメトリーを用いた細胞周期解析。
    1. 、PBS に再同期 HEK293 を中断し、4 で 2 時間冷えた 70% エタノールを使用して細胞懸濁液を修正し、° C セルのクラスタ リングを最小限に抑えるの最終的な集中を取得し、冷えた 100% エタノールに細胞懸濁液を滴下し追加することに注意してください軽くボルテックス中 70% エタノール
      2. 。
    2. は、500 × g で 5 分間細胞を遠心し、慎重に上澄みを廃棄し、PBS で 2 回細胞を洗浄します。遠心分離機の手順を繰り返します
      3. 。
    3. 追加 500 μ L の PBS 含む 50 μ G/ml 核酸染色 propidium ヨウ化、セルに 0.1% トリトン X-100 と 1 μ g/mL RNase A とよく混ぜます。37 で 15 分細胞をインキュベート ° C
    4. フローサイトメトリーによる解析まで 4 ° c のサンプルを格納します
      5. 。
  3. Rb の内因性のタンパク質の免疫沈降。
    1. 準備、HEK293 細胞溶解液。
      1. 優しく再冷たい免疫検定法 (RIPA) 換散バッファー (表 1) の 1 mL の新鮮なを含んでいるそれらを停止することによって同期 HEK293 細胞追加 20 mM が isopeptidase 阻害剤 N-エチルマレイミド Lyse相撲プロテアーゼをブロックし、相撲の抱合体を安定させる
        2. 。 さらに
      2. Dounce 均質化、超音波または単に通過を 10 回 2 mL 注射器に付いている 21 G 針による氷の細胞をホモジナイズしてください。その後、5 分間氷の上細胞をインキュベート
        注: 陰イオン洗剤ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) RIPA バッファーでは Rb タンパク質とその他の非共有結合相互作用から派生した非特異的相撲信号を除去できれば、Rb 相撲の後の決定のために重要非 Rb 相撲種
        3. 。
    2. 4 セル lysates 30 分 18,000 × g で遠心分離機 ° C が培養上清を新しい 1.5 mL マイクロ遠心チューブに転送します
      。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。タンパク質は、少なくとも 6 ヶ月間-80 ° c 格納できます
      3. 。
    3. 新しいチューブと-80 で店に上述した上澄みのごく一部を保存後の西部のしみの各サンプルの入力コントロールを準備をする ° C
    4. 上清にモノクローナル抗体の Rb 抗体と 50% 蛋白質 A/G-セファローズ スラリーの 20 μ L 1 μ g のマウスの非特異的免疫グロブリン G (IgG) の同じ種とアイソタイプを追加。その後、緩やかな回転で 4 ° C で 1 時間インキュベートします
      5. 。
    5. 4時 3 分 3,000 x g でサンプルを遠心分離機 ° c、ビーズを乱すことがなく培養上清を収集し、それらを新しい 1.5 mL マイクロ遠心チューブに転送します。各サンプルに 5 μ L Rb 一次抗体と 50% 蛋白質 A/G-セファローズ スラリーの 40 μ L を追加します。その後、緩やかな回転で 4 ° C で一晩インキュベートします
      6. 。
    6. は、4 ° C で 3 分間 3,000 × g で遠心分離によってビーズを収集し、ピペットで上澄みを慎重に取り外します。ビーズの損失を避けるためには、ビーズのドライを吸い出してはいけない
      7. 。
    7. 1 mL RIPA バッファーにビードを 4 回洗浄しなさい。各時間、回転 4 ° C 15 分でそれらを収集でよくビーズ 4 ° C で 3 分間 3,000 x g で低速遠心分離によってチューブを混ぜるし、培養上清を破棄します
      8. 。
    8. 最終的な洗浄から培養上清を除去した後再ナトリウム dodecyl 硫酸塩ポリアクリルアミド ゲル電気泳動 (SDS-PAGE) 読み込みバッファー (表 1) x 30 μ L 1 でビーズを中断し、よく混ぜます。
      1. 加温熱で 100 ° c 管ブロック 10 分遠心ビーズをペレットに 1 分間、12,000 × g でサンプル。慎重に、ビーズを乱すことがなく培養上清を収集し、1.5 mL のマイクロ遠心チューブにそれらを転送します
        2. 。
    9. 4-20% 勾配 SDS-PAGE による試料のゲルの分析および西部のしみまたは後で使用のための-20 ° C で保存します
      10. 。

2。タグ付きの 6XHis sumo 化 Rb 外因性ひと細胞の解析

  1. 細胞培養とトランスフェクション。
    1. 〜 6 種 × 10 6 HEK293 細胞 10 cm 皿し、75-85% コンフルエントの細胞を取得する正常な細胞培養条件下での培地に 24 時間孵化させなさい。トランスフェクション効率を促進する前に成長培地を削除し、prewarmed の減らされた血清中の 6 mL を追加 (材料の表 を参照) し、インキュベーターに料理を配置
      2. 。
    2. 、Rb の構成の sumo 化アッセイは、それぞれ 1.5 mL マイクロ遠心チューブに 500 μ L 減少血清培地で 6XHis タグ Rb Ubc9 WT、Rb Ubc9 C93S、Ubc9 WT Ubc9 C93S プラスミドの各 15 μ を追加します。
      1. 野生型 Rb の相撲抱合とその sumo 化欠損株を分析、どちらか 6XHis タグ Rb WT や Rb K720R プラスミドの GFP SUMO1 と共に 10 μ g をミックス (10 μ g) 500 μ L に減少 1.5 mL マイクロ遠心分離機で血清中 13 を管します
        2. 。
    3. 一方、別々 のチューブで 50 μ L のトランスフェクション試薬を混ぜる (材料表 参照) 500 μ L に減少、血清中、5 分間室温でインキュベート
    4. 完全に上記で説明した 2 つの個別のチューブを結合セルに試薬/プラスミド錯体 15 分追加、トランスフェクションの室温でインキュベートし続けて 8 の文化h 5% CO 2 と 37 ° C で
    5. 成長媒体、低血清培地を交換し、トランスフェクション後 48 時間の通常の培養条件下で細胞をインキュベートします
      6. 。
  2. タグ付きの 6XHis の Rb タンパク質の親和性のプルダウンをニッケルします。
    1. Transfected HEK293 細胞を溶解し、説明セクション 1.3.1 として総蛋白を抽出します
      2. 。
    2. 4 で 30 分のセル lysates 18,000 × g で遠心分離機 ° c 培養上清を収集し、クリーン チューブにそれらを転送します
      。 注: タンパク質を固定できるこの時点で-80 で 6 ヶ月以上 ° C
    3. 上清を新しいチューブと-80 で店に上記のごく一部を保存後の西部のしみの各サンプルの入力コントロールを準備をする ° C
    4. 洗浄 25 μ L 50% のニッケル ニトリロ三酸 (Ni 国税庁) アガロース ビーズ各サンプルに対して 1.5 mL マイクロ遠心チューブに 2 回 RIPA バッファーです。4 での 3 分間 3,000 × g で遠心分離してビーズを収集 ° C
    5. 10 mM の最終的な集中を取得するには、各サンプルに追加 1 M イミダゾール。各サンプルを準備された Ni NTA アガロース ビーズを含むチューブに追加します
      6. 。
    6. では、ビーズと緩やかな回転で 4 ° C で 2 h の lysates を孵化させなさい。4 ° C で 3 分間 3,000 x g でビーズをスピン、ピペッティングにより培養上清を慎重に取り外します。ビーズの損失を避けるためには、ビーズのドライを吸い出してはいけない
      7. 。
    7. は、1 mL の 20 mM のイミダゾール (表 1) を含む洗浄バッファーでビーズを洗います。各時間、4 ° C で 3 分間 3,000 x g で回してビーズ 15 分収集のための 4 ° C で回転でよくチューブを混ぜるし、培養上清を破棄します
      8. 。
    8. 最終的な洗浄後各サンプルに 30 μ L の溶出バッファー含む 250 mM のイミダゾール (表 1) を追加し、ミックスにフリックします。その後、タンパク質を溶出に 4 ° C で 20 分間インキュベートします
      9. 。
    9. は、6 × SDS ページ読み込みバッファー (表 1) と各サンプルをミックスします。次に、100 ° c で 10 分間熱ブロックでチューブをインキュベート
      10. ビーズをペレットに 1 分間、12,000 x
    10. 遠心 g。慎重に、ビーズを乱すことがなく培養上清を収集し、サンプルを 1.5 ml マイクロ遠心チューブに転送します。サンプルをウエスタンブロット分析または後で使用するための-20 ° C で保存することができます
      11. 。

3。西部のしみの

  1. 、免疫沈降をロードまたは 4-20% 勾配の SDS ページのゲルの上に前ステップから得られた試料をプルダウンします。120 V、90 分のタンパク質を分離する電気泳動を実施します
    2. 。
  2. が 300 で電気的ブロッティング法による蛋白質をゲルから (PVDF) ブロッティングに転送 4 ° c タンク転写法による 90 分の mA。室温で 1 時間 5% 無脂肪牛乳 (表 1) を含むブロック バッファーで PVDF 膜をブロックします
    3. 。
  3. 加温 3% ウシ血清アルブミン (BSA) (表 1) を含む抗体希釈バッファーで一次抗体と膜が 4 ° C で一晩します。一次抗体は、0.5 μ g/mL (反 SUMO1 抗体) の作業濃度または配分 (反 Rb と抗チューブリン抗体)、または 1:5,000 (抗 GFP と反彼の抗体) の希釈を使用します
    4. 。
  4. 洗う膜 3 x 10 分たびにトゥイーン (TBST) バッファー (表 1) をもつ含有トリス緩衝生理食塩水 x 1 を使ってします。種特定の西洋わさびペルオキシダーゼ HRP 標識二次抗体希釈 1:5,000 5% 無脂肪牛乳 (表 1) を含むブロック バッファー内で膜を孵化させなさい。膜 3 を洗って 10 分 1 x TBST バッファーを使用するたびに x.
  5. は、強化された化学発光 (ECL) 作業ソリューションと膜を孵化させなさい。プラスチック製のラップと膜をカバーし、信号の強さに応じて x 線フィルム公開します
    6. 。

結果

細胞周期の進行中に、sumo 化 Rb 内因性を検出するため本研究最初同期 HEK293 細胞細胞周期 (G0 初期 G1 G1、S、G2/M) の 5 つの段階で本論のプロトコル セクションで説明したよう。Propidium ヨウ化フロー フローサイトメトリー解析 (図 1) に続いて核酸染色を用いた同期の品質が確認されました。次に、セルは、収集、RIPA バッファーの変化によって分離...

ディスカッション

本稿では、検出し、人間の細胞の Rb 内因性 sumo 化を分析するためのプロトコルについて説明します。このメソッドは、グローバル相撲関連信号の任意の交替なしの内因性の Rb タンパク質に重点を完全に自然な生理学的な状況下で Rb SUMO 化を調査するための重要なツールです。

この目的を達成するため、留意することが重要です、: 1) 相撲ユビキチン化と比較して 4 つの?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

本研究は、科学と技術委員会の上海 (許可番号 14411961800) 国家自然科学基金、中国の (許可番号 81300805) からの助成金によって支えられました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11995065
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific31985070
Fetal Bovine Serum (FBS)Thermo Fisher Scientific26140079
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific15140122
Phosphate-buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200056
ThymidineSigmaT9250
NocodazoleSigmaM1404
propidium iodideThermo Fisher ScientificP3566
Triton X-100 AMRESCO694
RNase A Thermo Fisher ScientificEN0531
N-EthylmaleimideSigmaE3876 
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)AMRESCOM107
Nonidet P-40 Substitute (NP-40)AMRESCOM158
protease inhibitorRoche5892970001
Mouse Immunoglobulin G (IgG)Santa Cruz Biotechnologysc-2025
Rb antibodyCell Signaling Technology#9309
Protein A/G-Sepharose BeadsSanta Cruz Biotechnologysc-2003
Lipofectamine-2000 Thermo Fisher Scientific11668019
Nickel Nitrilotriacetic Acid (Ni-NTA) Agarose BeadsQiagen30230
ImidazoleSigmaI0250
4%-20% Gradient SDS-PAGE GelBIO-RAD4561096
Polyvinylidene Difluoride (PVDF) MembraneMilliporeIPVH00010
Tween-20AMRESCOM147
Tubulin antibodyAbmartM30109
SUMO1 antibodyThermo Fisher Scientific33-2044
GFP antibodyAbmartM20004
Horseradish Peroxidase (HRP) secondary antibodyJackson ImmunoResearch Laboratories715-035-150
enhanced chemiluminescence (ECL) KitThermo Fisher Scientific32106

参考文献

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