בידוד ואפיון של החולדה הראשית שסתום תאים ביניים: מודל חדש ללמוד הסתיידות שסתום אבי העורקים

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד, תרבות, הסתיידות של עכברוש-derived שסתום תאים ביניים, דגם מאוד פיזיולוגיים במבחנה של מחלת שסתום אבי העורקים calcific (CAVD). ניצול של מודל זה עכברוש מקלה על מחקר CAVD לחקור את התא ואת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס תהליך פתולוגי מורכב זה.

Abstract

מחלת שסתום אבי העורקים calcific (CAVD) מאופיין על ידי עיבוי הדרגתי של העלעלים שסתום אבי העורקים. . זה מצב לעתים קרובות נמצאו בחולי מחלת כליות (ESRD) קשישים, בשלב הסופי, הסובלים בדרך כלל היפרפוספטמיה שמוביל. כיום, ישנם טיפולים ללא טיפול תרופתי שיכול לעצור את התפתחותו. המנגנונים העומדים בבסיס תהליך פתולוגי זה אינן ברורות. העלעל שסתום אבי העורקים מורכב משכבה דקה של תאי אנדותל שסתום (VECs) על פני השטח החיצוני של cusps אבי העורקים, עם שסתום תאים ביניים (הקורבנות) דחוקה בין VECs. השימוש מודל עכברוש מאפשר המחקר במבחנה של הסתיידות חוץ רחמי בהתבסס על ויוו סרום physiopathological פוספט (Pi) רמות סידן (Ca) של חולים הסובלים היפרפוספטמיה שמוביל. הפרוטוקול המתואר פרטים הבידוד של חולדה טהור ויק האוכלוסייה כפי שמוצג על-ידי הביטוי של ויק סמני: שריר חלק-אלפא אקטין (α-SMA) vimentin ורקמות גורם הגדילה בטא (TGFβ) 1 ו-2, ואת העדר אשכול של בידול (CD) 31, VEC סמן. על ידי הרחבת הקורבנות, ניתן לבצע מחקרים ביוכימיים גנטיים, הדמיה כדי לחקור ולפצח המתווכים מפתח לגורם המרכזי עליו מושתתת CAVD.

Introduction

שסתום אבי העורקים בריא מורכבת שלוש עלונים, שאליו חלוקת מכאניים במהלך פתיחת וסגירת המסתם במידה שווה לצפות. העלעל שסתום יש מבנה מוגדר של שלוש שכבות נפרדות: fibrosa, spongiosa, ventricularis, איזה בית שסתום תאים ביניים (הקורבנות) כסוג התא השולט. אלה שלוש שכבות הן דחוקה בין שתי מיטות של שסתום תאי אנדותל (VECs)¹.

הקורבנות תפקיד קריטי בהתקדמות של Calcific אבי העורקים שסתום הסתיידות (CAVD), המחלה שסתום הלב הנפוצה ביותר בעולם המערבי. CAVD מתואר מצב מתקדם זה מוסדר באופן פעיל על ידי הרקמה valvular שלה microenvironment שמסביב. שינויים סלולריים לגרום בתחילה עיבוי שהותירה, ובסופו של הסתיידות נרחבת של העלעלים שסתום אבי העורקים. זה מוביל ואז היצרות מסתם אבי העורקים משמעותי ועזב בסופו של דבר, יצוא חדרית חסימה², עוזב החלפת שסתום כירורגיים כמו הטיפול העתידי.

הפתופיזיולוגיה של CAVD הוא מורכב, אבל חולק מנגנונים דומים מינרליזציה עצם פיזיולוגיים³. בזמן, מספר מחקרים הדגימו את היכולת של הקורבנות לעבור osteogenic טרנס-בידול, הסתיידות^4,5, המנגנונים לגורם המרכזי עליו מושתתת תהליך זה שעדיין לא להיות הובהר במלואו, המדגיש דרישה חיונית עבור מודל ריאלי ורלוונטי במבחנה של CAVD.

העבודות הקודמות על ידי מספר מעבדות יש בהצלחה מבודד הקורבנות חזירי דגמים שור, והוא תרבותי תאים אלה תחת calcifying תנאים-^6,-^7,-⁸. בשל גודלו של שסתום אבי העורקים במודלים אלה, בידוד של תאים דרך מערכת העיכול אנזימטי כבר יעילים ביצירת אוכלוסיות טהור של תאים. עם זאת, מודלים אלה יכולות להיות מגבילות עקב המוגבל של כלים עבור מיני בעלי חיים גדולים. לעומת זאת, מודלים מכרסמים נשארים יתרון עלויות נמוכות יחסית, פוטנציאל מניפולציה גנטית וכתוצאה את מערך נרחב של כלים הזמינים בקלות. עם זאת, בידודו של הקורבנות של מודלים בעלי חיים קטנים לא נרחב מועסק, וזו תוצאה סביר של הקשיים בעבודה עם דגימות רקמה קטנה.

פרוטוקול מפורט זה מדווח שיטה מקיפה הבידוד ישירה של חולדה ממין. על ידי ניתוח זהיר של השסתום, ואחריו סדרה של digestions אנזימטיות, הקורבנות יכולים להיות מבודדת, מועסקים במגוון רחב של טכניקות ניסיוני, כולל ביטוי לתרבות, הסתיידות, ג'ין תא. מודל זה מאוד רלוונטי במבחנה של CAVD יהפכו ללא ספק תרומה חיונית להגדלת הידע שלנו של תהליך פתולוגי.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על ידי הוועדה משתמשים בעלי חיים של רוזאלין המכון, ומתוחזק החיות היו על פי הנחיות משרד הפנים (בריטניה) הטיפול ואת השימוש בבעלי חיים. עבור פרוטוקול המתואר להלן, שימשו חולדות ספראג Dawley 5 - בן שבועיים, זכר.

1. מגיב מתכונים

1. הכינו את תרבות בינוני באמצעות מדיום נשר שונה (DMEM) של Dulbecco מזין תערובת F-12 (DMEM/F12). להוסיף 10% לעקר להשבית חום העובר שור סרום (FBS) ו גנטמיצין 1%.
2. הכן של הסתיידות בינוני באמצעות תרבות בינוני ו- 2.7 מ"מ Ca/2.5 מ"מ Pi.
   1. הכן 1 מ' סידן כלורי (₂CaCl) על ידי שוקל 555 מ"ג CaCl₂ את זה במים מזוקקים מ ל לעשות 5 מ של 1 מ' CaCl₂. לסנן את הפתרון דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.22 לחטא את הפתרון.
   2. להכין 1 מ' סודיום פוספט על ידי שקילה החוצה 710 מ ג נטול מים dibasic סודיום פוספט (נה₂HPO₄), 600 מ"ג של נטול מים monobasic סודיום פוספט (NaH₂PO₄), המסת כל אחד בנפרד בכתב מ ל מזוקקים . מים. לשלב 3,870 µL של נה₂HPO₄ µL 1,130 NaH₂PO₄, מסנן דרך מסנן מזרק מיקרומטר 0.22 לחטא פתרון.
3. הכינו את לשטוף את מאגר המכיל גנטמיצין מאוזנת פתרון מלח (HBSS) ו- 1% של האנק.

2. הכנת למכסה לנתיחה

1. לבצע ניתוח כל בשכונה מאוורר, חיטוי בעבר עם 70% אתנול כדי להבטיח עקרות של ריאגנטים ודוגמאות.
2. לחטא כלי ניתוח מאת autoclaving שאותם ואחריו הטבעית את תיאורי הכלים בתוך המכיל 70% אתנול לפני השימוש.
3. להכין בקבוקונים המכילים שטיפת מאגר, ומשרים בכלי ניתוח במאגר לשטוף לפני בא במגע עם בעל חיים או רקמות. לשמור על המאגר שטיפת על קרח בכל עת.

3. מיצוי של עכברוש ראשי הקורבנות

הערה: עבור פרוטוקול המתואר להלן, חולדות ספראג Dawley 5 - בן שבועיים, זכר שימשו.

1. ללקט את החולדות (~ 100 גרם) על ידי נקע בצוואר הרחם לפי הנחיות משרד הפנים בבריטניה.
2. שווייץ בלב כל עכברוש, במקום החיה פרקדן על קרש חיתוך זכוכית, לחטא את העור ע י ריסוס עם 70% אתנול.
3. עושים חתך 4 ס מ בהאמצע של העכברוש בעזרת מספריים לנתיחה, כדי לחשוף את חלל הבטן, הסר בזהירות את הצלעות והריאות, לחשוף את הלב.
4. להסיר את הלב עם זוג של שארפ, מעיין מספריים מעוגלים, ולאחסן בלב ביתור במאגר כביסה קרה קרח עד והניתוחים דוחה כל העכברושים הושלמו.
5. לנתח מיקרו-כל לב, ההעברה האחרון לתוך צלחת פטרי מכוסה במאגר לשטוף. חתוך את שריר הלב עם זוג מספריים ישר האביב (6 מ מ להבים) להישאר עם אזור קטן המקיפים של אבי העורקים, את בסיס אב העורקים.
6. באמצעות אותו מעיין מספריים ישר (6 מ מ להבים), בזהירות לחתוך של אבי העורקים לכיוון החדר השמאלי ולחשוף העלעלים שסתום אבי העורקים.
7. העברת העורקים שנפתח לתוך צלחת פטרי טריים, סטרילי מלא HBSS. שווייץ העלעלים שסתום אבי העורקים, מסומן על ידי הצורה 'U' הייחודית שלהם בבסיס של אבי העורקים, עם Vannas-סוג capsulotomy מיקרו-מספריים (להב 3 מ מ).
8. אחסן כל העלעלים 1 מ"ל מאגר כביסה קרה קרח, צינור microcentrifuge 1.5 mL עד והניתוחים כל הושלמו.
9. לאחר כל העלעלים נקצצו, centrifuge אותם ב- g x 100 עבור 1 דקות ב 4 ° C כדי להסיר את המאגר לשטוף.
10. בצע את השלבים הבאים בשכונה התרבות התא כדי להבטיח עיקור. כדי להסיר את VECs, לעכל את כרוזים 100 µL 425 U/mL collagenase II עבור 5 דקות ב 37 º C. לשבש את תהליך העיכול על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה באמצעות טיפ פיפטה 200 µL.
11. צנטריפוגה ב 100 x g ל 30 s כדי הצניפה העלעלים, ולמחוק את תגובת שיקוע בקפידה. לשטוף פעמיים עם מאגר לשטוף µL 500 ו הצניפה מחדש את התאים על ידי צנטריפוגה-g 100 x עבור 30 s.
12. הקציר הקורבנות של העלעלים, לעכל עם 100 µL של collagenase U/mL 425 השני כבר שעתיים ולאחר מכן שחרר הקורבנות על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה באמצעות טיפ פיפטה 200 µL.
13. לדלל את collagenase השני ב 19 מ"ל של תרבות בינונית, צנטריפוגה-g x 670 עבור 5 דקות כדי הצניפה את הקורבנות ופסולת הנותרים שסתום העלעל. למחוק את תגובת שיקוע, ולהעביר פליירים הקורבנות כדי תרבות צלחות/צלוחיות בהתאם (טבלה 1).
14. תרבות הקורבנות במשך 5-7 ימים תרבות בינוני, עד confluency ב 37 מעלות צלזיוס, בנוכחות 5% (פחמן דו-חמצני) CO₂, שינוי המדיום לאחר 72 h. לשימוש לאחר מכן ניסויים במבחנה , המעבר עד 5 פעמים ברגע confluency מגיע ל 100%.

4. אינדוקציה של הסתיידות של חולדה ממין

הערה: עבור כל הניסויים, לספור תאים עם hemocytometer.

1. לבצע כל התא הראשי seeding, passaging בברדסים סטיריליים למניעת זיהום. כדי להתכונן עכברוש ראשי הקורבנות במבחנה הסתיידות ניסויים, זרע את התאים על צפיפות של 150,000 תאים/טוב ב- 6-ובכן צלחות. לשמור על תרבות בינוני עד 90% ≥ confluency (בדרך כלל 72 h).
2. לטיפול הקורבנות עם הסתיידות לעומת שליטה בינונית, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, בנוכחות 5% CO₂, עבור h 72 נוספים.
3. ללמוד החולדה הראשית מסויד הקורבנות עבור ניתוחים במורד הזרם עוקבות, להסיר את המדיום הסתיידות/בקרה ולשטוף את monolayers עם מאגר לשטוף כדי להסיר יונים שאינו מאוגד Ca ו- Pi.

5. עכברוש ויק אפיון

1. עבור immunostaining לפקח על סמנים פנוטיפי כגון vimentin וα-SMA, זרע העכברוש הקורבנות-צפיפות של 150,000 תאים/טוב בובכן 6-פלטות המכילות שער גולשת (תאים יגדל על פני פתקי כיסוי), ולהשאיר לגדול עד 50% confluency.
2. האחות המדיום תרבות ולתקן את monolayers תא עם 4% paraformaldehyde (PFA) 10 דקות לפני נטילת אותם 3 פעמים בתמיסת פוספט buffered (PBS), למשך 5 דקות בכל פעם.
   התראה: PFA הוא רעיל, יש לטפל בזהירות.
3. דגירה של טפט תא עם מאגר חסימה ו permeabilization (PBS 1 x, 5% של סרום נורמלי מן מאותו המין כמו הנוגדן המשני, 0.3% טריטון X-100) לשעה בטמפרטורת החדר.
4. דגירה של monolayers תא עם העכבר anti-vimentin וארנבת נוגדנים anti-α-SMA מדולל במאגר דילול נוגדנים (אלבומין פרה 1% + 0.3% טריטון X-100 ב- PBS) בן לילה 4 ° C, בעדינות רועד על כיסא נדנדה.
   הערה: פקדי שלילי כללה עכבר שאינו מצומדת IgG וארנבת IgG, באמצעות של דילולים אותו כמו הבדיקה דוגמאות.
5. ביום הבא, לשטוף את הנוגדנים ראשי 3 פעמים עם PBS, למשך 5 דקות בכל פעם.
6. דגירה של תאים monolayers עם fluorophore מצומדת נוגדנים משניים לשעה בטמפרטורת החדר, מנענע בעדינות על כיסא נדנדה.
7. לשטוף 3 פעמים עם PBS, בעדינות tweeze החוצה coverslips (אשר מכילים חולדה ממין) עם זוג מלקחיים ומקום על coverslip המכיל 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי). להשאיר את השקופיות כדי לרפא לפחות 24 שעות ב 4 ° C לפני להמחיש עם מיקרוסקופ זריחה.
8. לניתוח תספיג, זרע העכברוש הקורבנות-צפיפות של 150,000 תאים/באר היטב 6-פלטות ולהשאיר לצמוח התרבות בינוני עד 100% confluent.
9. השתמש µg 8 של חלבון כדי להפעיל תספיג למדוד את הביטוי של CD31, לשלול כל זיהום VEC.
   הערה: פרוטוקול סטנדרטי תספיג יושם כפי שתואר לעיל⁹.
10. ללימודים ג'ין, לחלץ חומצה ריבונוקלאית (RNA) באמצעות ערכת מסחרי בעקבות הנחיות היצרן.
11. להשיג cDNA באמצעות שעתוק במהופך כדי למדוד את הביטוי של גנים היעד באמצעות תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), בזמן אמת PCR (RT-PCR; ידוע גם בשם qPCR) עם זיהוי fluorophore ירוק, באמצעות Gapdh כמו הגן הפניה, כמו בעבר תיאר¹⁰.
    1. השתמש התוכנית הבאה לניתוח ה-PCR: 1 מחזור 94 ° C למשך 3 דקות, מחזורים של 94 ° C ל 30 s, 63 ° C ל 30 s, 72 ° C עבור 35 s, ו 1 סוף סוף מחזור 72 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
    2. השתמש התוכנית הבאה לניתוח qPCR: 1 מחזור 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 40 מחזורי 95 ° C 15 s, 60 ° C 1 דקות, מחזור נוסף של 95 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה, 55 ° C s 30, ו 95 ° C ל 30 s.
12. הפעל בג'ל לנתח PCR מוצרים באמצעות ג'ל agarose 2% במאגר טריס/בוראט/EDTA (TBE).

6. עכברוש ויק הסתיידות מחקרים

1. עבור Alizarin אדום S ומחקרים ביוכימיים הסתיידות, אנא עקוב אחר ההנחיות seeding, הסתיידות המתוארות בסעיף 4.
2. כתם על monolayers תא עם פתרון 5% S Alizarin אדום, נדנדה בעדינות על מטרף, כעשרים דקות. לאחר מכן לשטוף 3 פעמים עם מים מזוקקים, למשך 5 דקות בכל פעם. לרכוש תמונות של כל טוב.
3. כדי לכמת את התצהיר Ca, להשתמש ערכת assay Ca הביוכימי. ליץ Ca^{2 +} יונים באמצעות 0.6 מטר חומצת מימן כלורי (HCl) במשך 24 שעות ביממה ב 4 ° C, עם עצבנות עדין.
4. לקצור את תגובת שיקוע ולמדוד הריכוז Ca שימוש assay Ca של קיט (ראה טבלה של חומרים) בעקבות הנחיות היצרן.
5. חשב את ריכוז הסידן כשבר של חלבון תאית הכולל. Denature הסלולר מהחלבונים monolayers התא עם 0.1 M הידרוקסיד הנתרן (NaOH) + 0.1% נתרן dodecyl סולפט (מרחביות). לקבוע ריכוז החלבון הכולל שימוש של דטרגנט תואם (DC) חלבון assay בעקבות הנחיות היצרן.

תוצאות

המטרה של פרוטוקול זה היה לתאר את ניתוקה של עכברוש ראשי הקורבנות תרבות אותם לניסויים הסתיידות ' במבחנה . על-ידי הפעלת השיטה המתוארת לעיל, חולדה ממין יכול להיות בהצלחה מבודד והתרחבה לצורך המחקר של המנגנונים האחראי על CAVD.

עכברוש ראשי הקורבנות לשפה משותפת עם ויק הוקמה סמנים:

ויק פנוטיפ של תאים מבודדים אושרה דרך immunofluorescence על-ידי בודק סמני ויק: vimentin וα-SMA (אדום וירוק, בהתאמה, איור 1A), הוא מסכים עם דוחות קודמים^11,12. הפקדים שלילי נציג באמצעות העכבר שאינם מצומדת וארנבת IgG מוצגים איור 1B. בנוסף, הביטוי של ויק-צמיחה וסת TGFβ-1 ו- TGFβ-2 אושר באמצעות ניתוח ה-PCR (איור 1C). על מנת לאשר כי החולדה מבודד ראשי הקורבנות היו חינם מפני זיהום אנדותל, תספיג ניתוח בוצע כדי לאמת את העכברוש הזה הקורבנות היו שליליות דה מרקר תא אנדותל, CD31, באמצעות כלבים VECs המסתם הדו-צניפי כפקד חיובי ( איור 1D).

Ca ו- Pi זירוז הסתיידות ויק חולדה:

ריכוזים מערכתית Ca ו/או פאי לנהוג בדרך כלל הסתיידות של הקורבנות בתוך חוץ גופית. להעריך את הפוטנציאל הסתיידות של העכברוש מבודד הקורבנות, התאים נחשפו לרמות גבוהות של Ca ו- Pi, המחקות שמוביל פתולוגיים ותנאי היפרפוספטמיה חולי ESRD. טיפול ממין עם 2.7 מ"מ Ca/2.5 מ"מ Pi המושרה הסתיידות, כפי שנקבע על ידי S אדום Alizarin מכתים עבור התצהיר Ca (איור 2 א) וקביעת ערכי צבע מוחלטים של רמות Ca בעקבות HCl שטיפת (קיפול 81; באמצעות הסטודנט t p < 0.05-מבחן; איור 2B).

שינויים ביטוי גנים הקשורים עם הסתיידות ויק:

הסתיידות של כלי דם תאים במבחנה מזוהה עם פרופיל מולקולרית ברורים. במחקר הנוכחי, הטיפול של הקורבנות עם 2.7 מ"מ Ca/2.5 מ"מ Pi המושרה עלייה משמעותית בביטוי mRNA סמנים osteogenic: Msh גנים homeobox 2, Msx2 (קיפול 2.04 השינוי; p < 0.01; איור 3 א), אלקליין פוספטאז, Alpl (קיפול 1.49 השינוי; p < 0.001; איור 3B), ו phosphoethanolamine/phosphocholine פוספטאז, Phospho1 (קיפול 4.7 השינוי; p < 0.01 באמצעות חד-כיווני אנובה; איור 3C). עם זאת, הביטוי של סמן osteogenic, Runx2, הסתיידות מעכב ectonucleotide pyrophasphatase, Enpp1, נותרה ללא שינוי (איור 3D–E).

איור 1. הביטוי של סמני ויק. Immunofluorescence (א) מציג מכתים זוגי, colocalization של אקטין שריר חלק-אלפא (α-SMA; ירוק), vimentin בתאים interstitial שסתום (הקורבנות). (B) תמונה ייצוגית של פקדים שליליים באמצעות העכבר וארנב IgG. הגרעינים מוכתמים בצבע כחול באמצעות 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (ג) הנוכחות של הפיכת גורם הגדילה בטא 1 (TGFβ-1) ו- TGFβ-2 הקורבנות (מסלולים 1 - 3) כפי שמוצג על ידי ניתוח ה-PCR. ליין 4 היא הפקד מים. ג'ין הפניה בשימוש היה Gapdh. (ד) ניתוח תספיג מראה הביטוי בשפע של CD31 תאי אנדותל הכלבי הדו-צניפי (VECs) בהשוואה אין ביטוי הקורבנות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

באיור 2. במבחנה הסתיידות של עכברוש הקורבנות. התצהיר Ca בהקורבנות שטופלו 2.7 מ"מ Ca/2.5 מ"מ Pi כפי שנקבע על ידי: צילום (A) מציג S אדום Alizarin מכתים של כל התא monolayers טוב ולאחר קביעת ערכי צבע מוחלטים (B) רמות Ca בעקבות שטיפת HCl. הסטודנט t-הבדיקה בוצעה כדי לנתח את המשמעות בין הקבוצות שני הנתונים. התוצאות מוצגות אומר ± S.E.M. *p < 0.5 לעומת שליטה; (n = 4).

איור 3. שינויים ביטוי גנים הקשורים עם הסתיידות ויק. קיפול שינוי בביטוי ה-mRNA של סמנים osteogenic (א) Msx2(B) Alpl, (ג) Phospho1, (ד) Runx2, (E) Enpp1 של הקורבנות שטופלו 2.7 מ מ Ca/2.5 מ"מ Pi עבור 48 ה mRNA ביטוי מוצג כשינוי קיפול לעומת הגן הפניה אנדוגני Gadph. חד-כיווני אנובה באמצעות כללי מודל ליניארי שילוב השוואות pair-wise בוצעה כדי לנתח את המשמעות בין קבוצות מרובות. התוצאות מוצגות אומר ± S.E.M. * *p < 0.01; p < 0.001 לעומת שליטה; (n = 6). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מספר העלעלים שסתום	תרבות צלחת/הבקבוק.
9-15	1 טוב בצלחת 12-ובכן
15 עד 30	1 טוב בצלחת 6-ובכן
30 +	T25

טבלה 1- הנחיות כלליות עבור מספר עלונים הדרושות זריעה הראשונית.

Discussion

פרוטוקול מפורט זה מתאר שיטה מעשית עבור הרכישה של עכברוש ראשי הקורבנות, המאפשר את ניתוקה של תאים אלה מן החולדה שסתומי הלב דרך מערכת העיכול אנזימטי. השיטה שלנו נוספת תומכת, מרחיב את השימוש שדווחה בעבר. החולדה במבחנה מודל ללמוד שסתום אבי העורקים הסתיידות¹³. בידודו של הקורבנות מן שסתום אבי העורקים מציג את פוטנציאל זיהום של VECs השכנה. עם זאת, הנתונים immunofluorescence שלנו מאשרים כי השלב הראשוני עיכול מספיקה להסיר את VECs, עיבוד תאים בודדים שלילי עבור דה מרקר תא אנדותל, CD31. יתר על כן, α-SMA מכתים מאשרת את פנוטיפ מופעל הקורבנות, אשר נדרש עבור הסתיידות¹².

ויק ומשום בעבר דווח בחיה גדולה מודלים^6,7,8. עם זאת, המינים הללו הם מוגבל על ידי מוגבל גנטית ומולקולרית הכלים הזמינים עבור המחקר במורד הזרם, כמו גם נגישות מוגבלת שלהם במעבדות ברחבי העולם. לעומת זאת, כלים כאלה מבוססים היטב מכרסמים זמינים, ולכן היכולת לבודד חולדה-derived הקורבנות מאפשר תכנון ניסויים קיבולת גדולה יותר. השימוש של הקורבנות של חולדות צעירות גם אומר כי התאים נמצאים יחסית proliferative יותר מאשר עכברים בוגרים, לכן הדורשים פחות חיות להניב יותר תאים. למרות עכברים נגישים בקלות, אבל בגלל עכברים שיש לבבות קטנים במיוחד, הבידוד של העכבר הראשי הקורבנות יהיה אורכת זמן רב ו בעלי חיים הרבה יותר יידרשו כדי לבודד את התשואה זהה של תאים כמודל חולדה.

יתרון משמעותי של גישה זו המתוארת היא כי הקורבנות ניתן לבודד חנותם של פראי סוג העכברים הטרנסגניים, כמו גם חולדה מודלים של מחלות לב וכלי דם ופציעות שסתום. שימוש במודל חולדה ידרוש מספר גדול יותר של בעלי חיים לניסויים בקנה מידה גדול, לכן כדי להפחית את השימוש בבעלי חיים, עכברוש ראשי הקורבנות יכול להיהפך כדי לייצר קו תא ברגע זה גם מאפיין.

בעוד ההשלכות קלינית חמורה של CAVD מזוהים באופן נרחב המנגנונים סיבתי כבסיס טרם להיקבע. בנוסף, מציגים תרופה יעילה טיפולים זה עשוי למנוע ולרפא פוטנציאל הסתיידות שסתום אבי העורקים אינם זמינים. התרבות של הקורבנות תחת calcifying תנאים ולכן מספק מודל מאוד רלוונטי במבחנה של CAVD. אנו מראים כי רמות גבוהות של Ca ו- Pi זירוז הסתיידות במבחנה של מבודדים חולדה ממין עם עלייה והמצוות בביטוי של סמנים ג'ין osteogenic Msx2, Alplו- Phospho1. זה נרחב נוסדה סמנים אלה קשורים עם תהליך פתולוגי של הסתיידות כלי הדם^14,15,16. הנתונים שלנו להציג ולכן זו התרבות של החולדה הקורבנות calcifying בינוני דגם המתאים שבו ללמוד שסתום אבי העורקים הסתיידות חוץ גופית בתוך. ואכן, מחקרים שנעשו לאחרונה מן המעבדה שלנו נעזרו מודל זה להפגין Ca מקדמת את שסתום אבי העורקים הסתיידות דרך העשרת Annexin השישי של מטריקס ויק-derived שלפוחית¹⁷.

למרות היתרונות של שימוש חולדה ממין ואיפיונן יעיל, כמה מגבלות עדיין קיים. ראשית, גודל האוכלוסייה ויק בתוך חולדה שסתומים הוא קטן מאוד, ולכן בעלי חיים רבים נדרשים על מנת ליצור תא מספיקים ללימודים נרחב במבחנה . עם זאת, ניתן להתגבר על מגבלה זו על-ידי התחייבות מחקרים ראשוניים בקווים תא interstitial מונצחים שסתום, כפי שדווח על ידי אותנו לאחרונה¹⁸, לאחר מכן העסקת תרבויות הראשי כדי לוודא ולהרחיב את הממצאים הללו.

לסיכום, השיטה המתוארת מסביר את הבידוד מוצלח, תרבות, הסתיידות של עכברוש ראשי הקורבנות, אשר עשוי להיות לאחר מכן בדקו באמצעות מגוון של ניתוחים כולל מבחני הביוכימי, כמו גם חלבון וניתוחים RNA. מודל זה מציע מערכת אמינה ונוחה בהם לחקור CAVD במבחנה, ומספק כלי רב ערך עבור חוקרים המנגנון המולקולרי האחראי על המחלה ההרסנית הזאת.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection scissors	World Precision Instruments	14393	Autoclave before use.
Spring straight (8 mm blade)	World Precision Instruments	15905	Autoclave before use.
SuperFine Vannas scissors (5 mm blade, 8 cm)	World Precision Instruments	14003	Autoclave before use.
Dumont #5 tweezers (11 cm)	World Precision Instruments	500342	Autoclave before use.
DMEM-F12	Thermo Fisher Scientific	11320074
Foetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10500064	Filter before adding to culture medium.
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	15710049
Absolute ethanol	Thermo Fisher Scientific	E/0650DF/17	Dilute to 70% v/v in distilled water.
Hydrochloric acid (HCl)	Thermo Fisher Scientific	H1150PB17	Dilute to 0.6M with distilled water.
Sodium hydroxide (NaOH)	Thermo Fisher Scientific	UN1823	Dilute to 0.1M with distilled water.
DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36931
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A11005	1/250 dilution in antibody dilution buffer.
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit antibody	Thermo Fisher Scientific	A21206	1/250 dilution in antibody dilution buffer.
Superscript II kit	Thermo Fisher Scientific	18064014
dNTP	Thermo Fisher Scientific	18427013
Random primers	Thermo Fisher Scientific	P/N58875
Taq Polymerase kit	Thermo Fisher Scientific	18038026
Tris/Borate/EDTA (TBE)	Thermo Fisher Scientific	AM9863	Dilute to 1x with distlled water, before use.
Agarose	Thermo Fisher Scientific	16500	2% in 1x Tris/Borate/EDTA(TBE).
Lysis buffer (RIPA)	Thermo Fisher Scientific	89900
T75 flask	Thermo Fisher Scientific	156472
T175 flask	Thermo Fisher Scientific	159920
qPCR plates	Thermo Fisher Scientific	AB0990
Rat Msx2 primer	Qiagen	QT01084090
Rat Alpl primer	Qiagen	QT00190680
Rat Enpp1 primer	Qiagen	QT00181426
RNeasy minikit	Qiagen	74104
6-well plates	Sigma	CLS3516
T25 flask	Sigma	CLS430639
Monobasic phosphate	Sigma	S5011
Dibasic phosphate	Sigma	S5136
Calcium chloride	Sigma	C1016
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma	5030	Dilute to 0.1% with 0.1M NaOH.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Dilute to 4% with PBS.
Triton X100	Sigma	X100
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A3059
Alizarin red S	Sigma	A5533	Make up to 2% with distilled water, and adjust to pH 4.2.
TGFβ-1 primer pair: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA	Sigma		Concentration used: 10 μM
TGFβ-2 primer pair: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG	Sigma		Concentration used: 10 μM
Monoclonal Anti-β-Actin−Peroxidase antibody produced in mouse	Sigma	A3854	1/50000 dilution in 5% BSA in tris-buffered saline + 0.1% Tween (TBS/T).
Mouse anti-vimentin antibody	Sigma	v6389	1/900 dilution in antibody dilution buffer (1x phosphate buffered saline (PBS), 1% bovine serum albumin (BSA), 0.3% Triton X-100).
Mouse IgG	Sigma	I5381	Diluted to the same stock concentration as mouse anti-vimentin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer.
Rabbit IgG	GeneTex	GTX35035	Diluted to the same stock concentration as rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer.
Rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody	Abcam	ab5694	1/200 dilution in antibody dilution buffer.
Rabbit anti-CD31	Abcam	ab28364	1/50 dilution in 5% BSA inTBS/T.
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody	Dako	P0448	1/3000 dilution in in 5% BSA in TBS/T.
Collagenase II	Worthington	41512862	Adjust to 425 U/mL with distilled water, and then filter.
SYBR green mastermix	Primerdesign	PrecisionPLUS-MX-SY
Calcium assay kit	Randox	CA590
DC protein assay kit	Bio-Rad	5000111
ECL reagent	GE Healthcare	RPN2109
Hyperfilm ECL	GE Healthcare	28906837
Nitrocellulose membrane	GE Healthcare	10600007
PCR ladder	Bioline	BIO-33057
Loading dye for gel electrophoresis	New England Biolabs	B7025S
Syringe filters (0.22 μm)	Merck Millipore	SLGP033RS
Coverslips	Scientific Laboratory Supplies LTD	MIC3100
Hematocytometer	Marienfeld Superior	640030
Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera set up for Alizarin red images:
Camera	Nikon D800
Lens	Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED
Dissection forceps 10 cm, curved ends	World Precision Instruments	15915	Autoclave before use.