Method Article
Этот протокол описывает изоляции, культуры и кальцификации крыса производные клапан интерстициальных клеток, модель высокой физиологической в пробирке calcific аортального клапана болезни (CAVD). Эксплуатация этой модели крыса облегчает CAVD исследований в изучении клеток и молекулярные механизмы, которые лежат в основе этого сложного патологического процесса.
Заболевание calcific аортального клапана (CAVD) характеризуется прогрессивного утолщение листовки аортального клапана. Это состояние часто встречается в пожилых людей и терминальной стадии почечной болезни (ТПН) пациентов, которые часто страдают от hyperphosphatemia и гиперкальциемии. В настоящее время есть нет лекарства терапии, которые могут остановить его прогрессирования. Механизмы, которые лежат в основе этого патологического процесса остаются неясными. В листовке аортального клапана состоит из тонкого слоя клапан эндотелиальных клеток (VECs) на внешних поверхностях аорты бугров, с клапаном интерстициальных клеток (ВМКС) зажатой между VECs. Использование модели крыс позволяет в vitro исследования эктопической кальцификации основе в vivo выкидышей сыворотки фосфат (Pi) и уровни кальция (Ca) пациентов, которые страдают от hyperphosphatemia и гиперкальциемии. Протокола описаны подробности изоляции чистой крыса Вик населения как показано выражение Вик маркеров: альфа гладких мышц актина (α-SMA) тканей и виментин фактор роста бета (TGFβ) 1 и 2 и отсутствие Кластер дифференцировки (CD) 31, VEC маркер. Расширяя эти Викс, биохимических, генетических и тепловизионные исследования может выполняться для изучения и разгадать ключевых посредников, лежащие в основе CAVD.
Здоровые аортальный клапан состоит из три листовки, которые одинаково распределяется распределения механического напряжения во время открытия и закрытия клапана. В листовке клапан имеет определенную структуру трех отдельных слоев: fibrosa, spongiosa и ventricularis, какой дом клапана интерстициальных клеток (ВМКС) как тип преобладает ячейки. Эти три слоя зажатой между двумя кроватями клапан эндотелиальных клеток (VECs)1.
Викс играют решающую роль в прогрессировании из Calcific аортального клапана кальцификации (CAVD), наиболее распространенные заболевания клапанов сердца в западном мире. CAVD описывается как прогрессивный условие, которое активно регулируется клапанной ткани и его окружающие микроокружения. Клеточные изменения первоначально вызывают фиброзных утолщение и в конечном итоге обширные кальцификации клапана аорты листовок. Это затем приводит к значительным аортального клапана стенозом и в конечном счете, левый желудочков отток непроходимость2, оставляя хирургические клапана как единственной жизнеспособной лечения.
Патофизиология CAVD является сложным, но разделяет аналогичные механизмы физиологического кости минерализация3. Хотя ряд исследований продемонстрировали способность Викс пройти Остеогенные транс дифференциация и кальцификации4,5, механизмы, лежащие в основе этого процесса еще не полностью раскрыты, подсветка важнейшее требование для модели осуществимым и соответствующие в vitro CAVD.
Предыдущая работа ряда лабораторий успешно изолированные Викс моделей свинину и говядину и культивировали эти клетки под большеклеточная условия6,,78. Из-за большого размера аортального клапана в этих моделях изоляции клеток путем ферментативного пищеварения был весьма эффективным в деле генерирования чистого популяции клеток. Однако эти модели могут быть ограничительный из-за ограниченного числа молекулярных инструменты для крупных видов животных. В отличие от грызунов модели по-прежнему выгодно из-за относительно низкой цене, потенциал для генетических манипуляций и обширный массив молекулярных инструменты, которые легко доступны. Однако изоляции Викс от мелких животных моделей не используется широко, которая является скорее всего следствием трудностей, возникших при работе с образцами небольших ткани.
Этот подробный протокол сообщает всеобъемлющий метод для прямого изоляции крыса Викс. Путем тщательного вскрытия клапана, последовала серия ферментативного пищеварения Викс могут быть изолированы и заняты в самых разнообразных экспериментальных методов, включая клетки культуры, кальцификации и ген выражение. Эта модель весьма актуальным в vitro CAVD несомненно сделает существенный вклад в расширение наших знаний этого патологического процесса.
Все эксперименты на животных были утверждены Комитетом пользователей института Рослина животных, а животные были сохранены в соответствии с домашнего офиса (Великобритания) руководящие принципы для ухода и использования животных. Для протокола, описанные ниже были использованы крысах Sprague-Dawley 5 - неделя старый, мужчина.
1. Реагент рецепты
2. Подготовка вскрытия капота
3. Добыча первичных крыса Викс
Примечание: Для протокола, описанные ниже, были использованы крысах Sprague-Dawley 5 - неделя старый, мужчина.
4. индукция кальцификации крыса Викс
Примечание: Для всех экспериментов, подсчитать ячейки с Горяева.
5. крыса Вик характеристика
6. крыса Вик кальцификации исследования
Цель этого протокола был описать изоляции первичных крыса Викс и культуры их в vitro кальцификации экспериментов. Используя метод, описанный выше, может успешно изолированные и расширена для изучения механизмов, отвечающих за CAVD крыса Викс.
Крыса первичной Викс локализовать совместно с установленным Вик маркеров:
Вик фенотип изолированных клеток была подтверждена через иммунофлюоресценции зондирование для маркеров Вик: виментин и α-SMA (красный и зеленый, соответственно, рис. 1а) и согласна с предыдущих докладов11,12. Представитель негативный контроль с помощью мыши конъюгированных и кролик IgG показаны на рисунке 1B. Кроме того выражение VIC-роста регулятор TGFβ-1 и TGFβ-2 было подтверждено с помощью ПЦР-анализа (рис. 1 c). Для того чтобы подтвердить что изолированные крыса первичной Викс были свободны от эндотелия загрязнения, Западный анализ помаркой была выполнена для проверки что крысы Викс были отрицательными для маркера эндотелиальных клеток, CD31, с помощью собак митрального VECs как положительный контроль ( Рисунок 1 d).
CA и Pi побудить крыса Вик кальцификации:
Повышенные концентрации системных Ca и/или Pi обычно диск кальцификации Викс в пробирке. Чтобы оценить потенциал кальцификации изолированных крысы Викс, клетки подвергаются повышенные уровни Ca и ПРР, которые имитируют патологических состояний гиперкальциемии и hyperphosphatemia в больных ТПН. Лечение Викс с 2,7 мм Ca/2.5 мм Pi индуцированной кальцификации, как определяется ализарин красный S пятная для Ca осаждения (рисунок 2A) и Колориметрическое определение уровней Ca, после HCl, выщелачивание (81 раз; p < 0,05 с помощью студента t-теста; Рисунок 2B).
Изменения выражения гена, связанные с Вик кальцификации:
Кальцификации сосудов клетки в vitro связан с профилем различных молекулярных. В настоящем исследовании, лечение Викс с 2,7 мм Ca/2.5 мм Pi индуцированной значительное увеличение экспрессии мРНК Остеогенные маркеров: Msh гомеобокс 2, Msx2 (2.04 раз изменения; p < 0.01; Рисунок 3А), щелочной фосфатазы, Alpl (1,49 раза изменений; p < 0,001; Рисунок 3B) и фосфоэтаноламина/фосфохолин фосфатаза, Phospho1 (4,7 раза изменений; p < 0.01 с помощью односторонний дисперсионный анализ; Рисунок 3 c). Однако выражение Остеогенные маркер, Runx2и кальцификации ингибитор ectonucleotide pyrophasphatase, Enpp1, оставалась неизменной (рис. 3D–E).
Рисунок 1. Выражение Вик маркеров. (A) иммунофлюоресценции показаны двойной окрашивание и colocalization актина альфа гладких мышц (α-SMA; зеленый) и виментин в клапан интерстициальных клеток (ВМКС). (B) представитель изображение отрицательных элементов управления с помощью мыши и кролик IgG. Ядер окрашенных в синий с помощью 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Шкалы бар = 50 µm. (C) присутствие преобразования бета фактор роста-1 (TGFβ-1) и TGFβ-2 в Викс (дорожки 1 - 3) Как показано на ПЦР анализа. Переулок 4 является контроль воды. Ссылка ген используется был Gapdh. (D) Западный анализ помаркой показаны обильные выражения CD31 в эндотелиальных клетках собак митрального клапана (VECs) по сравнению с не выражение в Викс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. В vitro кальцификации крысы Викс. Осаждение CA в Викс относились с 2,7 мм Ca/2.5 мм Pi определяется: (A) фотографию ализарин красный S окрашивания клеточных монослои в колодец и (B) Колориметрическое определение Ca уровней после HCl выщелачивания. Студента t-тест был проведен для анализа значения между двумя группами. Результаты представлены как средний ± S.E.M. *p < 0,5 по сравнению с контролем; (n = 4).
Рисунок 3. Изменения выражения гена, связанные с Вик кальцификации. Сгиб изменения экспрессии мРНК Остеогенные маркеров Msx2(A), (B) Alpl, (C) Phospho1, (D) Runx2и (E) Enpp1 в Викс относились с 2,7 мм, Ca/2.5 мм Pi для 48 ч. выражение mRNA показано как раз изменение по сравнению с Джин эндогенного ссылку Gadph. Односторонний дисперсионный анализ, с использованием общей линейной модели, включающих попарного сравнения была выполнена для анализа значения между несколькими группами. Результаты представлены как средний ± S.E.M. **p < 0,01; p < 0,001 по сравнению с контролем; (n = 6). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Количество клапанов листовки | Культура пластины/колба |
9-15 | 1 в 12-ну пластины |
15-30 | 1 в 6-ну пластины |
30 + | T25 |
Таблица 1. Общие руководящие принципы для количество листовок, необходимые для начального заполнения.
Этот подробный протокол описывает практический метод для приобретения первичных крыса Викс, включение изоляции эти клетки из клапанов сердца крыс путем ферментативного пищеварения. Далее наш метод поддерживает и расширяет использование сообщалось ранее крыса в vitro модель для изучения аортального клапана кальцификации13. Изоляции Викс от аортальный клапан вводит потенциал для загрязнения от соседних VECs. Однако наши иммунофлюоресценции данные подтверждают, что первоначальный пищеварение шаг достаточно, чтобы удалить VECs, рендеринга изолированных клеток негативные для маркера эндотелиальных клеток, CD31. Кроме того α-SMA пятнать подтверждает активированные фенотип Викс, который необходим для кальцификации12.
Вик изоляции ранее сообщалось в крупных животных моделей6,,78. Однако эти виды сдерживаются ограниченным генетические и молекулярные инструменты для вниз по течению исследования, а также их ограничения доступности в лабораториях во всем мире. В отличие от этого хорошо известны такие инструменты в наличии грызунов и, следовательно, способность изолировать крыса производные Викс позволяет емкостью экспериментальный дизайн больше. Использование Викс из молодых крыс также означает, что клетки являются относительно более пролиферативная, чем старых крыс, поэтому требует меньше животных, чтобы принести больше клеток. Хотя мышей были легко доступны, но из-за мышей имея меньше, особенно сердца, изоляции первичных мыши Викс бы гораздо больше времени и значительно больше животных необходимо будет изолировать же выход клеток как крысы модель.
Значительное преимущество этого описанный подход является, что Викс могут быть изолированы височно от дикого типа и трансгенных крыс, а также модели крыса сердечно-сосудистых заболеваний и клапан травмы. Используя модель крыса потребует большего количества животных для больших масштабах экспериментов, поэтому сократить использование животных, первичный крыса Викс может быть преобразован производить линию клеток после того, как оно характеризуется хорошо.
Хотя широко признаются серьезные клинические последствия CAVD, основополагающих причинных механизмов еще предстоит определить. Кроме того эффективное лечение, методы лечения, которые могут предотвратить и вылечить потенциально кальцификации клапана аорты не доступны в настоящее время. Культура Викс под большеклеточная условий таким образом обеспечивает весьма актуальным в vitro модель CAVD. Мы покажем, что повышенные уровни Ca и Pi побудить в vitro кальцификации изолированных крыса Викс с соответствующим увеличением в выражении Остеогенные генетических маркеров Msx2, Alplи Phospho1. Широко, установлено, что эти маркеры, связанные с патологическим процессом сосудистой кальцификации14,,1516. Поэтому наши данные показывают, что культура крыса Викс в большеклеточная среднего является подходящей модели с которым учиться кальцификации клапана аорты в пробирке. Действительно недавние исследования от нашей лаборатории использовали эту модель, чтобы продемонстрировать, что Ca способствует кальцификации клапана аорты через обогащение Annexin VI Вик производные матрица везикулы17.
Несмотря на преимущества использования крыса Викс и их эффективную квалификацию некоторые ограничения все еще существуют. Во-первых численность населения Вик в крыса клапаны очень мала, и поэтому многие животные необходимы для создания достаточного числа клеток для обширной в vitro исследования. Однако это можно преодолеть это ограничение путем проведения предварительных исследований в увековечен клапан интерстициальных клеток линии, как недавно сообщали нам18и впоследствии использования первичных культур для проверки и расширить эти выводы.
В целом описан метод объясняет успешной изоляции, культуры и кальцификации первичных крыса Викс, которых может впоследствии оцениваться с использованием различных анализов, включая биохимические анализы, а также белка и РНК анализов. Эта модель предлагает надежный и удобный система, в которой расследовать CAVD в пробиркеи представляет собой ценный инструмент для Изучение молекулярных механизмов, ответственных за этой разрушительной болезни.
Авторы не имеют ничего сообщать.
CD31 антитела, используемые был щедрый подарок от Доктор Карен Тан, Эдинбургский университет. Это исследование было поддержано финансирование биотехнологии и биологических наук исследовательский совет (СИББН) в виде гранта на Институт стратегической программы (BB/J004316/1; BBS/E/D/20221657) (Вэм и CF), Институт карьеры путь стипендий BB/F023928/1 (ВЭМ) и студенчества финансирование через случай СИББН студенчества BB/K011618/1 (LC).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dissection scissors | World Precision Instruments | 14393 | Autoclave before use. |
Spring straight (8 mm blade) | World Precision Instruments | 15905 | Autoclave before use. |
SuperFine Vannas scissors (5 mm blade, 8 cm) | World Precision Instruments | 14003 | Autoclave before use. |
Dumont #5 tweezers (11 cm) | World Precision Instruments | 500342 | Autoclave before use. |
DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320074 | |
Foetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | Filter before adding to culture medium. |
Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15710049 | |
Absolute ethanol | Thermo Fisher Scientific | E/0650DF/17 | Dilute to 70% v/v in distilled water. |
Hydrochloric acid (HCl) | Thermo Fisher Scientific | H1150PB17 | Dilute to 0.6M with distilled water. |
Sodium hydroxide (NaOH) | Thermo Fisher Scientific | UN1823 | Dilute to 0.1M with distilled water. |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse antibody | Thermo Fisher Scientific | A11005 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit antibody | Thermo Fisher Scientific | A21206 | 1/250 dilution in antibody dilution buffer. |
Superscript II kit | Thermo Fisher Scientific | 18064014 | |
dNTP | Thermo Fisher Scientific | 18427013 | |
Random primers | Thermo Fisher Scientific | P/N58875 | |
Taq Polymerase kit | Thermo Fisher Scientific | 18038026 | |
Tris/Borate/EDTA (TBE) | Thermo Fisher Scientific | AM9863 | Dilute to 1x with distlled water, before use. |
Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500 | 2% in 1x Tris/Borate/EDTA(TBE). |
Lysis buffer (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | 89900 | |
T75 flask | Thermo Fisher Scientific | 156472 | |
T175 flask | Thermo Fisher Scientific | 159920 | |
qPCR plates | Thermo Fisher Scientific | AB0990 | |
Rat Msx2 primer | Qiagen | QT01084090 | |
Rat Alpl primer | Qiagen | QT00190680 | |
Rat Enpp1 primer | Qiagen | QT00181426 | |
RNeasy minikit | Qiagen | 74104 | |
6-well plates | Sigma | CLS3516 | |
T25 flask | Sigma | CLS430639 | |
Monobasic phosphate | Sigma | S5011 | |
Dibasic phosphate | Sigma | S5136 | |
Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma | 5030 | Dilute to 0.1% with 0.1M NaOH. |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS. |
Triton X100 | Sigma | X100 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3059 | |
Alizarin red S | Sigma | A5533 | Make up to 2% with distilled water, and adjust to pH 4.2. |
TGFβ-1 primer pair: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
TGFβ-2 primer pair: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG | Sigma | Concentration used: 10 μM | |
Monoclonal Anti-β-Actin−Peroxidase antibody produced in mouse | Sigma | A3854 | 1/50000 dilution in 5% BSA in tris-buffered saline + 0.1% Tween (TBS/T). |
Mouse anti-vimentin antibody | Sigma | v6389 | 1/900 dilution in antibody dilution buffer (1x phosphate buffered saline (PBS), 1% bovine serum albumin (BSA), 0.3% Triton X-100). |
Mouse IgG | Sigma | I5381 | Diluted to the same stock concentration as mouse anti-vimentin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
Rabbit IgG | GeneTex | GTX35035 | Diluted to the same stock concentration as rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer. |
Rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody | Abcam | ab5694 | 1/200 dilution in antibody dilution buffer. |
Rabbit anti-CD31 | Abcam | ab28364 | 1/50 dilution in 5% BSA inTBS/T. |
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody | Dako | P0448 | 1/3000 dilution in in 5% BSA in TBS/T. |
Collagenase II | Worthington | 41512862 | Adjust to 425 U/mL with distilled water, and then filter. |
SYBR green mastermix | Primerdesign | PrecisionPLUS-MX-SY | |
Calcium assay kit | Randox | CA590 | |
DC protein assay kit | Bio-Rad | 5000111 | |
ECL reagent | GE Healthcare | RPN2109 | |
Hyperfilm ECL | GE Healthcare | 28906837 | |
Nitrocellulose membrane | GE Healthcare | 10600007 | |
PCR ladder | Bioline | BIO-33057 | |
Loading dye for gel electrophoresis | New England Biolabs | B7025S | |
Syringe filters (0.22 μm) | Merck Millipore | SLGP033RS | |
Coverslips | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3100 | |
Hematocytometer | Marienfeld Superior | 640030 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Camera set up for Alizarin red images: | |||
Camera | Nikon D800 | ||
Lens | Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED | ||
Dissection forceps 10 cm, curved ends | World Precision Instruments | 15915 | Autoclave before use. |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены