절연 및 기본 쥐의 밸브 중간 세포: 관상동맥 밸브 석 회화를 공부 하는 새로운 모델

요약

이 프로토콜 절연, 문화, 및 석 회화의 쥐 파생 밸브 중간 셀의 calcific 대동맥 밸브 질환 (CAVD)의 높은 생리 적 체 외에서 모델에 설명합니다. 이 쥐 모델의 착취 셀 및 분자 메커니즘이 복잡 한 병 적인 과정을 기초에 CAVD 연구를 촉진 한다.

초록

Calcific 대동맥 밸브 질환 (CAVD) 대동맥 밸브 전단의 진보적인 두껍게 특징 이다. 그것은 노인 및 끝 단계 신장 질병 (ESRD) 환자, 일반적으로 hyperphosphatemia와 아 고통에서 자주 발견 하는 조건이 다. 현재,의 진행을 막을 수 없습니다 약물 요법이 있다. 이 병 적인 과정의 기반이 되는 메커니즘은 불분명 남아 있다. 대동맥 밸브 전단 밸브 중간 셀 (피해자)는 VECs 사이 대동맥 cusps의 외부 표면에 얇은 층의 밸브 내 피 세포 (VECs)로 구성 된다. 쥐 모델의 사용에는 vivo에서 physiopathological 혈 청 인산 (Pi) 및 hyperphosphatemia와 아에서 고통 받는 환자의 칼슘 (Ca) 수준에 따라 소성 석 회화의 생체 외에서 연구를 수 있습니다. 설명된 프로토콜 세부 순수한 쥐 빅 인구의 빅 표시자의 식에 의해 표시 된 대로: 알파-부드러운 근육 걸 (α-SMA) vimentin 및 조직 성장 인자 베타 (TGFβ) 1과 2, 그리고 차별화 (CD) 31, 한 VEC의 클러스터의 부재 표식입니다. 이러한 피해자를 확대 하 여 연구 하 고 해명 CAVD underpinning 키 중재자 생화학, 유전, 및 이미징 연구를 수행할 수 있습니다.

서문

건강 한 관상동맥 밸브는 밸브의 개폐 중 기계적 스트레스의 분포는 똑같이 apportioned 세 전단지의 구성 됩니다. 밸브 전단은 3 개의 명료한 층의 정의 구조: fibrosa, spongiosa, 및 ventricularis, 어떤 집 우위 한 세포 유형으로 중간 셀 (피해 자들은) 밸브. 이러한 3 개의 계층 밸브 내 피 세포 (VECs)¹의 두 침대 사이 끼워 넣으면 됩니다.

피해자의 Calcific 대동맥 밸브 석 회화 (CAVD), 서방 세계에서 가장 일반적인 심장 밸브 질병 진행에서 중요 한 역할을 한다. CAVD은 적극적으로 판 막 병 조직과 그 주변 microenvironment에 의해 규제 진보적인 조건으로 설명 되어 있습니다. 세포질 변화는 처음 거리 두껍게, 그리고 결국 대동맥 밸브 전단의 광범위 한 석 회화 발생할. 이 다음 중요 한 관상동맥 밸브 협 착 증에 지도 하 고 궁극적으로, 왼쪽 심 실 유출 방해², 떠나는 유일한 치료로 수술 밸브 교체.

CAVD의 이상 복잡 하지만 생리 뼈 강화 작용³비슷한 메커니즘을 공유 합니다. 연구의 숫자 osteogenic 트랜스-차별화 및 석 회화^4,5을 피해자의 능력을 보여 준, 하는 동안이 과정을 underpinning 메커니즘은 아직 완전히 해명 될 강조는 모델을 실현 하 고 관련 생체 외에서 CAVD의 중요 한 요구 사항입니다.

실험실 수로 이전 작업, 돼지와 소 모델에서 피해자를 고립 된 성공적으로 있으며 조건^6,,78석 회화에서이 세포 배양. 이러한 모델에 관상동맥 밸브의 큰 크기로 인해 효소 소화를 통해 세포의 고립 세포의 순수한 인구 생성에 매우 효과적인 되었습니다. 그러나,이 모델은 대형 동물 종에 대 한 분자 도구의 한정 된 가용성으로 인해 제한 수 있습니다. 대조적으로, 설치류 모델 상대적으로 낮은 비용, 유전자 조작에 대 한 잠재력 및 분자 도구를 쉽게 사용할 수의 광범위 한 배열 유리한 유지. 그러나, 작은 동물 모델에서 피해자의 격리 하지 널리 채택 된다, 작은 조직 샘플을 작업할 때 발생 하는 어려움의 가능성이 결과입니다.

이 상세한 프로토콜 쥐 피해자의 직접 격리에 대 한 포괄적인 방법을 보고합니다. 밸브, 일련의 효소 소화 다음의 주의 해 부에 의해 피해자는 절연 고 실험 기법, 셀 문화, 석 회화, 및 진 식 등의 다양 한 고용 될 수 있습니다. CAVD의 모델 관련성이 높은 생체 외에서 이 의심할 여 지 없이이 병 적인 과정의 우리의 지식을 증가에 필수적인 기여를 하게된다.

프로토콜

모든 동물 실험 위원회 사용자는로 슬 린 연구소의 동물에 의해 승인 했다 및 동물 치료 동물의 사용에 대 한 홈 오피스 (영국) 지침에 따라 유지 되었다. 아래에 설명 된 프로토콜에 대 한 5 주 오래 된, 남성 Sprague Dawley 쥐 사용 되었다.

1. 시 약 조리법

1. Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM)과 영양소 혼합 F-12 (DMEM/F12)를 사용 하 여 문화 매체 를 준비 합니다. 10% 소독 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1 %gentamicin 추가 합니다.
2. 석 회화 매체 문화 매체와 2.7 m m Ca/2.5 m m 파이 사용 하 여 준비 합니다.
   1. 555 mg CaCl₂ 개 무게와 1m CaCl₂의 5 mL을 증류수 5 mL 물에 용 해 하 여 1 M 칼슘 염화 물 (CaCl₂)를 준비 합니다. 솔루션 솔루션 소독 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 필터링.
   2. 710 mg 무수 염기 나트륨 인산 염 (Na₂HPO₄)과 각각 별도로 증류수 5 mL에 용 해의 무수 이수소 나트륨 인산 염 (NaH₂포₄), 600 밀리 그램 무게 1 M 나트륨 인산 염 을 준비합니다 물입니다. 솔루션을 소독 하는 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 나₂HPO₄ 의 3,870 µ L와 1130 µ L NaH₂포₄, 및 필터를 결합 합니다.
3. 버퍼를 세척 포함 하는 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 및 1 %gentamicin 준비.

2입니다. 절 개 후드의 준비

1. 모든 해 통풍 후드, 이전 샘플 및 시 약의 무 균을 보장 하기 위해 70% 에탄올으로 소독을 실시 합니다.
2. 압력가 마로 소독 그들 뒤에 70% 에탄올 이전 사용에 들어 있는 비 커에 도구 팁을 immersing에 의해 해 부 도구를 소독.
3. 워시 버퍼를 포함 하는 비 커를 준비 하 고 해 부 도구 동물 또는 조직 접촉으로 오기 전에 워시 버퍼에 담근 다. 모든 시간에 얼음에 워시 버퍼를 유지.

3입니다. 기본 쥐 피해자의 추출

참고: 아래에서 설명 하는 프로토콜에 대 한 5 주 오래 된, 남성 Sprague Dawley 쥐 사용 되었다.

1. 쥐를 추려 (~ 100 g) 영국 본사 지침에 따라 자 궁 경부 전위에 의해.
2. 각 쥐의 심장 밖으로 해 부하는 동물 부정사 유리 해 부 보드에 놓고 70% 에탄올을 분사 하 여 피부를 소독 합니다.
3. 해 부가 위, 복 부 구멍을 노출 하 고 흉 곽과 폐, 심장 폭로 조심 스럽게 제거의 도움으로 쥐의 중간에 4 cm 절 개를 확인 합니다.
4. 샤 프의 쌍을 가진 심 혼을 제거 하 고 곡선된가 위, 봄은 쥐의 모든 총 해 완료 될 때까지 해 부 심장 얼음 차가운 워시 버퍼에 저장.
5. 마이크로 해 부 각 심장, 페 트리 접시에 후자 전송 워시 버퍼에 덮여. 오름차순 대동맥 및 대동맥 루트 작은 지역으로 남아 있을 봄 연속가 위 (6 m m 블레이드)와 심장 근육을 잘라.
6. 동일을 사용 하 여 직선 위 (6 m m 블레이드) 봄, 신중 하 게 자르면 오름차순 대동맥 좌 심 실 쪽으로 고 노출 대동맥 밸브 전단지.
7. 신선 하 고, 멸 균 페 트리 접시에 전송 열린된 대동맥 HBSS 가득합니다. 대동맥 밸브 전단지, 욕실이 형 capsulotomy 마이크로-가 위 (3 m m 블레이드)와 대동맥의 기지에서 그들의 독특한 'U' 모양으로 표시를 해 부.
8. 1.5 mL microcentrifuge 튜브 모든 해 완료 될 때까지 얼음 차가운 워시 버퍼의 1 mL에 모든 전단지를 저장 합니다.
9. 일단 모든 전단지 수확 되어, 워시 버퍼를 제거 하 4 ° C에서 1 분 x 100g에 그들을 원심.
10. 살 균을 위해 셀 문화 후드에서 다음 단계를 수행 합니다. 100 µ L 425 U/mL 콜라 II 37 ° c.에 5 분에 전단지 소화에 VECs를 제거 하려면 부드럽게 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 소화를 방해.
11. 30 100 x g에서 원심 분리기 전단지, 펠 렛은 상쾌한을 신중 하 게 삭제 하는 s. 500 µ L 워시 버퍼와 두 번 세척 하 고 다시 30 100 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은 s.
12. 전단지에서 피해자를 수확, 2 h, 425 U/mL 콜라 II의 100 µ L를 소화 하 고 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여 위아래로 부드럽게 pipetting으로 피해자를 놓습니다.
13. 문화 매체 및 작은 피해 자들은 고 나머지 밸브 전단지 파편을 5 분 동안 670 x g에서 원심 분리기의 19 ml에서 콜라 II 희석. 상쾌한, 취소 및 전단지 피해 자들은 문화 접시/플라스 크에 따라 전송 (표 1).
14. 문화 문화 매체, confluency 37 ° C, 5% (이산화탄소) CO₂, 존재에 도달할 때까지 5-7 일에 대 한 피해 자들은 후 72 h 매체를 변경. 생체 외에서 실험에 사용에 대 한 통행 최대 5 배까지 일단 confluency에 도달 100% 합니다.

4입니다. 쥐 피해자의 석 회화의 유도

참고: 모든 실험, 세포는 hemocytometer 포함.

1. 시드 및 오염을 방지 하기 위해 소독된 후드에 뿌리고 모든 1 차 셀을 수행 합니다. 기본 쥐 피해 자들은 실험 체 외에 석 회화를 준비 하려면 셀 150, 000 셀/잘 6-잘 접시의 조밀도에 씨. ≥ 90 %confluency (일반적으로 72 h)까지 문화 매체에 유지 합니다.
2. 제어 매체 대 석 회화와 피해자를 취급 하 고 37 ° C, 5% CO₂, 추가 72 h에 대 한 존재에서 품 어.
3. 석 회화 기본 쥐 피해 자들은 후속 다운스트림 분석에 대 한 연구, 석 회화/제어 매체를 제거 하 고 세척 비 바운드 Ca 및 Pi 이온 제거에 워시 버퍼와 monolayers.

5. 쥐 빅 특성화

1. Immunostaining vimentin와 α-SMA, 씨앗 150, 000 셀/잘 6 잘 플레이트의 밀도에 쥐 피해 자들은 같은 phenotypic 표식에 대 한 모니터링에 대 한 커버 전표 (셀 커버 전표의 표면에 성장할 것입니다)를 포함 하 고 50 %confluency 성장.
2. 문화 매체를 발음 하 고 수정 셀 monolayers 4 %paraformaldehyde (PFA)와 10 분 동안 그들 버퍼링 하는 인산 염 (PBS), 3 시간을 세척 하기 전에 5 분 각 시간에 대 한.
   주의: PFA 독성 이며 신중 하 게 처리 해야 합니다.
3. 차단 하 고 permeabilization 버퍼와 셀 단층을 품 어 (1 x PBS, 2 차 항 체로 동일한 종에서 정상적인 혈 청의 5%, 0.3% 트라이 톤 X-100) 실 온에서 1 h.
4. 마우스 안티 vimentin 및 토끼 안티-α-SMA 항 체 항 체 희석 버퍼에 희석 된 셀 monolayers를 품 어 (1% 소 혈 청 알 부 민 + 0.3 %PBS Triton X-100) 하룻밤 4 ° C에서 부드럽게 흔들어 로커에.
   주: 부정적인 컨트롤 비 활용 된 마우스 IgG와 토끼 IgG, 같은 희석을 사용 하 여 테스트 샘플으로 구성 되어 있습니다.
5. 다음 날, 3 번 5 분 때마다 PBS로 1 차 항 체를 씻어.
6. 부드럽게 로커에 떨고 실 온에서 1 h에 대 한 2 차 항 체 fluorophore 활용으로 셀 monolayers를 품 어.
7. PBS, 3 번 세척 하 고 부드럽게 핀셋 (쥐 피해 자들은 포함)는 coverslips에 밖으로 한 쌍의 집게와 coverslip 포함 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)에와. 4 ° C에서 24 시간 이상 형광 현미경으로 시각화 하기 전에 치료 하는 슬라이드를 둡니다.
8. 서쪽 오 점 분석에 대 한 150, 000의 밀도에서 피해 자들은 셀/6 잘 플레이트에 잘하고 confluent 100%까지 문화 매체에 성장에 두고 쥐 씨.
9. 단백질의 8 µ g를 사용 하 여 실행 CD31 표현을 측정 하 여 VEC 오염을 배제 서쪽 오 점.
   참고: 앞에서 설명한⁹표준 서쪽 오 점 프로토콜 미행 했다.
10. 유전자 연구에 대 한 제조업체의 지침에 따라 상업 키트를 사용 하 여 ribonucleic 산 (RNA)을 추출 합니다.
11. 반전 녹음 방송을 사용 하 여 대상 유전자 식 연쇄 반응 (PCR)를 사용 하 여 측정 하는 cDNA를 취득 및 실시간 PCR (RT-PCR; 일컬어 정량) 녹색 fluorophore 감지 Gapdh 이전 참조 유전자로 사용 하 여 설명된¹⁰.
    1. 다음 프로그램을 사용 하 여 PCR 분석: 30 94 ° C의 30 주기 3 분, 94 ° C의 1 주기 s, 63 ° C 30에 대 한 s, 72 ° C 35 s, 그리고 5 분 동안 72 ° C의 마지막으로 1 사이클.
    2. 다음 프로그램을 사용 하 여 정량 분석: 95의 40 주기 10 분 동안 95 ° C의 1 주기 30 s, 및 95 ° C 30에 대 한 15 초, 1 분, 1 분, 55 ° C 95 ° C의 추가 주기 위한 60 ° C에 ° C s.
12. 트리 스/Borate/EDTA (TBE) 버퍼에는 2 %agarose 젤을 사용 하 여 PCR 제품 분석을 젤 전기 이동 법을 실행 합니다.

6. 쥐 빅 석 회화 연구

1. 알리자린 레드 S 및 생 화 확 적인 석 회화 연구, 4 섹션에 설명 된 시드 및 석 회화 지침을 따르시기 바랍니다.
2. 5% 붉은 알리자린 S 솔루션, 부드럽게 20 분 통에 락 셀 monolayers 얼룩. 이후 5 분 때마다 증류수 3 번 씻어. 각 잘의 이미지를 취득 합니다.
3. 생화학 Ca 분석 결과 키트를 사용 하 여 계량 Ca 증 착. 캘리포니아^{2 +} 이온 0.6 M 염 산 (HCl)를 사용 하 여 부드러운 동요와 4 ° C에서 24 h에 대 한 거.
4. 수확은 상쾌한 측정 분석 결과 Ca를 사용 하 여 Ca 농도 키트 ( 재료의 표참조) 제조 업체의 지침에 따라.
5. 총 세포질 단백질의 일부분으로 칼슘 농도 계산 합니다. 0.1 M 수산화 나트륨 (NaOH) + 0.1% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 세포 monolayers에서 세포질 단백질 변성 제조업체의 지침에 따라 세제 호환 (DC) 단백질 분석을 사용 하 여 총 단백질 농도 결정 합니다.

결과

이 프로토콜의 목표 기본 쥐 피해자의 격리를 설명 하 고 석 회화 실험 체 외에 문화를 했다. 위에서 설명한 방법을 사용 하 여 쥐 피해 자들은 성공적으로 고립 되 고 CAVD에 대 한 책임 메커니즘의 연구에 대 한 확장.

쥐 주 피해자 공동 설립된 빅 마커 지역화:

격리 된 셀 빅 형 빅 표식에 대 한 면역 형광 검사를 통해 확인 했다: vimentin와 α-SMA (빨간색과 녹색, 각각 그림 1A), 이전 보고서^11,12계약입니다. 비 활용 된 마우스와 토끼 IgG 사용 하 여 대표 부정적인 컨트롤 그림 1B에서 표시 됩니다. 또한, 빅-성장 레 귤 레이 터 TGFβ-1 TGFβ-2의 식 PCR 분석 (그림 1C)을 사용 하 여 확인 되었다. 서쪽 오 점 분석 그 쥐를 확인 하기 위해 수행 되었다, 고립 된 쥐 주 피해자 했다 내 피 오염에서 무료로 확인 피해 자들은 부정 했다 CD31, 내 피 세포 표식에 대 한 긍정적인 제어 ( 로 개 mitral VECs를 사용 하 여 그림 1D).

Ca와 Pi 쥐 빅 석 회화 유도:

높은 조직의 Ca 또는 Pi 농도 일반적으로 피해자 체 외의 석 회화를 드라이브. 피해 자들은 격리 된 쥐의 석 회화 가능성, 감사 셀 ESRD 환자에서 병 적인 아 및 hyperphosphatemia 조건 모방 Ca와 Pi의 높은 수준에 노출 되었다. 2.7 m m Ca/2.5 m m 파이와 피해자의 치료 유도 석 회화, 알리자린 레드 S Ca 증 착 (그림 2A)와 HCl (81 배; leaching 다음 Ca 레벨의 색도계 결정에 대 한 얼룩에 의해 결정 되 학생의 t를 사용 하 여 p < 0.05-테스트; 그림 2B)입니다.

진 식 변경 빅 석 회화와 관련 된:

생체 외에서 혈관 세포의 석 회화 별개 분자 프로 파일에 연결 됩니다. 현재 연구에서 2.7 m m Ca/2.5 m m 파이와 피해자의 치료 osteogenic 마커의 mRNA 식에 상당한 증가 유발: Msh homeobox 2, Msx2 (2.04 배 변화; p < 0.01; 그림 3A), 알칼리 성 인산 가수분해 효소, Alpl (1.49 배 변화; p < 0.001; 그림 3B), 및 phosphoethanolamine/phosphocholine 인산 가수분해 효소, Phospho1 (4.7 배 변화; p < 0.01 일방통행 ANOVA;를 사용 하 여 그림 3C)입니다. 그러나, osteogenic 표식, Runx2및 석 회화 억제 물 ectonucleotide pyrophasphatase, Enpp1의 식을 그대로 (그림 3D-E) 남아 있었다.

그림 1입니다. 빅 마커의 식. (A) 면역 형광 밸브 중간 셀 (피해자)에 더블 얼룩, 알파-부드러운 근육 말라 (α-SMA; 녹색)와 vimentin의 colocalization를 보여주는. (B) 마우스와 토끼 IgG 사용 하 여 부정적인 컨트롤의 대표 이미지. 핵은 블루 4', 6-diamidino-2-phenylindole를 사용 하 여 (DAPI)에 물 들 다. 눈금 막대 = 50 µ m. (C) 변형 시키는 성장 인자 beta 1 (TGFβ-1)의 존재와 피해자에 TGFβ-2 (차선 1-3) PCR 분석에 의해 표시 된 대로. 레인 4 물 컨트롤입니다. 사용 하는 참조 유전자 Gapdh이었다입니다. (D) 서쪽 오 점 분석 CD31의 풍부한 식 식이 없는 피해자에 비해 개 승 모 판 내 피 세포 (VECs)에서 보여주는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2입니다. 쥐 피해 자들은의 석 회화 생체 외에서 . 피해 자들은 증 착 Ca 치료 2.7 m m Ca/2.5 m m Pi에 따라: (A) 사진 보여주는 알리자린 레드 S 잘, 그리고 (B) HCl leaching 다음 Ca 레벨의 색도계 결정에 전체 셀 monolayers의 얼룩. 학생의 t-테스트 두 데이터 그룹 간의 의미 분석을 수행 했다. 결과 ± S.E.M.를 의미 하는 대로 표시 됩니다 *p < 0.5 제어;와 비교 (n = 4).

그림 3입니다. 빅 석 회화와 관련 된 유전자 표현 변경. Msx2(A), (B) Alpl, (C) Phospho1, (D) Runx2, 배 osteogenic 마커의 mRNA 식에서 변경 하 고 (E) Enpp1 피해자에서 Ca/2.5 m m에 대 한 Pi 2.7 m m로 치료 48 h. mRNA 식 생 참조 유전자에 비해 배 변화로 표시 됩니다 Gadph. 쌍 단위 비교를 통합 하는 일반 선형 모델을 사용 하 여 단방향 ANOVA 여러 그룹 간의 의미 분석을 수행 했습니다. 결과 ± S.E.M.를 의미 하는 대로 표시 됩니다 * *p < 0.01; p < 0.001 제어;에 비해 (n = 6). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

밸브 전단의 수	문화 접시/플라스 크
9 ~ 15	1 12-잘 접시에 잘
15 ~ 30	6 잘 플레이트에서 1
30 +	T25

표 1. 초기 시드에 필요한 전단지의 번호에 대 한 일반적인 지침.

토론

이 상세한 프로토콜 기본 쥐 피해 자들은, 효소 소화를 통해 쥐 심장 밸브에서 이러한 셀의 사용의 수집에 대 한 실제적인 방법을 설명 합니다. 우리의 방법은 더 지원 하 고 관상동맥 밸브 석 회화¹³연구 모델 생체 외에서 이전에 보고 된 쥐의 사용을 확장 합니다. 대동맥 밸브에서 피해자의 격리 이웃 VECs에서 오염에 대 한 가능성을 소개합니다. 그러나, 우리의 면역 형광 검사 데이터 초기 소화 단계 고립 된 세포를 내 피 세포 마커, CD31 부정적인 렌더링 VECs 제거 충분 한지 확인 합니다. 또한, α-SMA 얼룩 확인는 피해자의 활성화 형은 석 회화¹²필요 합니다.

빅 격리 이전에 보고 된 큰 동물 모델^6,,78. 그러나, 이러한 종 다운스트림 연구로 전 세계 실험실에서 그들의 제한 된 액세스에 사용할 수 있는 제한 된 유전 및 분자 도구에 의해 제약 됩니다. 반면, 이러한 도구를 쉽게 사용할 수 있는 설치류에 따라서 능력을 분리 쥐 파생 된 피해자 수는 큰 실험 설계 용량 잘 설립 있습니다. 젊은 쥐에서 피해자의 사용 또한 세포는 상대적으로 더 오래 된 쥐, 따라서 더 많은 세포를 더 적은 동물이 요구 보다 증식을 의미 합니다. 마우스는 쉽게 액세스할 수, 하지만 쥐 때문 특히 작은 마음, 격리 하는 데 기본 마우스의 피해자 더 많은 시간이 소요 될 것 이라고 하 고 상당히 많은 동물 쥐 모델 셀의 동일한 수익률을 격리 하는 데 필요한 것입니다.

이 기술된 접근의 중요 한 이점은 피해 자들은 야생 종류와 유전자 변형 쥐 뿐만 아니라 심혈 관 질환과 밸브 상해의 쥐 모델에서 일시적으로 고립 될 수 있다 이다. 쥐 모델을 사용 하 여 필요 동물의 더 큰 수 대규모 실험, 따라서 동물 사용을 줄이기 위해, 그것을 잘 특징은 일단 셀 라인 생산 주 쥐 피해 자들은 변형 될 수 있다.

CAVD의 심각한 임상 의미 널리 인식 하 고, 하는 동안 근본적인 원인이 메커니즘은 아직 확인할 수 있다. 또한, 효과적인 약물 치료를 방지 하 고 잠재적으로 관상동맥 밸브 석 회화 치료 수 있습니다에서 사용할 수 있습니다 선물. 석 회화 조건 아래 피해자의 문화는 그러므로 CAVD의 관련성이 높은 생체 외에서 모델을 제공 합니다. 우리는 높은 Ca 및 Pi 수준 osteogenic 유전자 마커 Msx2, Alpl및 Phospho1의 표현에 수 반하는 증가 가진 고립 된 쥐 피해자의 체 외에 석 회화 유도 보여. 그것은 널리 이러한 마커 혈관 석 회화^14,,1516의 병 적인 프로세스와 관련 된 설립. 우리의 데이터는 따라서 쥐 피해 자들은 중간 석 회화에 문화는 관상동맥 밸브 석 회화 시험관을 공부 하는 적절 한 모델을 보여준다. 실제로, 우리의 실험실에서 최근 연구는 캘리포니아 빅 파생 매트릭스 소포¹⁷의 Annexin VI 농축을 통해 관상동맥 밸브 석 회화 촉진 입증이 모델을 활용 하 고 있다.

쥐 피해 자들은 그들의 효율적인 특성을 사용 하 여의 혜택에도 불구 하 고 몇 가지 제한이 여전히 존재 한다. 첫째, 쥐 밸브 내 빅 인구의 크기는 매우 작습니다, 그리고 따라서 많은 동물 광범위 한 생체 외에서 연구에 대 한 충분 한 셀 번호를 생성 하기 위해 필요. 그러나, 그것은 불멸 하 게 밸브 중간 셀 라인, 최근에¹⁸, 우리가 보고 하 고 이후 주 문화를 고용 확인 하 고 이러한 연구 결과 확장 사업 예비 연구 하 여이 제한을 극복 하기 위해 가능 하다.

요약, 설명된 방법 성공적인 절연, 문화, 및 기본 쥐 수 있습니다 이후에 평가 분석을 포함 한 생 화 확 적인 분석 실험 단백질 및 RNA 분석의 다양 한을 사용 하 여 피해자의 석 회화를 설명 합니다. 이 모델 CAVD에서 생체 외에서조사 하는 안정적이 고 편리한 시스템 고이 파괴적인 질병에 대 한 책임 분자 메커니즘을 조사에 대 한 유용한 도구를 제공 합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection scissors	World Precision Instruments	14393	Autoclave before use.
Spring straight (8 mm blade)	World Precision Instruments	15905	Autoclave before use.
SuperFine Vannas scissors (5 mm blade, 8 cm)	World Precision Instruments	14003	Autoclave before use.
Dumont #5 tweezers (11 cm)	World Precision Instruments	500342	Autoclave before use.
DMEM-F12	Thermo Fisher Scientific	11320074
Foetal bovine serum	Thermo Fisher Scientific	10500064	Filter before adding to culture medium.
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	15710049
Absolute ethanol	Thermo Fisher Scientific	E/0650DF/17	Dilute to 70% v/v in distilled water.
Hydrochloric acid (HCl)	Thermo Fisher Scientific	H1150PB17	Dilute to 0.6M with distilled water.
Sodium hydroxide (NaOH)	Thermo Fisher Scientific	UN1823	Dilute to 0.1M with distilled water.
DAPI	Thermo Fisher Scientific	P36931
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A11005	1/250 dilution in antibody dilution buffer.
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit antibody	Thermo Fisher Scientific	A21206	1/250 dilution in antibody dilution buffer.
Superscript II kit	Thermo Fisher Scientific	18064014
dNTP	Thermo Fisher Scientific	18427013
Random primers	Thermo Fisher Scientific	P/N58875
Taq Polymerase kit	Thermo Fisher Scientific	18038026
Tris/Borate/EDTA (TBE)	Thermo Fisher Scientific	AM9863	Dilute to 1x with distlled water, before use.
Agarose	Thermo Fisher Scientific	16500	2% in 1x Tris/Borate/EDTA(TBE).
Lysis buffer (RIPA)	Thermo Fisher Scientific	89900
T75 flask	Thermo Fisher Scientific	156472
T175 flask	Thermo Fisher Scientific	159920
qPCR plates	Thermo Fisher Scientific	AB0990
Rat Msx2 primer	Qiagen	QT01084090
Rat Alpl primer	Qiagen	QT00190680
Rat Enpp1 primer	Qiagen	QT00181426
RNeasy minikit	Qiagen	74104
6-well plates	Sigma	CLS3516
T25 flask	Sigma	CLS430639
Monobasic phosphate	Sigma	S5011
Dibasic phosphate	Sigma	S5136
Calcium chloride	Sigma	C1016
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Sigma	5030	Dilute to 0.1% with 0.1M NaOH.
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Dilute to 4% with PBS.
Triton X100	Sigma	X100
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A3059
Alizarin red S	Sigma	A5533	Make up to 2% with distilled water, and adjust to pH 4.2.
TGFβ-1 primer pair: f: GCTACCATGCCAACTTCTGT r: TGTGTTGGTTGTAGAGGGCA	Sigma		Concentration used: 10 μM
TGFβ-2 primer pair: f: GAAGGCAGAGTTCAGGGTCT r: CGCTGGGTTGGAGATGTTAG	Sigma		Concentration used: 10 μM
Monoclonal Anti-β-Actin−Peroxidase antibody produced in mouse	Sigma	A3854	1/50000 dilution in 5% BSA in tris-buffered saline + 0.1% Tween (TBS/T).
Mouse anti-vimentin antibody	Sigma	v6389	1/900 dilution in antibody dilution buffer (1x phosphate buffered saline (PBS), 1% bovine serum albumin (BSA), 0.3% Triton X-100).
Mouse IgG	Sigma	I5381	Diluted to the same stock concentration as mouse anti-vimentin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer.
Rabbit IgG	GeneTex	GTX35035	Diluted to the same stock concentration as rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody prior to dilution in antibody dilution buffer.
Rabbit anti-α-smooth muscle actin antibody	Abcam	ab5694	1/200 dilution in antibody dilution buffer.
Rabbit anti-CD31	Abcam	ab28364	1/50 dilution in 5% BSA inTBS/T.
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody	Dako	P0448	1/3000 dilution in in 5% BSA in TBS/T.
Collagenase II	Worthington	41512862	Adjust to 425 U/mL with distilled water, and then filter.
SYBR green mastermix	Primerdesign	PrecisionPLUS-MX-SY
Calcium assay kit	Randox	CA590
DC protein assay kit	Bio-Rad	5000111
ECL reagent	GE Healthcare	RPN2109
Hyperfilm ECL	GE Healthcare	28906837
Nitrocellulose membrane	GE Healthcare	10600007
PCR ladder	Bioline	BIO-33057
Loading dye for gel electrophoresis	New England Biolabs	B7025S
Syringe filters (0.22 μm)	Merck Millipore	SLGP033RS
Coverslips	Scientific Laboratory Supplies LTD	MIC3100
Hematocytometer	Marienfeld Superior	640030
Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera set up for Alizarin red images:
Camera	Nikon D800
Lens	Nikon AF_s Micro, Nikko 105 mm, 1:2.8 GED
Dissection forceps 10 cm, curved ends	World Precision Instruments	15915	Autoclave before use.