ללא עדשה מיקרוסקופ וידאו עבור הדינמיקה וניתוח כמותי של תרבית תאים חסיד

Summary

וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ מאפשר לנו לעקוב אחר תרביות תאים ישירות בתוך החממה. כאן נתאר את פרוטוקול מלא נהגה לרכוש וניתוח של 2.7 היום רכישת בתרבית תאים הלה, שמוביל dataset של 2.2 x 10 שירים⁶ מדידות של תא בודד ומורפולוגיה 10584 מחזור התא.

Abstract

כאן, נדגים את הסרטון ללא עדשה מיקרוסקופ מאפשרת לנו לתפוס בו זמנית את קינטיקה של אלפי תאים ישירות בתוך החממה וכי ניתן לפקח ולכמת תאים בודדים לאורך כמה מחזורים התא. אנו מתארים פרוטוקול מלא שמשמש כדי לעקוב אחר ולכמת תרבות הלה תא ימים 2.7. ראשית, תא תרבות הרכישה מתבצע באמצעות מיקרוסקופ וידאו ללא עדשה, ולאחר מכן הנתונים זה נותחו בעקבות תהליך ארבעה שלבים: גל מרובה שיקום הולוגרפי, תא-מעקב, תא זיהוי פילוח, חלוקת התא אלגוריתמים. כתוצאה מכך, אנו מראים שאפשר לאסוף של הנתונים (dataset) הכולל יותר מ 10,000 מחזור התא מסלולים ומדידות יותר מ 2 x 10⁶ תאים מורפולוגי.

Introduction

בתרבית של תאים בתרבית במשך כמה מחזורים תא ומדידת במדויק תא וגודל תא יבש הוא משימה מאתגרת. מספר טכניקות ללא תווית אופטי מסוגלים לבצע את המשימה^1,2: שלב-shifting אינטרפרומטריה³, מיקרוסקופ דיגיטלי הולוגרפי (סוג התושבות שלהם. מופיעים)^{4,5,6, 7}, quadriwave לרוחב הטיה אינטרפרומטריה^8,9 ו כמותיים שלב טומוגרפיה^10,11. שיטות אלה הובילו תובנות חדשות רבות ההבנה של מחזור התא של תאי יונקים. אולם הם נמצאים לעתים רחוקות ביחד עם תא אוטומטי מעקב אלגוריתמים התפוקה שלהם נותר מוגבל כאשר מודדים את התא מסלולים מסה¹ (N < 20 בהתאמה^{3,4,5 , 6}). לפיכך שיטה אופטי יש צורך למדוד את התא מסלולים המוני עם סטטיסטיקה גדולים (N > 1000).

בנייר זה, נדגים את היכולת של וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ בו-זמנית תמונה אלפי תאים ישירות בתוך החממה ולאחר מכן לכמת תא בודד מדדים לאורך אלפי שירים בודדים מחזור התא. ללא עדשה מיקרוסקופ הוא שלב כמותיים הדמיה טכניקה המאפשרת רכישת תמונת שלב של תאים בצפיפות מעל שדה ראייה גדול מאוד (בדרך כלל כמה עשרות של מ מ², כאן 29.4 מ מ²)^{12,13 14, ,15}. במספר מדדים ברמת תא בודד נקבע, למשל, תא שטח, תא בנפח גדול יבש, עובי התא, אורך ציר מרכזי תא ותא יחס גובה-רוחב^12,15, של כל תמונה. לאחר מכן, על-ידי החלת אלגוריתם תא-מעקב, תכונות אלה יכולים להיות מותווים עבור כל תא ותא כפונקציה של ניסוי זמן^14,15. יתר על כן, על ידי גילוי המופע של חלוקות תאים על הפסים תא, זה אפשרי לחלץ מידע חשוב אחר כגון התא הראשוני יבש בנפח גדול (רק לאחר חלוקת התא), המסה יבשות תא הסופי (ממש לפני חלוקת התא), התא מחזור משך, כלומר, הזמן בין שתי חטיבות ברציפות¹⁵. כל המדידות הללו יכול להיות מחושב עם סטטיסטיקה טובה מאוד (N > 1000) מאז שדה הראייה גדול יאפשר בדרך כלל הניתוח של 200 עד 10,000 תאים ברכישת יחידה ללא עדשה.

על מנת להסביר מתודולוגיה זו מבוסס על וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ, נתאר את פרוטוקול כדי לפקח, לכמת תרבות הלה תא ימים 2.7. ניתוח נתונים הוא תהליך ארבעה שלבים בהתבסס על שחזור הולוגרפית גל רב, תא-מעקב, פילוח תא ואלגוריתמים חלוקת התא. כאן הוא הראה כי הרזולוציה המרחבית, את קצב המסגרות מהיר יחסית (רכישה אחת כל 10 דקות) שהושג עם תוכנית התקנה זו וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ הוא תואם עם אלגוריתמים תא-מעקב רגיל. ניתוח מלא של ערכת נתונים זה תוצאות המדידה של רצועות תא 10,584 על מחזורי תא שלם.

לסיכום, וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ הוא כלי רב עוצמה כדי לפקח באופן אוטומטי אלפי ללא תווית, שאינו מסונכרן ותאים שלא שונתה לכל ניסוי; כל תא במעקב במשך כמה מחזורים התא. המידות שלנו ובכך לספק את הערך הממוצע של מספר פרמטרים תא, אבל יותר חשוב, ההשתנות הבין-תאית על אוכלוסיה גדולה של תאים.

Protocol

1. תרבית תאים פיקוח על רכישת

1. לגדול הלה בתאים DMEM + גלוטמין (למשל, GlutaMAX) בינוני בתוספת 10% (v/v) חום-לא פעיל עגל עוברית סרום ו 1% פניצילין, סטרפטומיצין.
2. מעיל טוב 6 זכוכית תרבות לוחות עם fibronectin (25 µg/mL) לשעה. ואז זרע 2 x 10 תאים⁴ לכל טוב.
3. במהלך רכישת, לשנות את המדיום כל 3 ימים.
4. עבור רכישת זמן לשגות, השתמש וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ (זמינים מסחרית).
   הערה: זה מבוסס על טכניקת דימות ללא עדשה חישובית כפי שתואר על ידי. Ozcan et al. ¹⁶ אשר שונתה כדי לבצע ניטור רציף באינקובטור בטמפרטורה מבוקרת של 37 ° C^12,15. הוא כולל חיישן התמונה משלימים תחמוצת מתכת מוליכים למחצה (CMOS) עם זריקה פיקסל של מיקרומטר 1.67 ואזור הדמיה של 6.4 x 4.6 מ מ². תאורה גל מרובים מסופק על ידי multichip אור פולטות דיודות (נוריות) התקן, אשר מספק תאורה אדום, ירוק וכחול. אורכי הגל מרוכזים, על 636, 521, 452 nm בהתאמה, עם רוחב הפס ספקטרלי של 25, 45 ו- 25 ננומטר בהתאמה. אדום-ירוק-כחול (RGB) הנוריות ממוקמים מעל 150 הקדמוניות מיקרומטר ממרחק של 5 ס מ התאים. הכוח אור נמדד בקרבת ה-LED הוא נמוך כמו 10 µW-כל גל והוא הזמן תאורה רק שנייה אחת לכל רכישה. לפיכך, אין בעיות רעילות צילום צפויים כאשר התא תרבויות מובחנות תחת מיקרוסקופ וידאו ללא עדשה.
5. לשים את המיכל תרבות תא לשים בקשר עם חיישן CMOS (איור 1). השתמש מיכל עם coverslip זכוכית בתחתית, וזה חשוב על האיכות של הרכישה ללא עדשה. מיכלי פלסטיק יכול לשמש גם אבל הרכישה ללא עדשה תגרע בשל איכות אופטית ירודה של גורמים מכילים אלה.
6. בקרת וידאו ללא עדשה מיקרוסקופ עם רכישת התוכנה (זמינים מסחרית), אשר מבצעת את רכישת זמן לשגות והן על שחזור הולוגרפי. הפרמטרים שצריכים להיות מוזנים על ידי המשתמש בממשק התוכנה הן קצב המסגרות, משך הזמן של הניסוי, ואת הסוג של תרבית תאים, תאים חסיד דהיינו או תאים צף.
7. הגדר את פרמטרי קלט של רכישת התוכנה. הגדר את קצב המסגרות מוגדר אחד רכישת כל 10 דקות, להגדיר את סוג התרבות התא 'חסיד'.
   הערה: קצב רכישת אחד כל 10 דקות היא פשרה טובה שהיא מבטיחה תא אמין מעקב בעוד גודל ערכת הנתונים וכתוצאה מכך שינותח הוא עדיין סביר. קצב המסגרות המהירה השגה עם תוכנית התקנה זו ללא עדשה מיקרוסקופ הוא אחד רכישת כל 5 דקות. להגדיל עוד יותר את קצב המסגרות תוצאות חימום יתר את חיישן CMOS אשר יכול להשפיע על הכדאיות של התאים בתרבות.
8. להתחיל את רכישת זמן לשגות, האלגוריתם שחזור הולוגרפי (זמינים מסחרית) יעבד באופן אוטומטי את הרכישה ללא עדשה כדי לקבל את התמונה שלב של התרבות תאים. האלגוריתם שחזור הולוגרפי מבוסס על אלגוריתם אחזור מרובת גל שלב¹⁷ והוא מספק תמונת שלב המשוחזרת RGB בטווח של [-π, + π] עבור כל תא יחיד מעל שדה ראייה גדול של 29.4 מ מ². העיקרון של הולוגרפיה ללא עדשה בשורה הוא להאיר מדגם דק (ב- z = 0) עם גל מישורי (של משרעת 1 לאחר נורמליזציה) וכדי לזהות על חיישן CMOS התמונה בעוצמה עקיפה עוקבות במרחק קצר z = Z, בדרך כלל 1 מ מ לאחר לדוגמה. בהגדרת שלנו, ההארה הוא החליף ברצף ל 3 אורכי גל (λ₁= מיקרומטר 0.450, λ₂= 0.540 מיקרומטר, λ₃= מיקרומטר 0.647) כדי למדוד את שלוש תבניות עקיפה באותה דגימת זרע.

2. התא תרבות ניתוח נתונים

1. לשימוש התא-מעקב, האלגוריתם Trackmate, תוסף פיג'י קוד פתוח למעקב אוטומטי של חלקיקים יחיד¹⁸. At טען תחילה, רכישה מלא זמן לשגות פיג'י (טעינת התמונה רצף הפקודה). בשל גודלו של קבצי הנתונים, הכולל בדרך כלל 400 RGB מסגרות של 29.7 Mb, זה מהר יותר כדי לטעון אותם בתבנית 8 סיביות. הבא התוסף Trackmate פיג'י המדריכים למשתמש דרך מספר שלבים של האלגוריתם תא-מעקב, כלומר שלב זיהוי תא, שלב המעקב תא ו מספר מסננים המוחלים על גילויים של התא, המסילה מחושב. בכל שלב, להגדיר את האלגוריתמים ולהציג את התוצאות באופן מיידי כך, במידת הצורך, אחד יכול בקלות לנווט הלוך ושוב כדי להתאים מחדש את ההגדרות. התפריטים השונים של הממשק Trackmate מוצגים באיור 2 עם ההגדרות בפועל משמש הניסוי תאים הלה.
2. הגדר את פרמטרי קלט של התוכנה רכישה בעקבות (ראה איור 2). הגדר את קוטר בועה משוער 15 פיקסלים, הסף גלאי כדי 0.25, המרחק המקסימלי המקשרים 15 פיקסלים, המרחק מקסימום הפער סגירה 15 פיקסלים, ואת מספר המקומות במסלולים ל 3.5.
   הערה: הגדרות אלה יהיו שונים מן הסתם מהניסוי אחד למשנהו, במיוחד את 'בועה מוערך קוטר' התואם לגודל התא (מוענקת כאן בפיקסלים של 1.67 מיקרומטר). ההערה באותו חל "המקשרים מקסימום מרחק' באיזה חשבון עבור המרחק המקסימלי על ידי תא בתוך שתי מסגרות רצופים (מוענקת כאן בפיקסלים של 1.67 מיקרומטר). הערך האופטימלי שלו תלוי על תנועתיות תא אלא גם על צפיפות התאים.
3. בסופו של תהליך מעקב תא, להפיק את התוצאות בצורה של שלושה קבצי טקסט ('ניתוח' כפתור, ראה איור 2). הקובץ השימושי ביותר, בשם 'כתמים בסטטיסטיקה רצועות', מכיל טבלה לרישום תאים כל שזוהו עם העמדות שלהם בהתאמה (x, y) הרכישה, מספר מסגרת שלהם, את מספר המסלול שלהם. על בסיס נתונים אלה, לבצע פילוח תא ולגלות חלוקות תאים באמצעות אלגוריתמים ייעודי (ראה קובצי קוד משלים). שני הקבצים האחרים נקראים 'קישורים בסטטיסטיקה רצועות' ו 'סטטיסטיקת מעקב', כוללים את כל התוצאות התמודדות עם רצועות, למשל מסלול המשכים, מספר פערים שאותרו, לעקוב אחר מסגרת ראשונית, וכו '.
4. השתמש האלגוריתם פילוח תא (ראה קובץ קוד משלים) באופן אוטומטי לחלץ במספר מדדים המתארים המורפולוגיה תא מהתמונה שלב המשוחזרת. מדדים אלה הם שטח הפנים של התא (S), אורך ציר מרכזי תא (L), אורך ציר קטין תאים (l), יחס הגובה-רוחב התא (L/l). השלב התאוששה ללא עדשה מיקרוסקופ הוא יחסי צפיפות, עובי השכבה הדגימה כפי שפורט קודם לכן¹⁵.
5. בנוסף לתכונות מורפולוגי של התא, לחלץ מדידות כמותיים תא יבש (CDM) מסת מ ה^19,13,המשוחזרת שלב²⁰
   הציוד (1)
   כאשר φ(x,y) הוא שלב המשוחזרת shift¹⁹, λ אורך הגל וα = 1.8 x^-4 10 מ'³/ק ג שבירה מסוים אשר מגולל את הווריאציה של שבירה להתייבש מסה^{1, 19}.
6. להעריך את עובי התא באמצעות הערכת ההבדל בין תא את מקדם שבירה של תרבות התקשורת. היחס בין את התא עובי h(x,y) משמרת שלב נמדד ניתנת על ידי²⁰:
   הציוד (2.1)
   הציוד (2.2)
   עם Δn(x,y) = n_תא (x,y) - n_בינוני (x,y), ההבדל שבירה בין התא לבין התקשורת תרבות. בחלק זה, להניח ערך קבוע של Δn = 0.025, אשר מוערך מהאינדקס השבירה נמדד גרעין התא הלה (n = 1.355¹¹) וזו של מדיה תרבות באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) (n = 1.33). למרות הערך עובי התא הוא רק מעיד ככל שהיא מבוססת על ההנחה, הווריאציות היחסי שלו משמעותיים, אפשר לנצל כדי לזהות תאים החלוקה.
7. השתמש האלגוריתם ייעודי (ראה קובץ קוד משלים) כדי לזהות את המופע של חלוקות תאים ולאחר מכן לחלץ רצועות תא שאינן משוייך לחטיבות תא שאותרו, כדי לזהות את חלוקת התא, תאים עם עובי נמדד שגודלם 8 מיקרומטר לראשונה ניתן לזהות, ולאחר מכן בדוק אם תא חדש תופיע באופן הדוק שהמרחב והזמן. בדרך זו, הגילוי של חלוקות תאים מסתמך על שני קריטריונים חזקים. ניתן להחיל חלופה ושיטות משוכלל יותר לגילוי חלוקת התא עד^22,2321,רכישת זמן לשגות lensfree.

תוצאות

עבור תהליך שחזור הולוגרפי, השדה אור מתואר על ידי שדה סקלרי (איפה הוא הערך מורכבים של A על המטוס על מרחק z מהמיקום דוגמה ולאחר לרוחב ו- גל λ). הפצת האור הוא עוצב בידי בתיאוריה Huygens-פרנל אש...

Discussion

בנייר זה, אנו מראים שאת מיקרוסקופ וידאו ללא עדשה יכול לשמש בתוך אינקובטור כדי ללכוד את קינטיקה של אלפי תאים. על מנת לתאר את המתודולוגיה הכללית הסברנו כיצד ניתן לנתח של רכישת זמן לשגות היום 2.7 של הלה תאים בתרבות עם אלגוריתמים תא-מעקב רגיל. התוצאה היא dataset שמציעות 2.2 x 10 מדידות תא⁶ רצועות מ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytonote lens-free video microscope	Iprasense
Horus acquisition software	Iprasense
6-well glass bottom culture plates	MatTek corporation	Part No: P06G-0-14-F
DMEM + GlutaMAX medium	Gibco
heat-inactivated fetal calf serum	Eurobio
penicillin and streptomycin	Gibco
Fibronectin	Sigma Aldrich
Matlab, image processing toolbox	Mathworks