JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול לפיתוח ביוסנסור אלקטרוכימי DNA הכוללת של אלקטרודות פחמן חלקיקי-לאחרונה, המסך המודפס מיוצב חומצה, זהב polylactic לזהות ויבריו parahaemolyticus מוצג.

Abstract

ויבריו parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) הוא. חיידק נפוץ והקאה אשר תורם חלק ניכר של בעיות בריאות הציבור ברחבי העולם, באופן משמעותי משפיע על הקצב של האדם תמותה ותחלואה קרדיווסקולרית. שיטות קונבנציונליות איתור נ' parahaemolyticus כגון שיטות מבוססות-תרבות, מבחני אימונולוגי מולקולרי המבוסס על שיטות דורשים טיפול מסובך לדוגמה, זמן רב, מייגע, ויקרות. לאחרונה, ביולוגיים הוכיחו להיות שיטה לזיהוי מבטיח ומקיף עם היתרונות של זיהוי מהיר, משתלמת, ו המעשיות. מחקר זה מתמקד בפיתוח שיטה מהירה של גילוי נ' parahaemolyticus סלקטיביות גבוהה ורגישות שימוש בעקרונות ה-DNA הכלאה. עבודה, אפיון polylactic מסונתז מיוצב חומצה חלקיקי זהב (PLA-AuNPs) הושג באמצעות קרני רנטגן (XRD), ספקטרוסקופיה הגלוי אולטרה סגול (UV-Vis), הילוכים מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM), פליטת שדה מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (FESEM), וולטמטריה ציקלית (CV). אנחנו גם ביצעו בדיקה נוספת של יציבות, רגישות הפארמצבטית של ה-PLA-AuNPs. . מצאנו ה-PLA AuNPs נוצר מבנה הקול של חלקיקים מיוצב בתמיסה המימית. גם הבחנו כי שיפרה הרגישות כתוצאה ערך התנגדות (Rct) קטן יותר תשלום העברה, גידול של פעיל שטח (2ס מ 0.41). פיתוח ביוסנסור הדנ א שלנו מבוססת על שינוי של אלקטרודות פחמן המסך המודפס (SPCE) עם ה-PLA-AuNPs ושימוש מתילן כחול (MB) כאינדיקטור חמצון-חיזור. אנחנו לאומדן האירועים הנייח והכלאה הדופק דיפרנציאלי voltammetry (DPV). מצאנו כי משלימים, שאינם משלימים, oligonucleotides לא תואמת במיוחד היו מכובדים על ידי החיישן מפוברק. זה הראה גם זיהוי רגיש בצורה אמינה במחקרים אשיג נגד פתוגנים שונים שמקורם במזון, הזיהוי של נ' parahaemolyticus בתוך הלב טריים.

Introduction

נושא מרכזי של הדיון הציבורי ומדעיים בשנים האחרונות, הרעלת מזון היא מזוהה בעיקר עם שלושה סוכנים: מיקרואורגניזמים1, כימיקלים2וטפילים3. מזון מזוהם עלול לגרום לתוצאות בריאות רציניות בבני אדם, במיוחד אצל קבוצת סיכון גבוה יותר של אלה עם מערכות החיסון חלשה, נשים בהריון, קשישים, תינוקות, ילדים צעירים4. עם יותר ממיליון מקרים של שלשול אקוטי המתרחשים מדי שנה אצל ילדים מתחת לגיל 5 שנים ב אפריקה, אסיה, אמריקה הלטינית, הרעלת מזון היא מחלה הגלובלית הגדולות5,6 , הקימה ארגון הבריאות העולמי מיקרואורגניזמים כמו התורם החשוב ביותר7. ויבריו parahaemolyticus בולטת בין זנים מידבק ביותר המוכר. בדרך כלל שנמצאו לאורך החוף, estuarine, ימית סביבות8, הוא חיידק גראם שליליים, אשר הופכת לפעילה בסביבות מלח גבוהה, והוא גורם להרעלתו אנושי רציני כאשר אוכלים מבושל כראוי, כושלת או raw ימית מוצרים9. בנוסף, קיימים מצבים רפואיים אצל אנשים מסוימים להפוך אותם נוטה פצע הזיהום זיהום, ספטיסמיה או האוזן הנובעים נ' parahaemolyticus10. הגורמים התקפה אלימה של נ' parahaemolyticus hemolysins נחלקים לשני סוגים אשר לתרום בפתוגנזה המחלה: thermostable המוליזין ישירה (TDH) מקודד על ידי הגנים tdh ולאחר הקשורות TDH המוליזין מקודד על ידי גנים trh11. הקריטריונים התקפה אלימה (גנים tdh ו- trh) של parahaemolyticus (פ') נמצאים בעיקר דגימות קליניות, במקום דגימות סביבתיים.

(פ') parahaemolyticus יש את היכולת לשרוד תחת מגוון רחב של תנאים, להגיב במהירות על שינויים סביבתיים12. מנגנון התפשטות שלה מסלים את פוטנציאל הסיכון שלו ככל שלה רעילות במקביל תא המוני13. חמור מכך, שינוי האקלים מספקת חיידקים אלה בתנאים בשפע כדי להאיץ את הצמיחה שלהם האוכלוסייה תא14. בשל תדירותו גבוהה, נ' parahaemolyticus צריך להיות במעקב לאורך שרשרת אספקת המזון, במיוחד בתחום הסחר והייצור של פירות ים מאז מוצרים אלה הם שבו הם נמצאים בכמויות עצומות15,16 ברחבי העולם. כיום החיידקים מזוהות ואת וזמינותו מבודדים באמצעות מגוון של שיטות כולל בדיקות ביוכימיות, העשרה, מדיה סלקטיבי17, מקושרים-אנזים immunomagnetic sorbent (אליסה)18, הדופק-שדה בג'ל (PFGE) 19התלכדות לייטקס בדיקות, בדיקות פולימראז תגובת שרשרת (PCR)20. שיטות אלו דורשות בדרך כלל מוסמכים, מכשירים מתוחכמים וטכניקות מפרך אשר אינם מספקים מידע אודות זיהום באופן מיידי. זה קשות מגביל את הסבירות מיד גילוי זיהום מזיקים ויישומים באתר. כלי איתור מהיר עדיין מהווה אתגר יוצא מן הכלל.

Biosensing מתגלה כאופציה מבטיחה איתור והקאה פתוגנים משום שהיא מציעה לחיסכון בזמן, חסכונית, מעשית, בזמן אמת וניתוח בשיטת21,22,23,24 . עם זאת, אמנם היו תוצאות חיוביות רבות של analyte בזיהוי כל פתרון באמצעות ביולוגיים ודוגמאות מחודדים, יש עדיין חוסר מחקר חלה על דוגמאות אמיתיות או תערובות מימית או תמציות אורגניות25. לאחרונה, ביולוגיים אלקטרוכימי באמצעות זיהוי ישיר ו/או עקיף חומצה deoxyribonucleic (DNA) קיבלו תשומת לב מוגברת בקרב מדענים, עקב שלהם זיהוי ספציפי של המטרה משלימים באמצעות אירוע הכלאה26 , 27 , 28 , 29. גישות ייחודיות אלה יציבים יותר בהשוואה ביולוגיים מבוססי אנזים, ובכך מציע טכנולוגיה מבטיח המזעור, מסחור. המטרה של המחקר דיווח הנה כדי לבנות כלי מהיר יכול לזהות נ' parahaemolyticus עם סלקטיביות גבוהה, רגישות, מעשיות, המבוססת על רצף ה-DNA יחודיות במהלך הכלאה. זיהוי אסטרטגיות כוללות השילוב של חומצה מיוצב חלקיקי זהב (PLA-AuNPs) polylactic30 ואלקטרודות פחמן המסך המודפס (SPCEs) בנוכחות מחוון הכלאה, מתילן כחול (MB). הפוטנציאל של הבונה הזיהוי מפותחת הוא חקר נוסף באמצעות חיידקים דגימות די אן איי פשוט נתעלף lysate ורענן.

Protocol

הערה: כל ריאגנטים כימי וביוכימי כדי לשמש צריך להיות של כיתה אנליטית, ללא טיהור נוסף. להכין את כל הפתרונות באמצעות מים יונים סטרילי. אוטוקלב כל כלי זכוכית לפני העיקור.

התראה: אנא השתמש כל נוהלי בטיחות המתאים בעת ביצוע פעילויות מעבדה, כולל את השימוש הנדסה פקדים (fume הוד, הכפפות), ציוד מגן אישי (בטיחות משקפיים, כפפות, חלוק המעבדה, מכנסיים באורך מלא, סגורות נעלי).

1. ייצור, אפיון של שינוי אלקטרודה באמצעות ה-PLA-AuNPs

  1. הכנה ואפיון של ה-PLA-AuNPs
    1. להוסיף 10 מ של הפתרון סודיום ציטרט (38.8 מ מ) ל- 100 מ של רותחים chloroauric מימית תמיסה חומצית (1 מ מ) ובמהירות תירגע עד טמפרטורת הסביבה. לבחון את השינויים בצבע בפתרון AuNPs מוכן אשר מתחיל כמו צהוב, שינויים שחור ומסתיים לבסוף כמו אדום רובי כהה.
    2. מניחים את כדורי ה-PLA תבנית מפלדת לתהליך ההיתוך ומחממים אותם בטמפרטורה של 190 מעלות במשך 10 דקות אחרי ההליך הקשה: שים אותם תחת לחץ של MPa 2.2 עבור 1 דקות כחלק הכנת גיליון ה-PLA. הגיליון PLA יהיה מוכן לשימוש לאחר קירור במשך כ-3 שעות.
    3. לערבב נמרצות, להמיס 0.68 מ ג של הסדינים PLA ב 5 מ של כלורופורם בטמפרטורת החדר. מערבבים ה-PLA מומס עם 10 מ"ל של הפתרון AuNPs בעבר מוכן ומערבבים homogeneously זה בטמפרטורת החדר. תערובות הומוגנית אז יכול להיות denoted כמו ה-PLA-AuNPs, מאופיין באמצעות UV-Vis, XRD, TEM, ו- FESEM עם EDX.
  2. הכנה ואפיון של פחמן המסך המודפס ששונה אלקטרודה
    הערה: SPCE השתמשו במחקר זה כוללת מערכת 3-אלקטרודה: אלקטרודה מונה אלקטרודה עבודה של פחמן, אלקטרודה הפניה Ag/AgCl.
    1. במהירות פיפטה 25 µL של פתרון הומוגני של ה-PLA-AuNPs על גבי SPCE ולאחר מכן אוויר יבש זה עבור 24 שעות לפני השימוש.
    2. Electrochemically לאפיין את האלקטרודות ששונה, SPCE/ה-PLA-AuNPs, בפרו אשלגני (K3[Fe(CN)6]3 -/4 -) כדי למדוד את שטח פעיל, ספקטרוסקופיה עכבה אלקטרוכימי, הדיר, הפארמצבטית, יציבות30.

2. פיתוח ביוסנסור אלקטרוכימי DNA

  1. בדיקה הכנה
    הערה: הרצף של בדיקה ssDNA ו- DNA משלימים נבחרו בהתבסס על מידע של המרכז הארצי עבור מסד הנתונים ביוטכנולוגיה מידע (NCBI).
    1. לרכוש oligonucleotides סינתטי (20-מר ssDNA בדיקה, DNA משלימים 20-mer, 20-מר לא תואמים DNA ו 21-מר-משלימה דנ א) אבקת lyophilized ממעבדות מסחרי, בהתבסס על רצפי הבאים:
      thiolated ssDNA בדיקה: יונקות - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3′
      DNA משלימים: יונקות - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - 3′
      DNA שאינם תואמים אחד-בסיס: יונקות - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG - 3′
      3-בסיס DNA שאינם תואמים: יונקות - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG - 3′
      DNA שאינם משלימים: יונקות - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA - 3′
    2. להכין מלאי פתרונות של כל oligonucleotides (100 מיקרומטר) באמצעות סטרילי טה פתרון (10 מ מ טריס-HCl, 1 מ"מ EDTA, pH 7.5), מחולק לחלקים אנליטית. לשמור את זה ב-4 ° C ולאחר מכן בצע את דילולים המתאים רק לפני השימוש.
  2. אופטימיזציה של קיבעון של הכלאה
    הערה: SPCE שופרת PLA-AuNPs, מסומן בתור SPCE/ה-PLA-AuNPs, נעשה שימוש במחקר זה, שיטת הליהוק טיפה שימש כדי להפוך את ה-DNA הנייח הכלאה.
    1. ראשית, לשתק 25 µL של thiolated ssDNA בדיקה על ה-PLA/SPCE-AuNPs, ואז האוויר יבש זה עבור 24 שעות בטמפרטורת החדר, לאחר מכן זה להיות סוף סוף מסומן בתור SPCE/ה-PLA-AuNPs/ssDNA. לקבוע אופטימיזציה של התנאי הנייח באמצעות שלושה גורמים: הריכוז של ssDNA (החל 0.2 1.4 µM), זמן (החל מ-30 ועד 210 דקות), טמפרטורה (החל מ- 25 ועד 75 ° C).
    2. פיפטה 25 µL של ה-DNA משלימים על פני השטח של SPCE/ה-PLA-AuNPs/ssDNA כדי לבצע את האירוע הכלאה לאחר מכן זה יכול להיות סוף סוף מסומן בתור SPCE/ה-PLA-AuNPs/dsDNA. לקבוע אופטימיזציה של התנאי הכלאה באמצעות שני גורמים של זמן (החל מ-5 עד 30 דקות) וטמפרטורה (החל מ- 25 ועד 75 ° C).
    3. לטבול את קיבוע של אלקטרודות hybridized ב- 20 מיקרומטר MB עבור 30 דקות להסיר את ה-DNA הלא ספציפית הספוחה ו MB עודף על ידי כביסה עם 0.5 M ABS/20 מ מ NaCl (pH 4.5) ולאחר מכן שטיפה בעזרת יונים מים. מדד השיא הנוכחי של הפחתת MB DPV בטכניקה. לבצע את המדידה DPV באמצעות 0.1 M PBS (pH 7) המכיל אין מחוון.
  3. אפיון החיישן DNA מפוברק
    1. לטבול את SPCE/ה-PLA-AuNPs ב- 20 מיקרומטר MB במשך 30 דקות, לשטוף עם 0.5 M ABS/20 מ מ NaCl (pH 4.5) ולאחר מכן לשטוף עם מים יונים לפני מדידה. בצע הליך דומה עבור כל האינטראקציות לרבות בדיקת DNA, DNA משלימים, DNA שאינם תואמים, דגימות די אן איי שאינם משלימים.
    2. למדוד ההפחתה אלקטרוכימי.
      הערה: מדדנו DPV באמצעות ממשק התוכנה של Autolab מיוצרים באופן מסחרי.
      המדידות DPV MB להפחתת אלקטרוכימי בנטילת פוטנציאלי ועד-V 0.5 0.25 V, בצעד פוטנציאלי של 0.005 V, אפנון משרעת של 0.05 V, ושיעור סריקה של 7.73 mVs-1 ב- PBS 0.1 M (pH 7), המכיל אין מחוון. סלקטיביות, רגישות, הפארמצבטית, יציבות החום של החיישן DNA מפוברק נחקרו בהמשך. התוצאות המדווחות הוצגו מדידות ערך רשע ב משכפל שלוש.

3. אימות של החיישן מפוברק הדנ א באמצעות דוגמאות אמיתיות

  1. הכנה של זני חיידקים
    1. בחר דגימות בקטריאליות בהתבסס על שלהם זיהום משמעותי של מאכלי ים31,32 .
      הערה: נ' parahaemolyticus וגם הפניה זנים 8 אחרים זני חיידקים (קמפילובקטר jejuni ליסטריה, סלמונלה typhimurium, סלמונלה דלקת מעיים, דלקת ריאות קלבסיאלה, Escherichia coli O157:H7, Bacillus קובו, ויבריו alginolyticus) של והקאה נפוצות הפתוגן הועסקו לשם אימות ביוסנסור אלקטרוכימי DNA במחקר זה.
    2. התנהגות שגרתית תת תרבות של זני חיידקים על אגר בהתאמה שלהם כל שבועיים כדי לשמור על יכולת הקיום שלהם, עיין טבלה 1 עבור תנאים תרבות.
    3. לשמור על שימור לטווח ארוך זני חיידקים ב שלהם broths גדל בהתאמה המכיל 20% (v/v) גליצרול ב-80 מעלות צלזיוס כפי גליצרול מגן על חיידקים על ידי מניעת היווצרות של גבישי קרח אשר יכולים לגרום להם נזק במהלך תהליך ההקפאה. בשלב הבא, לחסן לולאה של תא החיידק משומרת תרבות במניות גליצרול לתוך broths בהתאמה. דגירה את broths על פי טמפרטורה וזמן צמיחה בהתאמה שלהם בעת הצורך להחיות את החיידקים.
    4. לקבוע את הכמות נ' parahaemolyticus תאים באמצעות טכניקה של צלחת כפולה33, תקן ושיטה ידועה לספירת מיקרואורגניזמים נגזר סדרת דילולים.
      1. תרבות נ' parahaemolyticus ב Trypticase סויה מרק (TSB + 3% NaCl) ב 37 מעלות צלזיוס במצב חזק 140-סל ד. לאחר מכן, להעביר 1 מ"ל של התרבות תאי חיידקים לתוך 9 מיליליטר TSB + 3% NaCl להשיג גורם לדילול 10-1 .
    5. חזור על שלב זה תשע פעמים כדי לקבל סדרה מלאה של גורם לדילול-10 עד 10. הבא, התפשטה 0.1 מ"ל של כל גורם לדילול (החל מ 10-1 כדי 10-10) על צלחת אגר סלקטיבי של ויבריו המושבה ספירה, בהתאמה. דגירה הלוחות מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
    6. השתמש מונה המושבה כדי לספור מושבות בודדות, ואז חזרה-לחשב (ספירת הסכום CFU/pipetted x פקטור דילול) כדי לקבל יחידת המושבה יוצרי לאדם צפיפות מיליליטר (מ"ל CFU-1). שואבים את הריכוז של המושבה יוצרי יחידות (CFUs) ב השעיות התא חיידקים מן העלילה כיול של mL CFU-1 נגד ספיגת.
  2. הכנת וזמינותו PCR
    1. תמצית הדנ א בעקבות ששונה מבושלים הליך פירוק34. עם הנץ החמה בקטריאלי בודדים זן במדיה אגר, לחסן אותו בתקשורת מרק, ואחריו המקננת זה על מצבו היחסי צמיחה, סל"ד 140 רועד תנאי.
    2. Pipette תרבות 1 מ"ל של מרק לתוך שפופרת צנטרפוגה מיקרו. Centrifuge זה-4830-g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה להשיג כדורי. השתמש בערך 500 µL מאגר טה סטרילי re-השעיה עם בגדר. להחזיק ההשעיה וכתוצאה מכך במשך 10 דקות על 98 ± 2 ° C בתוך גוש חימום, מיד תרגעו ב-18 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות lyse התאים ולשחרר את ה-DNA.
    3. Centrifuge ה-DNA גנומי-4830-g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות לקבל השעיה ברורה ולשמור את תגובת שיקוע ב-20 ° C לשימוש נוסף. השתמש מדידה biophotometer עם הקליטה UV באורך-גל של 260 ננומטר (כמו חומצות גרעין קליטת אורך הגל של אור) וגם ב אורך גל של 280 ננומטר (כמו החלבונים סופגי אורך הגל של אור) כדי לקבוע את הריכוז ואת טוהר חילוץ דנ א גנומי ולאחר מכן לזהות את כל זני באמצעות מבחני הביוכימי רגיל35 ואימות אותם על ידי מטוסי אף-16 rRNA ג'ין רצף36. לבסוף, denature ה-DNA גנומי ב 92 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, לצנן את זה במהירות במי קרח לפני היישום החיישן.
    4. נוסף לאשר הנוכחות נ' parahaemolyticus באמצעות PCR למקד את הגן toxR. ביצוע הליך זה thermocycler באמצעות זוג פריימר (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' ו 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). למטב את הגברה PCR נפח התגובה הכולל של 25 µL המורכב במים סטריליים (15.5 µL), מאגר (5 µL), פריימר (1 µL, 10 מיקרומטר), dNTP מיקס (1 µL), תבנית ה-DNA (2 µL) ו- Taq DNA פולימראז (0.2 µL, 10 x).
    5. מערבבים את רכיבי היטב, לארגן הגברה PCR של הרצף היעד ב- thermocycler מתוכנת מחזורים של הגברה. במחקר שלנו, בכל מחזור כללה שלושה שלבים תגובות כלומר., דנטורציה הראשונית (94 ° C, 3 דקות) ואחריו 30 מחזורי דנטורציה (94 ° C, 1 דקות), חישול (63 ° C, כ- 1.5 דקות) והסיומת (72 ° C, כ- 1.5 דקות), ואחריו הסיומת הסופי (72 ° C, 7 דקות).
    6. לקבוע את המוצרים מוגבר, הגדלים שלהם באמצעות אלקטרופורזה על 1.5% agarose ג'ל. ללכוד את התמונות ג'ל עם מערכת ג'ל המיוצר מסחרית-תיעוד.
  3. הכנת דוגמאות פשוט נתעלף
    1. להשיג דגימות טריות.
      הערה: הלב שלנו טריים (Anadara granosa) היו המתקבל בשוק רטוב Serdang, Selangor, והביא במהירות את המעבדה בתיבת קרח קריר יותר לניתוח. לחלק את הדגימות 2 קבוצות, כלומר קבוצת טיפול ללא טיפול, בהנחה כי הלב נבצרו בצורה אחידה מתחילת הקציר עד הצבתם לתוך אחסון הקרה.
    2. מראש לטפל הלב בקבוצה שטופלו על ידי אחסונם ב-20 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות, ואחריו חשיפה לאור UV ב 20 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות לפני מיצוי הדנ א.
      הערה: את טמפרטורת הקיפאון ואת חשיפה UV המשמש מבוקרת קבוצה או לפחות מגביל את צבירת באופן טבעי נ' parahaemolyticus ב הלב. אל תחיל משטר פסטור גבוה יותר של 70 מעלות צלזיוס כמו מטרת התנאי מבוקרת במחקר זה היא לחקות את המצב בפועל של הלב טריים. בינתיים, לנתח דגימות ישירות מן הקבוצה מטופל ללא כל טיפול קדם ברגע שהם מגיעים במעבדה.
    3. תת-תרבות זן של נ' parahaemolyticus בקרת האוויר 17802 ב TSB (3% NaCl). לקבוע את רמת התאים קיימא ב inoculum באמצעות ציפוי של דילולים המתאים של TSB (3% NaCl) ב- CA על מנת לקבל את inoculum של 104 CFU מ ל-1 של נ' parahaemolyticus. לשטוף כל אחרים במים מזוקקים, לקרצף אותה ללא לכלוך לפני באמצעות מלקחיים סטרילי זרימה שכבתית בארון כדי להסיר הרקמות הקליפה.
    4. Homogenize בערך 10 גרם של דגימות רקמה אחרים עם מהמגן ב- 90 מיליליטר TSB סטרילי (3% NaCl) 60 s. הוסף כמות ידועה של נ' parahaemolyticus 9 מ ל ציר מדגם הומוגני על הדגימות מחודדים. השתמש הדגימות unspiked כפקד שלילי. מעריכים את ספירת תאים של נ' parahaemolyticus עלה על הדגימות אחרים על ידי ציפוי 0.1 מ"ל של הדגימות על CA, לאחר מכן, pipetting 1 מ"ל של דגימות לתוך צינור microcentrifuge עבור ה-DNA לטעום החילוץ, כדי לשמש את ביוסנסור ואת וזמינותו PCR.
    5. תמצית ה-DNA גנומי של נ' parahaemolyticus בין דגימות מחודדים, unspiked בעקבות ששונה מבושלים הליך פירוק36. לבסוף, לקבוע את ריכוז הדנ א ואת טוהר באמצעות מדידה photometer ביו עם הקליטה UV באורך-גל של 260 ננומטר (כמו חומצות גרעין קליטת אורך הגל של אור) וגם ב אורך גל של 280 ננומטר (כמו החלבונים סופגי אורך הגל של אור).

תוצאות

היווצרות AuNPs התגלה באמצעות בשינוי הצבע של התמיסה המימית עם סודיום ציטרט הנוכחי. זה גרם את הצבע לשנות מן צהוב בהיר אדום רובי עמוק. הדור של ה-PLA-AuNPs אושרה של ספקטרום UV-vis (איור 1) שבו הצמיחה של הפסגה תהודה (SPR) משטח פלזמון נמצאה כ 540 nm. היווצרות ואת קיומו של ה-PLA-AuNPs ה...

Discussion

השלבים הקריטיים במסגרת להתפתחותן של סוג זה של ביוסנסור אלקטרוכימי הם מבחר אלמנטים המתאימים זיהוי ביולוגי המתמר (חומצת גרעין או DNA כאן); הגישה כימיים עבור בניית השכבה חישה של המתמר; התמרה חושית חומר; אופטימיזציה של ה-DNA הנייח, הכלאה; ואימות החיישן מפותחת באמצעות דוגמאות אמיתיות.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים רוצה להכיר את התמיכה של מלזיה Universiti Putra.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidMerck100056
ChloroformMerck102445
Diaminoethane tetraacetic acidPromegaE5134
Dibasic sodium phosphate Sigma-AldrichS9763
Disodium hydrogen phosphateSigma-Aldrich255793
Ethanol Sigma-Aldrich16368
Gold (III) chloride trihydrateSigma-Aldrich520918
Hydrochloric acidMerck100317
Methylene blueSigma-AldrichM44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrateSigma-AldrichS3522
Phosphate-buffered salineSigma-AldrichP5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042DNatureWorks4042D
Potassium chlorideR&M Chemicals59435
Potassium dihydrogen phosphateSigma-AldrichP9791
Potassium hexacyanoferrate IIIR&M Chemicals208019
Sodium acetate anhydrous saltSigma-AldrichS2889
Sodium chlorideSigma-AldrichS9888
Trisodium citrateSigma-AldrichS1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethaneFisher ScientificT395-100
Tris-BaseFisher ScientificBP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-DyeNorgen Biotek28240
Agarose gelMerck101236
Bolton AgarMerck100079
Bolton BrothMerck100079
CHROMagar VibrioCHROMagarVB910
dNTPsPromegaU1511
Nuclease-free waterThermo ScientificR0581
Eosin methylene blue agar Merck101347
GelRedBiotium41001
GlycerolMerck104092
Go Taq BufferPromegaM7911
Loading dye 100 bp DNA ladderPromegaG2101
Loading dye 1kb DNA ladderPromegaG5711
Magnesium chloridePromega91176
Mannitol egg yolk polymyxin agarMerck105267
McConkey AgarMerck105465
Nutrient BrothMerck105443
Taq polymeraseMerck71003
Trypticase Soy BrothMerck105459
Trypticase Soy AgarMerck105458

References

  1. Gould, L. H., Rosenblum, I., Nicholas, D., Phan, Q., Jones, T. F. Contributing factors in restaurant-associated foodborne disease outbreaks, FoodNet sites, 2006 and 2007. Journal of Food Protection. 76, 1824-1828 (2013).
  2. Arvanitoyannis, I. S., Kotsanopoulos, K. V., Papadopoulou, A. Rapid detection of chemical hazards (toxins, dioxins, and PCBs) in seafood. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 54, 1473-1528 (2014).
  3. Robertson, L. J., Sprong, H., Ortega, Y. R., van der Giessen, J. W. B., Fayer, R. Impacts of globalisation on foodborne parasites. Trends in Parasitology. 30, 37-52 (2014).
  4. Sandilands, E. A., Bateman, D. N. The epidemiology of poisoning. Medicine. 44, 76-79 (2016).
  5. Boschi-Pinto, C., Velebit, L., Shibuya, K. Estimating child mortality due to diarrhoea in developing countries. Bulletin of the World Health Organization. 86, 710-717 (2008).
  6. Farthing, M. J. G. Diarrhoea: A Significant Worldwide Problem. International Journal of Antimicrobial Agents. 14, 65-69 (2000).
  7. World Health Organization. . WHO estimates of the global burden of foodborne diseases: foodborne disease burden epidemiology reference group 2007-2015. , 1-255 (2015).
  8. Yeung, M., Boor, K. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathogens and Disease. 1, 74-88 (2004).
  9. Sakazaki, R., Cliver, D. O., Riemann, H. P. . Foodborne Diseases. , 127-136 (2002).
  10. Grochowsky, J., Odom, S. R., Akuthota, P., Stead, W. Primary Septicemia and Abdominal Compartment Syndrome From Vibrio parahaemolyticus Infection in a 40-Year-Old Patient With No Known Immunocompromise. Infectious Disease in Clinical Practice. 22, (2013).
  11. Raghunath, P. Roles of thermostable direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin (TRH) in Vibrio parahaemolyticus. Frontiers in Microbiology. 5, 805 (2014).
  12. Kalburge, S. S., Whitaker, W. B., Boyd, E. F. High-Salt Preadaptation of Vibrio parahaemolyticus Enhances Survival in Response to Lethal Environmental Stresses. Journal of Food Protection. 77, 246-253 (2014).
  13. Esteves, K., Hervio-Heath, D., Mosser, T., Rodier, C., Tournoud, M. G., Jumas-Bilak, E., Colwell, R. R., Monfort, P. Rapid proliferation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, and Vibrio cholerae during freshwater flash floods in French Mediterranean Coastal lagoons. Applied and Environmental Microbiology. 81, 7600-7609 (2015).
  14. Khandeparker, L., Anil, A. C., Naik, S. D., Gaonkar, C. C. Daily variations in pathogenic bacterial populations in a monsoon influenced tropical environment. Marine Pollution Bulletin. 96, 337-343 (2015).
  15. Caburlotto, G., Suffredini, E., Toson, M., Fasolato, L., Antonetti, P., Zambon, M., Manfrin, A. Occurrence and molecular characterization of Vibrio parahaemolyticus in crustaceans commercialised in Venice area, Italy. International Journal of Food Microbiology. 220, 39-49 (2016).
  16. Wong, H. C., Chen, M. C., Liu, S. H., Liu, D. P. Incidence of highly genetically diversified Vibrio parahaemolyticus in seafood imported from Asian countries. International Journal of Food Microbiology. 52, 181-188 (1999).
  17. Rosec, J. P., Causse, V., Cruz, B., Rauzier, J., Carnat, L. The international standard ISO/TS 21872-1 to study the occurence of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae in seafood: ITS improvement by use of a chromogenic medium and PCR. International Journal of Food Microbiology. 157, 189-194 (2012).
  18. Maniyankode, R. A., Kingston, J. J., Murali, H. S., Batra, H. V. Specific identification of vibrio parahaemolyticus employing monoclonal antibody based immunoassay. International Journal of Pharmacy and Biological Sciences. 4 (2), B156-B164 (2013).
  19. Suffredini, E., Lopez-Joven, C., Maddalena, L., Croci, L., Roque, A. Pulsed-field gel electrophoresis and PCR characterization of environmental Vibrio parahaemolyticus strains of different origins. Applied and Environmental Microbiology. 77, 6301-6304 (2011).
  20. Bhattacharyya, N., Hou, A. A pentaplex PCR assay for detection and characterization of Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus isolates. Letters in Applied Microbiology. 57, 233-240 (2013).
  21. da Silva, E. T. S. G., et al. Electrochemical Biosensors in Point-of-Care Devices: Recent Advances and Future Trends. ChemElectroChem. 4 (4), 778-794 (2017).
  22. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. Sensitive detection of multiple pathogens using a single DNA probe. Biosensors and Bioelectronics. 86, 398-405 (2016).
  23. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. A simple, portable, electrochemical biosensor to screen shellfish for Vibrio parahaemolyticus. AMB Express. 7 (1), 41 (2017).
  24. Zhang, J., Li, Z., Zhang, H., Wang, J., Liu, Y., Chen, G. Rapid detection of several foodborne pathogens by F0F1-ATPase molecular motor biosensor. Journal of Microbiological Methods. 93, 37-41 (2013).
  25. Barsan, M. M., Ghica, E. M., Brett, C. M. A., Nikolelis, D. P., Varzakas , T., Erdem, A., Nikoleli, G. P. . Portable biosensing of food toxicants and environmental pollutants. , 33-69 (2014).
  26. Kwun, J., Yun, S., Park, L., Lee, J. H. Development of 1,1'-oxalyldiimidazole chemiluminescent biosensor using the combination of graphene oxide and hairpin aptamer and its application. Talanta. 119, 262-267 (2014).
  27. Thavanathan, J., Huang, N. M., Thong, K. L. Colorimetric biosensing of targeted gene sequence using dual nanoparticle platforms. International Journal of Nanomedicine. 10, 2711-2722 (2015).
  28. Hushiarian, R., Yusof, N. A., Abdullah, A. H., Ahmad, S. A. A., Dutse, S. W. Facilitating the indirect detection of genomic DNA in an electrochemical DNA biosensor using magnetic nanoparticles and DNA ligase. Analytical Chemistry Research. 6, 17-25 (2015).
  29. Dutse, S. W., Yusof, N. A., Ahmad, H., Hussein, M. Z., Zainal, Z., Hushiarian, R., Hajian, R. An Electrochemical Biosensor for the Determination of Ganoderma boninense Pathogen Based on a Novel Modified Gold Nanocomposite Film Electrode. Analytical Letters. 47 (5), 819-832 (2014).
  30. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hajian, R. Characterization of Polylactide-Stabilized Gold Nanoparticles and Its Application in the Fabrication of Electrochemical DNA Biosensors. Journal of the Brazilian Chemical Society. 27 (9), 1679-1686 (2016).
  31. Vongkamjan, K., Wang, S., Moreno Switt, A. I. Rapid detection of foodborne bacterial pathogens in seafood. Handbook of Seafood: Quality and Safety Maintenance and Applications. , 247-257 (2016).
  32. Wang, F., Jiang, L., Yang, Q., Han, F., Chen, S., Pu, S., Vance, A., Ge, B. Prevalence and antimicrobial susceptibility of major foodborne pathogens in imported seafood. Journal of Food Protection. 74 (9), 1451-1461 (2011).
  33. Szermer-Olearnik, B., Sochocka, M., Zwolinska, K., Ciekot, J., Czarny, A., Szydzik, J., Kowalski, K., Boratynski, J. Comparison of microbiological and physicochemical methods for enumeration of microorganisms. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 68, 1392-1396 (2014).
  34. Ivanov, I. G., Bachvarov, D. R. Determination of plasmid copy number by the "boiling" method. Analytical Biochemistry. 165 (1), 137-141 (1987).
  35. Gopireddy, V. R. Biochemical tests for the identification of bacteria. International Journal of Pharmacy and Technology. 3 (4), 1536-1555 (2011).
  36. Böhme, K., Fernández-No, I. C., Pazos, M., Gallardo, J. M., Barros-Velázquez, J., Cañas, B., Calo-Mata, P. Identification and classification of seafood-borne pathogenic and spoilage bacteria: 16S rRNA sequencing versus MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 34 (6), 877-887 (2013).
  37. Seoudi, R., Fouda, A. A., Elmenshawy, D. A. Synthesis, characterization and vibrational spectroscopic studies of different particle size of gold nanoparticle capped with polyvinylpyrrolidone. Physica B: Condensed Matter. 405, 906-911 (2010).
  38. Mishra, A., Harper, S., Yun, S. I. Interaction of biosynthesized gold nanoparticles with genomic DNA isolated from E. coli and S. aureus. Nanotechnology (IEEE-NANO). , 1745-1750 (2011).
  39. Sugimoto, T. Formation of modoispersed nano- and micro-particles controlled in size, shape, and internal structure. Chemical Engineering and Technology. 26, 313-321 (2003).
  40. Rath, C., Sahu, K. K., Kulkarni, S. D., Anand, S., Date, S. K., Das, R. P., Mishra, N. C. Microstructure-dependent coercivity in monodispersed hematite particles. Applied Physics Letters. 75, 4171-4173 (1999).
  41. Abbas, M., Wu, Z. Y., Zhong, J., Ibrahim, K., Fiori, A., Orlanducci, S., Sessa, V., Terranova, M. L., Davoli, I. X-ray absorption and photoelectron spectroscopy studies on graphite and single-walled carbon nanotubes: Oxygen effect. Applied Physics Letters. 87 (5), 051923 (2005).
  42. Lim, S. C., Choi, Y. C., Jeong, H. J., Shin, Y. M., An, K. H., Bae, D. J., Lee, Y. H., Lee, N. S., Kim, J. M. Effect of gas exposure on field emission properties of carbon nanotubes arrays. Advanced Materials. 13, 1563-1567 (2001).
  43. Kim, B. H., Kim, B. R., Seo, Y. G. A study on adsorption equilibrium for oxygen and nitrogen into carbon nanotubes. Adsorption. 11, 207-212 (2005).
  44. Bard, A. J., Faulkner, L. R. . Electrochemical methods: Fundamentals and applications. , (2000).
  45. Tan, Q., Wang, L., Ma, L., Yu, H., Ding, J., Liu, Q., Xiao, A., Ren, G. Study on anion electrochemical recognition based on a novel ferrocenyl compound with multiple binding sites. Journal of Physical Chemistry B. 112, 11171-11176 (2008).
  46. Manivannan, S., Ramaraj, R. Polymer-embedded gold and gold/silver nanoparticle-modified electrodes and their applications in catalysis and sensors. Pure and Applied Chemistry. 83, 2041-2053 (2011).
  47. Benali, O., Larabi, L., Traisnel, M., Gengembre, L., Hareka, Y. Electrochemical, theoretical and XPS studies of 2-mercapto-1-methylimidazole adsorption on carbon steel in 1 M HClO4. Applied Surface Science. 253, 6130-6139 (2007).
  48. Shi, Y., Wen, L., Li, F., Cheng, H. M. Nanosized Li4Ti5O12/graphene hybrid materials with low polarization for high rate lithium ion batteries. Journal of Power Sources. 196, 8610-8617 (2011).
  49. Bentiss, F., Traisnel, M., Lagrenee, M. The substituted 1,3,4-oxadiazoles: a new class of corrosion inhibitors of mild steel in acidic media. Corrosion Science. 42, 127-146 (2000).
  50. Wang, M., Gong, W., Meng, Q., Zhang, Y. Electrochemical DNA impedance biosensor for the detection of DNA hybridization with polymeric film, single walled carbon nanotubes modified glassy carbon electrode. Russian Journal of Electrochemistry. 47, 1368-1373 (2011).
  51. Herdt, A. R., Drawz, S. M., Kang, Y., Taton, T. A. DNA dissociation and degradation at gold nanoparticle surfaces. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 51 (2), 130-139 (2006).
  52. Bhatt, N., Huang, P. J. J., Dave, N., Liu, J. Dissociation and degradation of thiol-modified DNA on gold nanoparticles in aqueous and organic solvents. Langmuir. 27, 6132-6137 (2011).
  53. Liu, X., Jang, C. H., Zheng, F., Jürgensen, A., Denlinger, J. D., Dickson, K. A., Raines, R. T., Abbott, N. L., Himpsel, F. J. Characterization of protein immobilisation at silver surfaces by near edge X-ray absorption fine structure spectroscopy. Langmuir. 22, 7719-7725 (2006).
  54. Willey, T. M., Andrew, L., Vance, T., Buuren, V., Bostedt, C., Terminello, L. J., Fadley, C. S. Rapid degradation of alkanethiol-based self-assembled monolayers on gold in ambient laboratory conditions. Surface Science. 576 (1), 188-196 (2005).
  55. Farjami, E., Clima, L., Gothelf, K., Ferapontova, E. E. DNA interactions with a Methylene Blue redox indicator depend on the DNA length and are sequence specific. Analyst. 135, 1443-1448 (2010).
  56. Lin, X., Ni, Y., Kokot, S. An electrochemical DNA-sensor developed with the use of methylene blue as a redox indicator for the detection of DNA damage induced by endocrine-disrupting compounds. Analytica Chimica Acta. 867, 29-37 (2015).
  57. Zhang, F. T., Nie, J., Zhang, D. W., Chen, J. T., Zhou, Y. L., Zhang, X. X. Methylene Blue as a G-Quadruplex Binding Probe for Label-Free Homogeneous Electrochemical Biosensing. Analytical Chemistry. 86, 9489-9495 (2014).
  58. Ning, L., Li, X., Yang, D., Miao, P., Ye, Z., Li, G. Measurement of Intracellular pH Changes Based on DNA-Templated Capsid Protein Nanotubes. Analytical Chemistry. 86, 8042-8047 (2014).
  59. Sani, N. D. M., Heng, L. Y., Surif, S., Lazim, A. M., Murad, A. . AIP Conference Proceedings. 1571, 636-640 (2013).
  60. Xu, P., Wang, J., Xu, Y., Chu, H., Shen, H., Zhang, D., Zhao, M., Liu, J., Li, G. Binding modes and interaction mechanism between different base pairs and methylene blue trihydrate: a quantum mechanics study. Advances in Experimental Medicine and Biology. 827, 187-203 (2015).
  61. Guo, Y., Chen, J., Chen, G. A label-free electrochemical biosensor for detection of HIV related gene based on interaction between DNA and protein. Sensors & Actuators, B: Chemical. 184, 113-117 (2013).
  62. Huang, K. J., Liu, Y. J., Wang, H. B., Wang, Y. Y., Liu, Y. M. Sub-femtomolar DNA detection based on layered molybdenum disulfide/multi-walled carbon nanotube composites, au nanoparticle and enzyme multiple signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 55, 195-202 (2014).
  63. Kong, R. M., Song, Z. L., Meng, H. M., Zhang, X. B., Shen, G. L., Yu, R. Q. A label-free electrochemical biosensor for highly sensitive and selective detection of DNA via a dual-amplified strategy. Biosensors and Bioelectronics. 54, 442-447 (2014).
  64. Rashid, J. I. A., Yusof, N. A., Abdullah, J., Hashim, U., Hajian, R. Novel Disposable Biosensor Based on SiNWs/AuNPs Modified-Screen Printed Electrode for Dengue Virus DNA Oligomer Detection. IEEE Sensors Journal. 15, 4420-4421 (2015).
  65. Yingkajorn, M., Sermwitayawong, N., Palittapongarnpimp, P., Nishibuchi, M., Robins, W. P., Mekalanos, J. J., Vuddhakul, V. Vibrio parahaemolyticus and its specific bacteriophages as an indicator in cockles (Anadara granosa) for the risk of V. parahaemolyticus infection in Southern Thailand. Microbial Ecology. 67, 849-856 (2014).
  66. Ahmad Ganaie, H., Ali, M. N. Short term protocol for the isolation and purification of DNA for molecular analysis. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. 24, 266-270 (2014).
  67. Nakano, K., Kimura, T., Kitamura, Y., Ihara, T., Ishimatsu, R., Imato, T. Potentiometric DNA sensing platform using redox-active DNA probe pair for sandwich-type dual hybridization at indicator electrode surface. Journal of Electroanalytical Chemistry. 720-721, 71-75 (2014).
  68. Yang, J., Jim Yang, L., Heng-Phon, T., Gan-Moog, C. Inhibition of DNA hybridization by small metal nanoparticles. Biophysical Chemistry. 120, 87-95 (2006).
  69. Niu, L. M., Liu, F., Wang, W., Lian, K. Q., Ma, L., Shi, H. M., Kang, W. J. Electrochemical Behavior of Paraquat on a Highly Ordered Biosensor Based on an Unmodified DNA-3D Gold Nanoparticle Composite and Its Application. Electrochimica Acta. 153, 190-199 (2015).
  70. Li, Z., Miao, X., Xing, K., Zhu, A., Ling, L. Enhanced electrochemical recognition of double-stranded DNA by using hybridization chain reaction and positively charged gold nanoparticles. Biosensors and Bioelectronics. 74, 687-690 (2015).
  71. Niu, S., Sun, J., Nan, C., Lin, J. Sensitive DNA biosensor improved by 1,10-phenanthroline cobalt complex as indicator based on the electrode modified by gold nanoparticles and graphene. Sensors and Actuators B: Chemical. 176, 58-63 (2013).
  72. Yi, H., Xu, W., Yuan, Y., Bai, L., Wu, Y., Chai, Y., Yuan, R. A pseudo triple-enzyme cascade amplified aptasensor for thrombin detection based on hemin/G-quadruplex as signal label. Biosensors and Bioelectronics. 54, 415-420 (2014).
  73. Das, R., Sharma, M. K., Rao, V. K., Bhattacharya, B. K., Garg, I., Venkatesh, V., Upadhyay, S. An electrochemical genosensor for Salmonella typhi on gold nanoparticles-mercaptosilane modified screen printed electrode. Journal of Biotechnology. 188, 9-16 (2014).
  74. Han, X., Fang, X., Shi, A., Wang, J., Zhang, Y. An electrochemical DNA biosensor based on gold nanorods decorated graphene oxide sheets for sensing platform. Analytical Biochemistry. 443 (2), 117-123 (2013).
  75. Huang, K. J., Liu, Y. J., Zhang, J. Z., Cao, J. T., Liu, Y. M. Aptamer/Au nanoparticles/cobalt sulfide nanosheets biosensor for 17β-estradiol detection using a guanine-rich complementary DNA sequence for signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 67, 184-191 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

136PolylacticDNAparahaemolyticus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved