JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Vibrio parahaemolyticus algılamak için polylactic asit-sağlamlık, altın nano tanecikleri değiştirilme tarihi, Serigrafi karbon elektrot oluşan bir elektrokimyasal DNA biyoalgılayıcı geliştirilmesi için bir protokol sunulmuştur.

Özet

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) insan mortalite ve morbidite oranı önemli ölçüde etkileyen küresel olarak, halk sağlığı sorunları büyük bir oranda katkıda ortak bir gıda kaynaklı patojen var. Parahaemolyticus tespiti kültür tabanlı yöntemleri, immünolojik deneyleri ve moleküler tabanlı yöntemleri gibi geleneksel yöntemlerle karmaşık örnek işlem gerektirir ve zaman alıcı, sıkıcı ve pahalı. Son zamanlarda, biyosensörler umut verici ve kapsamlı algılama yöntemi ile hızlı algılama, maliyet-etkililik ve pratiklik avantajları olduğu kanıtlanmıştır. Bu araştırma parahaemolyticus V. yüksek seçicilik ve DNA hibridizasyon kullanılmasının duyarlılık ile algılama hızlı bir yöntem geliştirmeye odaklanmaktadır. Çalışma, sentezlenmiş polylactic asit-sağlamlık altın nano tanecikleri (PLA-AuNPs) karakterizasyonu kullanarak x-ışını kırınım (XRD), ultraviyole görünür spektroskopisi (UV-VIS), transmisyon elektron mikroskobu (TEM), alan emisyon elde edildi Elektron mikroskobu (FESEM) ve çevrimsel Voltammetry (CV) tarama. Biz de daha fazla istikrar, hassasiyet ve tekrarlanabilirlik PLA-AuNPs in test dışarı taşıdı. PLA AuNPs sulu çözüm ses yapısını stabilize nano tanecikleri kurdu bulduk. Biz de duyarlılık daha küçük bir ücret transferi direnç (Rct) değer ve aktif yüzey alanı (0,41 cm2) artış sonucunda geliştirilmiş gözlenen. Bizim DNA biyoalgılayıcı gelişimi PLA-AuNPs ve redoks göstergesi olarak metilen mavisi (MB) kullanarak bir Serigrafi karbon elektrot (SPCE) değişiklik dayanıyordu. İmmobilizasyon ve hibridizasyon olayları fark nabız voltammetry (DPV) tarafından değerlendirildi. Tamamlayıcı, tamamlayıcı bulduk ve uyumsuz oligonucleotides özellikle tarafından uydurma biyoalgılayıcı ayırt edildi. Ayrıca çeşitli gıda kaynaklı patojenlere karşı olan çalışmalar ve parahaemolyticus V. kimlik taze istiridye içinde güvenilir bir şekilde duyarlı algılama gösterdi.

Giriş

Son yıllarda genel ve bilimsel tartışmaların önemli bir konu, gıda zehirlenmesi 3 aracıları ile ilişkili: mikroorganizmaların1, kimyasal madde2ve parazitler3. Kontamine gıda ciddi sağlık sonuçları insanlar, özellikle zayıf bağışıklık sistemi, yaşlı, hamile kadınlar, bebekler ve küçük çocuklar4olanların daha yüksek risk grubundaki neden olabilir. İle daha--dan bir milyon yılda Afrika, Asya ve Latin Amerika 5 yaşın altındaki çocuklarda meydana gelen akut ishal durumlarında, gıda zehirlenmesi büyük küresel hastalık5,6 ve Dünya Sağlık Örgütü kurdu mikroorganizmaların en önemli katkıda bulunan7olarak. Vibrio parahaemolyticus en çok tanınan öldürücü suşları arasında öne çıkmaktadır. Genellikle, nehir ağzı, kıyı ve deniz ortamlarının8' bulundu, hangi yüksek tuz ortamlarda aktif hale gelir ve yetersiz mishandled pişmiş veya çiğ deniz yenen ciddi bir insan gastroenterit tipine neden bir Ayagin Gram-negatif bakteri olduğunu ürünleri9. Ayrıca, mevcut tıbbi durumlar bazı kişilerde yara enfeksiyonu, septisemi veya kulak enfeksiyonu V. parahaemolyticus10' dan doğan eğilimli onları. Parahaemolyticus V. hemolysins virülans faktörleri hastalık patogenezinde katkıda iki türlere ayrılmıştır: tdh genler tarafından kodlanmış opsonins doğrudan hemolysin (TDH) ve trh genler11tarafından kodlanmış TDH ile ilgili hemolysin. V. parahaemolyticus virülans işaretleri (tdh ile trh gen) çoğunlukla Klinik numune yerine çevre örnekler bulunur.

Parahaemolyticus koşullar, geniş bir dizi altında hayatta yeteneği hızla yanıt çevresel değişiklikler12' ye sahip olur. Onun toksisite hücre kitle13ile paralel olarak arttıkça onun yayılmasını önleme mekanizması tehlike potansiyeli dozu artarken. Daha da kötüsü, iklim değişikliği onların hücre nüfus büyüme14hızlandırmak için yeterli koşulları ile bu bakterilerin sağlamaktadır. Yüksek frekansı nedeniyle, bilhassa ticaret ve bu ürünler büyük miktarlarda15,16 ' nerede bulunurlar olduğundan deniz ürünleri imalatı gıda tedarik zinciri boyunca izlenmesi V. parahaemolyticus ihtiyacı Dünya çapında. Şu anda bakteri tespit ve izole bir dizi biyokimyasal testleri, zenginleştirme ve seçmeli medya17, immunomagnetic jelleştirici enzim bağlı gibi yöntemleri kullanarak assay (ELISA)18, darbe alan jel elektroforez (PFGE) 19, lateks aglutinasyon test ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) testleri20. Bu yöntemler genellikle kalifiye personel, sofistike aletleri ve kirlenme hakkında bilgileri hemen vermeyin zahmetli teknikler gerektirir. Bu ciddi bir şekilde derhal zararlı kirlenmesine ve bünyesinde uygulamalar algılama olasılığını kısıtlar. Hızlı algılama araçları olağanüstü bir meydan kalır.

Bir zaman tasarrufu, düşük maliyetli, pratik ve gerçek zamanlı analiz yöntemi21,22,23,24 sunduğundan Biosensing gıda kaynaklı patojenler tespiti için umut verici bir seçenek olarak ortaya çıkıyor . Ancak, birçok olumlu sonuçlar analit algılama çivili örnekleri ve standart çözüm biyosensörler kullanarak rağmen hala var. sulu karışımları veya organik özler25gerçek örnekler için uygulanan araştırma eksikliği Son zamanlarda, elektrokimyasal biyosensörler doğrudan ve/veya dolaylı Deoksiribonükleik asit (DNA) algılama kullanarak tamamlayıcı hedef hibridizasyon olay26 üzerinden onların özel algılama nedeniyle bilim adamları arasında artan ilgi almış , 27 , 28 , 29. bu benzersiz yaklaşımları ile karşılaştırıldığında böylece küçültme ve ticari kullanım için gelecek vaat eden bir teknoloji sunan biyosensörler, enzim tabanlı daha stabildir. İşte parahaemolyticus V. yüksek seçicilik, duyarlılık ve pratiklik, hibridizasyon sırasında DNA dizisi özgüllük dayalı algılayabilir hızlı bir araç oluşturmak için hedef çalışma bildirdi. Kimlik stratejileri polylactic asit-sağlamlık altın nano tanecikleri (PLA-AuNPs)30 ve serigrafi karbon elektrotlar (SPCEs) ile birlikte hibridizasyon göstergesi varlığında, metilen mavisi (MB) içerir. Gelişmiş algılama yapı potansiyelini daha fazla bakteri DNA lysate ve taze cockle örnekleri kullanarak keşfedilmeden.

Protokol

Not: kullanılan tüm kimyasal ve biyokimyasal reaktifleri analitik nitelikte olmalıdır ve daha fazla arıtma kullanılır. Tüm çözümler steril deiyonize su kullanarak hazırlayın. Otoklav sterilizasyon öncesinde tüm cam.

Dikkat: Lütfen denetimleri (duman hood, torpidoda) mühendislik kullanımı da dahil olmak üzere laboratuvar faaliyetleri gerçekleştirirken tüm uygun güvenlik yöntemleri kullanın ve kişisel koruyucu donanımları (koruyucu gözlük, eldiven, önlük, tam uzunlukta pantolon, Kapalı-ayak parmağı Ayakkabı).

1. imalat ve karakterizasyonu, değişikliğin PLA-AuNPs kullanarak elektrot

  1. Hazırlanması ve karakterizasyonu PLA-AuNPs
    1. Hızlı bir şekilde 10 mL sodyum nitrat çözeltisi (38.8 mM) kaynar sulu chloroauric asit solüsyonu (1 mM) 100 mL için eklemek ve aşağı ortam sıcaklığına kadar sakin ol. Renk olan sarı, siyahımsı değişiklikler olarak başlar ve sonunda biter koyu yakut kırmızı hazırlanan AuNPs çözümünde değişiklikleri gözlemlemek.
    2. PLA granül eritme işleminin bir paslanmaz çelik kalıp yerleştirin ve onları acil yordamını izleyin 10 dakika süreyle 190 ° C sıcaklıkta onceden: PLA sayfası hazırlık kapsamında 1 dk. için 2,2 MPa basınç altında koymak onları. PLA sayfası 3 h için soğutma sonra kullanıma hazır olacak.
    3. Şiddetle karıştırma, kloroform, oda sıcaklığında 5 ml PLA sayfaların 0,68 mg geçiyoruz. Çözünmüş PLA 10 mL önceden hazırlanmış AuNPs çözeltisi ile karıştırın ve homojen oda sıcaklığında karıştırın. Homojen karışımlar ve UV-Vis, XRD, TEM ve FESEM ile EDX ile karakterize sonra PLA-AuNPs gösterilir olabilir.
  2. Hazırlık ve değiştirilmiş Serigrafi karbon elektrot karakterizasyonu
    Not: Bu çalışmada kullanılan SPCE üç elektrot sistemi oluşur: bir sayaç elektrot, karbon çalışma elektrot ve bir Ag/AgCl referans elektrot.
    1. Hızlı bir şekilde pipet 25 µL PLA-AuNPs SPCE ve daha sonra hava üzerine homojen çözüm kuru 24 kullanılmadan önce s.
    2. Mamüllerinin değiştirilmiş elektrotlar karakterize içinde potasyum ferro siyanür, SPCE/PLA-AuNPs (K3[Fe(CN)6]3 -/4 -) aktif yüzey alanı, elektrokimyasal empedans spektroskopisi, tekrarlanabilirlik, ölçmek için tekrarlanabilirlik ve istikrar30.

2. elektrokimyasal DNA biyoalgılayıcı gelişimi

  1. Sonda hazırlık
    Not: SsDNA sonda ve tamamlayıcı DNA dizileri dayalı bilgi biyoteknoloji bilgi (NCBI) veritabanı için Milli Merkezi olarak seçilmiştir.
    1. Sentetik oligonucleotides (20-mer ssDNA sonda, 20-mer tamamlayıcı DNA, 20-mer eşleşmeyen DNA ve 21-mer tamamlayıcı DNA) liyofilize toz ticari laboratuvarları, aşağıdaki dizileri dayalı olarak satın alın:
      thiolated ssDNA sonda: 5 ' - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3 '
      tamamlayıcı DNA: 5 ' - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - 3 '
      bir Bankası eşleşmeyen DNA: 5 ' - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG - 3 '
      Üç-base eşleşmeyen DNA: 5 ' - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG - 3 '
      tamamlayıcı DNA: 5 ' - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA - 3 '
    2. Tüm oligonucleotides (100 µM) hisse senedi çözümler analitik bölümlerini içine bölünmüş bir steril TE çözüm (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) kullanarak hazırlayın. Bu-4 ° C'de tutmak ve uygun dilutions kullanmak için sadece önceden yapın.
  2. İmmobilizasyon ve hibridizasyon duruma getirilmesi
    Not: Bu çalışma için kullanılan PLA-AuNPs SPCE/PLA-AuNPs gösterilir, modifiye bir SPCE ve bir damla döküm yöntemi DNA immobilizasyon ve hibridizasyon için kullanıldı.
    1. İlk olarak, thiolated ssDNA sonda SPCE/PLA-AuNPs üzerinde 25 µL hareketsiz ve sonra hava kuru bu oda sıcaklığında 24 h için sonra bu sonunda SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA gösterilir. Üç faktör kullanarak optimizasyon immobilizasyon durumun belirleyin: ssDNA (0.2 1.4 µM arasında), saat (210 dakika 30 arasında) ve sıcaklık (75 ° C-25 arasında değişen) konsantrasyon.
    2. SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA-sonra o nihayet SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA gösterilir hibridizasyon olay gerçekleştirmek için yüzey için tamamlayıcı DNA'ın 25 µL pipet. En iyi duruma getirme (5 ila 30 dakika arasında) zaman ve sıcaklık (75 ° C-25 arasında değişen) iki faktör üzerinden hibridizasyon durumu belirlemek.
    3. İmmobilize bırakın ve 20 µM MB 30 dakika süreyle melezleşmiştir elektrotlar 0,5 M ABS ile yıkayarak olmayan özellikle adsorbe DNA ve aşırı MB kaldırmak/deiyonize su ile durulama ve 20 mM NaCl (pH 4.5). MB azaltma DPV tekniği kullanarak en yüksek akım ölçüsü. 0.1 M PBS (pH 7) kullanarak DPV ölçüm yürütmek hiçbir gösterge içeren.
  3. Fabrikasyon DNA biyoalgılayıcı karakterizasyonu
    1. SPCE/PLA-AuNPs 20 µM MB 30 dk içinde bırakın, yıkama 0.5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4.5) ve o zaman ölçme önce deiyonize su ile durulayın. Sonda DNA, tamamlayıcı DNA, eşleşmeyen DNA ve tamamlayıcı DNA örnekleri de dahil olmak üzere tüm etkileşimler için benzer bir yordamı izleyin.
    2. Elektrokimyasal azaltma ölçmek.
      Not: Ticari olarak imal edilmiş bir Autolab arabirimi yazılım programıyla DPV şiddetindeydi.
      0,005 V, Modülasyon genlik 0,05 V ve 7.73 mVs-1 0.1 M PBS (pH 7), tarama hızı, potansiyel bir adımla V, 0,25 -0,5 V değişen bir potansiyel gerçekleştirilen MB elektrokimyasal azaltma DPV ölçümleri hiçbir gösterge içeren. Seçicilik, hassasiyet, tekrarlanabilirlik ve ısı dayanımı fabrikasyon DNA biyoalgılayıcı, daha da incelenmiştir. Bildirilen sonuçlar olarak ortalama değer ölçüleri içinde üç çoğaltır sunuldu.

3. gerçek örnekleri kullanarak fabrikasyon DNA biyoalgılayıcı doğrulama

  1. Bakteri suşları hazırlanması
    1. Deniz ürünleri31,32 onların önemli kirlilik dayalı bakteriyel örnekleri seçin.
      Not: V. parahaemolyticus olarak başvuru suşları ve 8 diğer bakteri suşları (Campylobacter jejuni, Listeria Monositogenez, Salmonella typhimurium, Salmonella enterit, Klebsiella pnömoni, Escherichia coli O157: H7, Bacillus cereusve Vibrio alginolyticus) ortak gıda kaynaklı patojen istihdam elektrokimyasal DNA biyoalgılayıcı doğrulama Bu çalışma için.
    2. Rutin bir alt kültür onların anılan sıraya göre agar bakteri suşlarının iki haftada canlılığı korumak, Tablo 1 kültür koşulları için başvurmak için kuralları.
    3. Onları dondurma işlemi sırasında zarar verebilir buz kristalleri oluşumunu engelleyerek bakteri gliserol korur gibi %20 (v/v) gliserol-80 ° C'de içeren onların anılan sıraya göre artan et suları içinde bakteri suşlarının uzun vadeli koruma korumak. Ardından, gliserol stokları korunmuş bakteriyel hücre kültüründe bir döngü ilgili broths aşılamak. Et suları ilgili büyüme zaman ve sıcaklık göre bakteri canlandırmak gerek zaman kuluçkaya.
    4. Dilutions bir dizi elde edilen mikroorganizmalar numaralandırmak için bir forma plaka tekniği33, bir standart ve iyi bilinen bir yöntemi kullanarak parahaemolyticus V. hücre sayısını belirle.
      1. Kültür parahaemolyticus V. Trypticase soya suyu (TSB + % 3 NaCl) 140-rpm sallayarak koşuldaki 37 ° C'de. O zaman, bakteri hücre kültürü 1 mL TSB + % 3 9 mL transferi NaCl 10-1 seyreltme faktörü elde etmek için.
    5. Bu dokuz kez en çok 10-10 seyreltme faktörü tam bir dizi elde etmek için tekrarlayın. Ardından, her seyreltme faktörü (10-10için 10-1 ' den başlayarak) 0.1 mL bir Vibrio'nın seçici agar plaka sayma, sırasıyla koloni için yayıldı. Plakayı 24 h 37 ° C'de inkübe kuluçkaya.
    6. Bir koloni sayaç bireysel kolonileri saymak ve sonra geri-(sayısı x seyreltme faktörü CFU/pipetted tutar) mililitre yoğunluğu (CFU mL-1) koloni oluşturan birim almak için hesaplamak için kullanın. Bakteri hücre süspansiyonlar CFU mL-1 absorbans karşı kalibrasyon komplo birimleri (CFUs) oluşturan colony konsantrasyonu türetmek.
  2. PCR tahlil hazırlanması
    1. Genomik DNA değiştirilmiş bir takip lizis yordamı34haşlanmış ayıklayın. Bireysel bir bakteriyel agar medyada süzün ve suyu medya, kendi göreli büyüme durumunu 140 bir koşul sallayarak rpm kuluçka tarafından takip aşılamak ilk, çizgi.
    2. Et suyu 1 mL kültürünün bir mikro santrifüj tüpüne pipette. Bu 4830 x g ve granül elde etmek için 1 dakika için 4 ° C, santrifüj kapasitesi. Steril TE arabelleği yaklaşık 500 µL re-süspansiyon ile Pelet için kullanın. Elde edilen süspansiyon için 10 dak hold 98 ± 2 ° C Isıtma blok ve hemen hücreleri parçalayıcı ve DNA'yı serbest bırakmak 10 min için-18 ° C'de chill.
    3. Genomik DNA 4830 x g ve açık bir süspansiyon elde etmek ve daha fazla kullanmak için-20 ° C'de süpernatant tutmak için 3 dakika için 4 ° C, santrifüj kapasitesi. Biophotometer ölçüm 260 bir dalga boyu, UV emme ile kullanmak nm (nükleik asitler dalgaboyu ışık emici) olarak ve aynı zamanda bir dalga boyu 280 nm (ışığın dalga boyu emici proteinler) olarak konsantrasyon ve ayıklanan saflığı belirlemek için genomik DNA ve standart biyokimyasal deneyleri35 kullanarak ve onları 16S rRNA gen sıralama36tarafından doğrulama tüm suşların tanımlamak. Son olarak, 92 ° c için 2 dk genomik DNA tabiatını ve hızla buz su biyoalgılayıcı için uygulamadan önce sakin ol.
    4. Daha fazla varlığı parahaemolyticus onaylamak toxR gen hedeflemek için PCR kullanarak. Bir thermocycler bir astar çift (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' ve 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3') kullanarak bu yordamı gerçekleştirin. PCR güçlendirme 25 µL steril su (15,5 µL), arabellek (5 µL), astar (1 µL, 10 µM), dNTP mix (1 µL), DNA şablonu (2 µL) ve Taq DNA polimeraz (0.2 µL, 10 x) oluşan toplam reaksiyon hacmi içinde en iyi duruma getirme.
    5. Bileşenleri karıştırın ve amplifikasyon 30 döngüleri için programlanmış bir thermocycler hedef sırada PCR amplifikasyon düzenlemek. Bizim çalışmada, her döngüsü üç adım reaksiyonlar i.eoluşuyordu., ilk denatürasyon (94 ° C, 3 dk) denatürasyon (94 ° C, 1 dk.), tavlama (63 ° C, 1,5 dk) ve son uzantısı (72 ° C, 7 dk) tarafından takip uzantısı (72 ° C, 1,5 dk), 30 döngüleri izledi.
    6. Güçlendirilmiş ürünler ve % 1.5 özel jel elektroforez ile boyutlarını belirleyin. Ticari olarak üretilen jel dokümantasyon sistemi ile jel çekim.
  3. Cockle örnekleri hazırlanması
    1. Taze örneklerini almak.
      Not: Bizim taze istiridye (Anadara granosa) Serdang, İstanbul, ıslak pazarda elde edilen ve hızlı bir şekilde bir buz soğutucusu kutusunda analiz için laboratuvara getirdi. Örnekleri 2 Grup, yani tedavi ve tedavi edilmezse grup daraltan düzgün soğuk hava deposu yerleştirerek kadar hasat başından itibaren hasat edildi varsayarak bölün.
    2. Tarak tedavi grubunda 24 h, 4 h önce DNA ekstraksiyon için 20 ° C'de UV ışığa maruz kalma ardından için-20 ° C'de depolayarak önceden tedavi.
      Not: Donma sıcaklığı ve kontrollü için kullanılan UV Işınlarına maruz kalma grup öldürür ya da en azından daraltan içinde doğal olarak biriken parahaemolyticus V. sınırlar. Taze daraltan gerçek durumunu taklit etmek için bu çalışmada kontrollü durumda amacı olduğu gibi 70 ° C daha yüksek bir pastörizasyon rejim geçerli değildir. Bu arada, laboratuvarda geldikleri gibi öncesi herhangi bir tedavi tedavi edilmezse grubundan doğrudan örnekleri analiz.
    3. Alt kültür parahaemolyticus V. ATCC 17802 TSB içinde bir tür (% 3 NaCl). Tekerlekli sandalye basketbolu uygun dilutions kaplama ile inoculum içinde hücrelerin düzeyini belirlemek (% 3 NaCl) 104 CFU mL-1 V. parahaemolyticus, bir inoculum elde etmek için CA'da. Her cockle distile suda yıkayın ve steril forseps laminar akış kabine dokular kabuğu'kaldırmak için kullanmadan önce kir ücretsiz fırçalayın.
    4. Bir homogenizer 90 ml steril TSB ile yaklaşık 10 g cockle doku örnekleri homojenize (% 3 NaCl) için 60 s. Ekle parahaemolyticus V. bilinen bir miktar homojenize örnek suyu için çivili örnekleri 9 ml. Unspiked örnekleri bir negatif kontrol kullanır. Cockle örnekleri için CA'da örneklerinin 0.1 mL kaplama tarafından çivili parahaemolyticus V. hücre sayısı tahmin etmek ve daha sonra emme biyoalgılayıcı ve PCR tahlil kullanılmak üzere, örnek 1 mL örnek microcentrifuge tüp içine DNA örneği almak için pipetting.
    5. Parahaemolyticus genomik DNA değiştirilmiş bir takip çivili ve unspiked örnekleri lizis yordamı36haşlanmış ayıklayın. Son olarak, DNA konsantrasyon ve UV emilimini 260 ile bir dalga boyu, biyo fotometre ölçüm kullanarak saflık belirlemek nm (nükleik asitler dalgaboyu ışık emici) olarak ve aynı zamanda bir dalga boyu 280 nm (olarak ışığın dalga boyu emici proteinler).

Sonuçlar

AuNPs oluşumu ile sodyum sitrat mevcut sulu çözüm renk değişikliği ile ortaya çıktı. Bu rengi açık sarı bir derin yakut kırmızı değiştirmek için neden oldu. PLA-AuNPs nesil yüzey plasmon rezonans (SPR) en yüksek büyüme bulunduğu yaklaşık 540 UV-vis spectra (Şekil 1) üzerinden teyit edildi nm. Oluşumu ve PLA-AuNPs varlığını parçacık boyutu37bağlı olarak 500-600 nm dalga boyu aralıkları belirtilen. ...

Tartışmalar

Bir dönüştürücü (nükleik asit veya DNA burada) için uygun biyolojik tanıma öğeler seçimi, elektrokimyasal biyoalgılayıcı bu tip başarılı geliştirme için bir çerçeve içinde önemli adımlardır dönüştürücü algılama tabakası oluşturmak için kimyasal bir yaklaşım; iletim malzeme; DNA immobilizasyon ve hibridizasyon duruma getirilmesi; ve gerçek numuneleri kullanılarak geliştirilen biyoalgılayıcı doğrulama.

Hassas ve seçici elektrokimyasal DNA biyoalgıla...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar Universiti Putra Malezya destek kabul etmek istiyorum.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidMerck100056
ChloroformMerck102445
Diaminoethane tetraacetic acidPromegaE5134
Dibasic sodium phosphate Sigma-AldrichS9763
Disodium hydrogen phosphateSigma-Aldrich255793
Ethanol Sigma-Aldrich16368
Gold (III) chloride trihydrateSigma-Aldrich520918
Hydrochloric acidMerck100317
Methylene blueSigma-AldrichM44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrateSigma-AldrichS3522
Phosphate-buffered salineSigma-AldrichP5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042DNatureWorks4042D
Potassium chlorideR&M Chemicals59435
Potassium dihydrogen phosphateSigma-AldrichP9791
Potassium hexacyanoferrate IIIR&M Chemicals208019
Sodium acetate anhydrous saltSigma-AldrichS2889
Sodium chlorideSigma-AldrichS9888
Trisodium citrateSigma-AldrichS1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethaneFisher ScientificT395-100
Tris-BaseFisher ScientificBP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-DyeNorgen Biotek28240
Agarose gelMerck101236
Bolton AgarMerck100079
Bolton BrothMerck100079
CHROMagar VibrioCHROMagarVB910
dNTPsPromegaU1511
Nuclease-free waterThermo ScientificR0581
Eosin methylene blue agar Merck101347
GelRedBiotium41001
GlycerolMerck104092
Go Taq BufferPromegaM7911
Loading dye 100 bp DNA ladderPromegaG2101
Loading dye 1kb DNA ladderPromegaG5711
Magnesium chloridePromega91176
Mannitol egg yolk polymyxin agarMerck105267
McConkey AgarMerck105465
Nutrient BrothMerck105443
Taq polymeraseMerck71003
Trypticase Soy BrothMerck105459
Trypticase Soy AgarMerck105458

Referanslar

  1. Gould, L. H., Rosenblum, I., Nicholas, D., Phan, Q., Jones, T. F. Contributing factors in restaurant-associated foodborne disease outbreaks, FoodNet sites, 2006 and 2007. Journal of Food Protection. 76, 1824-1828 (2013).
  2. Arvanitoyannis, I. S., Kotsanopoulos, K. V., Papadopoulou, A. Rapid detection of chemical hazards (toxins, dioxins, and PCBs) in seafood. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 54, 1473-1528 (2014).
  3. Robertson, L. J., Sprong, H., Ortega, Y. R., van der Giessen, J. W. B., Fayer, R. Impacts of globalisation on foodborne parasites. Trends in Parasitology. 30, 37-52 (2014).
  4. Sandilands, E. A., Bateman, D. N. The epidemiology of poisoning. Medicine. 44, 76-79 (2016).
  5. Boschi-Pinto, C., Velebit, L., Shibuya, K. Estimating child mortality due to diarrhoea in developing countries. Bulletin of the World Health Organization. 86, 710-717 (2008).
  6. Farthing, M. J. G. Diarrhoea: A Significant Worldwide Problem. International Journal of Antimicrobial Agents. 14, 65-69 (2000).
  7. World Health Organization. . WHO estimates of the global burden of foodborne diseases: foodborne disease burden epidemiology reference group 2007-2015. , 1-255 (2015).
  8. Yeung, M., Boor, K. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathogens and Disease. 1, 74-88 (2004).
  9. Sakazaki, R., Cliver, D. O., Riemann, H. P. . Foodborne Diseases. , 127-136 (2002).
  10. Grochowsky, J., Odom, S. R., Akuthota, P., Stead, W. Primary Septicemia and Abdominal Compartment Syndrome From Vibrio parahaemolyticus Infection in a 40-Year-Old Patient With No Known Immunocompromise. Infectious Disease in Clinical Practice. 22, (2013).
  11. Raghunath, P. Roles of thermostable direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin (TRH) in Vibrio parahaemolyticus. Frontiers in Microbiology. 5, 805 (2014).
  12. Kalburge, S. S., Whitaker, W. B., Boyd, E. F. High-Salt Preadaptation of Vibrio parahaemolyticus Enhances Survival in Response to Lethal Environmental Stresses. Journal of Food Protection. 77, 246-253 (2014).
  13. Esteves, K., Hervio-Heath, D., Mosser, T., Rodier, C., Tournoud, M. G., Jumas-Bilak, E., Colwell, R. R., Monfort, P. Rapid proliferation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, and Vibrio cholerae during freshwater flash floods in French Mediterranean Coastal lagoons. Applied and Environmental Microbiology. 81, 7600-7609 (2015).
  14. Khandeparker, L., Anil, A. C., Naik, S. D., Gaonkar, C. C. Daily variations in pathogenic bacterial populations in a monsoon influenced tropical environment. Marine Pollution Bulletin. 96, 337-343 (2015).
  15. Caburlotto, G., Suffredini, E., Toson, M., Fasolato, L., Antonetti, P., Zambon, M., Manfrin, A. Occurrence and molecular characterization of Vibrio parahaemolyticus in crustaceans commercialised in Venice area, Italy. International Journal of Food Microbiology. 220, 39-49 (2016).
  16. Wong, H. C., Chen, M. C., Liu, S. H., Liu, D. P. Incidence of highly genetically diversified Vibrio parahaemolyticus in seafood imported from Asian countries. International Journal of Food Microbiology. 52, 181-188 (1999).
  17. Rosec, J. P., Causse, V., Cruz, B., Rauzier, J., Carnat, L. The international standard ISO/TS 21872-1 to study the occurence of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae in seafood: ITS improvement by use of a chromogenic medium and PCR. International Journal of Food Microbiology. 157, 189-194 (2012).
  18. Maniyankode, R. A., Kingston, J. J., Murali, H. S., Batra, H. V. Specific identification of vibrio parahaemolyticus employing monoclonal antibody based immunoassay. International Journal of Pharmacy and Biological Sciences. 4 (2), B156-B164 (2013).
  19. Suffredini, E., Lopez-Joven, C., Maddalena, L., Croci, L., Roque, A. Pulsed-field gel electrophoresis and PCR characterization of environmental Vibrio parahaemolyticus strains of different origins. Applied and Environmental Microbiology. 77, 6301-6304 (2011).
  20. Bhattacharyya, N., Hou, A. A pentaplex PCR assay for detection and characterization of Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus isolates. Letters in Applied Microbiology. 57, 233-240 (2013).
  21. da Silva, E. T. S. G., et al. Electrochemical Biosensors in Point-of-Care Devices: Recent Advances and Future Trends. ChemElectroChem. 4 (4), 778-794 (2017).
  22. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. Sensitive detection of multiple pathogens using a single DNA probe. Biosensors and Bioelectronics. 86, 398-405 (2016).
  23. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. A simple, portable, electrochemical biosensor to screen shellfish for Vibrio parahaemolyticus. AMB Express. 7 (1), 41 (2017).
  24. Zhang, J., Li, Z., Zhang, H., Wang, J., Liu, Y., Chen, G. Rapid detection of several foodborne pathogens by F0F1-ATPase molecular motor biosensor. Journal of Microbiological Methods. 93, 37-41 (2013).
  25. Barsan, M. M., Ghica, E. M., Brett, C. M. A., Nikolelis, D. P., Varzakas , T., Erdem, A., Nikoleli, G. P. . Portable biosensing of food toxicants and environmental pollutants. , 33-69 (2014).
  26. Kwun, J., Yun, S., Park, L., Lee, J. H. Development of 1,1'-oxalyldiimidazole chemiluminescent biosensor using the combination of graphene oxide and hairpin aptamer and its application. Talanta. 119, 262-267 (2014).
  27. Thavanathan, J., Huang, N. M., Thong, K. L. Colorimetric biosensing of targeted gene sequence using dual nanoparticle platforms. International Journal of Nanomedicine. 10, 2711-2722 (2015).
  28. Hushiarian, R., Yusof, N. A., Abdullah, A. H., Ahmad, S. A. A., Dutse, S. W. Facilitating the indirect detection of genomic DNA in an electrochemical DNA biosensor using magnetic nanoparticles and DNA ligase. Analytical Chemistry Research. 6, 17-25 (2015).
  29. Dutse, S. W., Yusof, N. A., Ahmad, H., Hussein, M. Z., Zainal, Z., Hushiarian, R., Hajian, R. An Electrochemical Biosensor for the Determination of Ganoderma boninense Pathogen Based on a Novel Modified Gold Nanocomposite Film Electrode. Analytical Letters. 47 (5), 819-832 (2014).
  30. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hajian, R. Characterization of Polylactide-Stabilized Gold Nanoparticles and Its Application in the Fabrication of Electrochemical DNA Biosensors. Journal of the Brazilian Chemical Society. 27 (9), 1679-1686 (2016).
  31. Vongkamjan, K., Wang, S., Moreno Switt, A. I. Rapid detection of foodborne bacterial pathogens in seafood. Handbook of Seafood: Quality and Safety Maintenance and Applications. , 247-257 (2016).
  32. Wang, F., Jiang, L., Yang, Q., Han, F., Chen, S., Pu, S., Vance, A., Ge, B. Prevalence and antimicrobial susceptibility of major foodborne pathogens in imported seafood. Journal of Food Protection. 74 (9), 1451-1461 (2011).
  33. Szermer-Olearnik, B., Sochocka, M., Zwolinska, K., Ciekot, J., Czarny, A., Szydzik, J., Kowalski, K., Boratynski, J. Comparison of microbiological and physicochemical methods for enumeration of microorganisms. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 68, 1392-1396 (2014).
  34. Ivanov, I. G., Bachvarov, D. R. Determination of plasmid copy number by the "boiling" method. Analytical Biochemistry. 165 (1), 137-141 (1987).
  35. Gopireddy, V. R. Biochemical tests for the identification of bacteria. International Journal of Pharmacy and Technology. 3 (4), 1536-1555 (2011).
  36. Böhme, K., Fernández-No, I. C., Pazos, M., Gallardo, J. M., Barros-Velázquez, J., Cañas, B., Calo-Mata, P. Identification and classification of seafood-borne pathogenic and spoilage bacteria: 16S rRNA sequencing versus MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 34 (6), 877-887 (2013).
  37. Seoudi, R., Fouda, A. A., Elmenshawy, D. A. Synthesis, characterization and vibrational spectroscopic studies of different particle size of gold nanoparticle capped with polyvinylpyrrolidone. Physica B: Condensed Matter. 405, 906-911 (2010).
  38. Mishra, A., Harper, S., Yun, S. I. Interaction of biosynthesized gold nanoparticles with genomic DNA isolated from E. coli and S. aureus. Nanotechnology (IEEE-NANO). , 1745-1750 (2011).
  39. Sugimoto, T. Formation of modoispersed nano- and micro-particles controlled in size, shape, and internal structure. Chemical Engineering and Technology. 26, 313-321 (2003).
  40. Rath, C., Sahu, K. K., Kulkarni, S. D., Anand, S., Date, S. K., Das, R. P., Mishra, N. C. Microstructure-dependent coercivity in monodispersed hematite particles. Applied Physics Letters. 75, 4171-4173 (1999).
  41. Abbas, M., Wu, Z. Y., Zhong, J., Ibrahim, K., Fiori, A., Orlanducci, S., Sessa, V., Terranova, M. L., Davoli, I. X-ray absorption and photoelectron spectroscopy studies on graphite and single-walled carbon nanotubes: Oxygen effect. Applied Physics Letters. 87 (5), 051923 (2005).
  42. Lim, S. C., Choi, Y. C., Jeong, H. J., Shin, Y. M., An, K. H., Bae, D. J., Lee, Y. H., Lee, N. S., Kim, J. M. Effect of gas exposure on field emission properties of carbon nanotubes arrays. Advanced Materials. 13, 1563-1567 (2001).
  43. Kim, B. H., Kim, B. R., Seo, Y. G. A study on adsorption equilibrium for oxygen and nitrogen into carbon nanotubes. Adsorption. 11, 207-212 (2005).
  44. Bard, A. J., Faulkner, L. R. . Electrochemical methods: Fundamentals and applications. , (2000).
  45. Tan, Q., Wang, L., Ma, L., Yu, H., Ding, J., Liu, Q., Xiao, A., Ren, G. Study on anion electrochemical recognition based on a novel ferrocenyl compound with multiple binding sites. Journal of Physical Chemistry B. 112, 11171-11176 (2008).
  46. Manivannan, S., Ramaraj, R. Polymer-embedded gold and gold/silver nanoparticle-modified electrodes and their applications in catalysis and sensors. Pure and Applied Chemistry. 83, 2041-2053 (2011).
  47. Benali, O., Larabi, L., Traisnel, M., Gengembre, L., Hareka, Y. Electrochemical, theoretical and XPS studies of 2-mercapto-1-methylimidazole adsorption on carbon steel in 1 M HClO4. Applied Surface Science. 253, 6130-6139 (2007).
  48. Shi, Y., Wen, L., Li, F., Cheng, H. M. Nanosized Li4Ti5O12/graphene hybrid materials with low polarization for high rate lithium ion batteries. Journal of Power Sources. 196, 8610-8617 (2011).
  49. Bentiss, F., Traisnel, M., Lagrenee, M. The substituted 1,3,4-oxadiazoles: a new class of corrosion inhibitors of mild steel in acidic media. Corrosion Science. 42, 127-146 (2000).
  50. Wang, M., Gong, W., Meng, Q., Zhang, Y. Electrochemical DNA impedance biosensor for the detection of DNA hybridization with polymeric film, single walled carbon nanotubes modified glassy carbon electrode. Russian Journal of Electrochemistry. 47, 1368-1373 (2011).
  51. Herdt, A. R., Drawz, S. M., Kang, Y., Taton, T. A. DNA dissociation and degradation at gold nanoparticle surfaces. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 51 (2), 130-139 (2006).
  52. Bhatt, N., Huang, P. J. J., Dave, N., Liu, J. Dissociation and degradation of thiol-modified DNA on gold nanoparticles in aqueous and organic solvents. Langmuir. 27, 6132-6137 (2011).
  53. Liu, X., Jang, C. H., Zheng, F., Jürgensen, A., Denlinger, J. D., Dickson, K. A., Raines, R. T., Abbott, N. L., Himpsel, F. J. Characterization of protein immobilisation at silver surfaces by near edge X-ray absorption fine structure spectroscopy. Langmuir. 22, 7719-7725 (2006).
  54. Willey, T. M., Andrew, L., Vance, T., Buuren, V., Bostedt, C., Terminello, L. J., Fadley, C. S. Rapid degradation of alkanethiol-based self-assembled monolayers on gold in ambient laboratory conditions. Surface Science. 576 (1), 188-196 (2005).
  55. Farjami, E., Clima, L., Gothelf, K., Ferapontova, E. E. DNA interactions with a Methylene Blue redox indicator depend on the DNA length and are sequence specific. Analyst. 135, 1443-1448 (2010).
  56. Lin, X., Ni, Y., Kokot, S. An electrochemical DNA-sensor developed with the use of methylene blue as a redox indicator for the detection of DNA damage induced by endocrine-disrupting compounds. Analytica Chimica Acta. 867, 29-37 (2015).
  57. Zhang, F. T., Nie, J., Zhang, D. W., Chen, J. T., Zhou, Y. L., Zhang, X. X. Methylene Blue as a G-Quadruplex Binding Probe for Label-Free Homogeneous Electrochemical Biosensing. Analytical Chemistry. 86, 9489-9495 (2014).
  58. Ning, L., Li, X., Yang, D., Miao, P., Ye, Z., Li, G. Measurement of Intracellular pH Changes Based on DNA-Templated Capsid Protein Nanotubes. Analytical Chemistry. 86, 8042-8047 (2014).
  59. Sani, N. D. M., Heng, L. Y., Surif, S., Lazim, A. M., Murad, A. . AIP Conference Proceedings. 1571, 636-640 (2013).
  60. Xu, P., Wang, J., Xu, Y., Chu, H., Shen, H., Zhang, D., Zhao, M., Liu, J., Li, G. Binding modes and interaction mechanism between different base pairs and methylene blue trihydrate: a quantum mechanics study. Advances in Experimental Medicine and Biology. 827, 187-203 (2015).
  61. Guo, Y., Chen, J., Chen, G. A label-free electrochemical biosensor for detection of HIV related gene based on interaction between DNA and protein. Sensors & Actuators, B: Chemical. 184, 113-117 (2013).
  62. Huang, K. J., Liu, Y. J., Wang, H. B., Wang, Y. Y., Liu, Y. M. Sub-femtomolar DNA detection based on layered molybdenum disulfide/multi-walled carbon nanotube composites, au nanoparticle and enzyme multiple signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 55, 195-202 (2014).
  63. Kong, R. M., Song, Z. L., Meng, H. M., Zhang, X. B., Shen, G. L., Yu, R. Q. A label-free electrochemical biosensor for highly sensitive and selective detection of DNA via a dual-amplified strategy. Biosensors and Bioelectronics. 54, 442-447 (2014).
  64. Rashid, J. I. A., Yusof, N. A., Abdullah, J., Hashim, U., Hajian, R. Novel Disposable Biosensor Based on SiNWs/AuNPs Modified-Screen Printed Electrode for Dengue Virus DNA Oligomer Detection. IEEE Sensors Journal. 15, 4420-4421 (2015).
  65. Yingkajorn, M., Sermwitayawong, N., Palittapongarnpimp, P., Nishibuchi, M., Robins, W. P., Mekalanos, J. J., Vuddhakul, V. Vibrio parahaemolyticus and its specific bacteriophages as an indicator in cockles (Anadara granosa) for the risk of V. parahaemolyticus infection in Southern Thailand. Microbial Ecology. 67, 849-856 (2014).
  66. Ahmad Ganaie, H., Ali, M. N. Short term protocol for the isolation and purification of DNA for molecular analysis. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. 24, 266-270 (2014).
  67. Nakano, K., Kimura, T., Kitamura, Y., Ihara, T., Ishimatsu, R., Imato, T. Potentiometric DNA sensing platform using redox-active DNA probe pair for sandwich-type dual hybridization at indicator electrode surface. Journal of Electroanalytical Chemistry. 720-721, 71-75 (2014).
  68. Yang, J., Jim Yang, L., Heng-Phon, T., Gan-Moog, C. Inhibition of DNA hybridization by small metal nanoparticles. Biophysical Chemistry. 120, 87-95 (2006).
  69. Niu, L. M., Liu, F., Wang, W., Lian, K. Q., Ma, L., Shi, H. M., Kang, W. J. Electrochemical Behavior of Paraquat on a Highly Ordered Biosensor Based on an Unmodified DNA-3D Gold Nanoparticle Composite and Its Application. Electrochimica Acta. 153, 190-199 (2015).
  70. Li, Z., Miao, X., Xing, K., Zhu, A., Ling, L. Enhanced electrochemical recognition of double-stranded DNA by using hybridization chain reaction and positively charged gold nanoparticles. Biosensors and Bioelectronics. 74, 687-690 (2015).
  71. Niu, S., Sun, J., Nan, C., Lin, J. Sensitive DNA biosensor improved by 1,10-phenanthroline cobalt complex as indicator based on the electrode modified by gold nanoparticles and graphene. Sensors and Actuators B: Chemical. 176, 58-63 (2013).
  72. Yi, H., Xu, W., Yuan, Y., Bai, L., Wu, Y., Chai, Y., Yuan, R. A pseudo triple-enzyme cascade amplified aptasensor for thrombin detection based on hemin/G-quadruplex as signal label. Biosensors and Bioelectronics. 54, 415-420 (2014).
  73. Das, R., Sharma, M. K., Rao, V. K., Bhattacharya, B. K., Garg, I., Venkatesh, V., Upadhyay, S. An electrochemical genosensor for Salmonella typhi on gold nanoparticles-mercaptosilane modified screen printed electrode. Journal of Biotechnology. 188, 9-16 (2014).
  74. Han, X., Fang, X., Shi, A., Wang, J., Zhang, Y. An electrochemical DNA biosensor based on gold nanorods decorated graphene oxide sheets for sensing platform. Analytical Biochemistry. 443 (2), 117-123 (2013).
  75. Huang, K. J., Liu, Y. J., Zhang, J. Z., Cao, J. T., Liu, Y. M. Aptamer/Au nanoparticles/cobalt sulfide nanosheets biosensor for 17β-estradiol detection using a guanine-rich complementary DNA sequence for signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 67, 184-191 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendisliksay 136Polylactic asit sa laml k alt n nano tanecikleriSerigrafi karbon elektrotDNA biyoalg lay cVibrio parahaemolyticuselektrokimyasal sens rDNA hibridizasyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır