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摘要

本文提出了一种电化学 DNA 生物传感器的研制方案, 包括聚乳酸稳定、金纳米粒子修饰、丝网印刷碳电极检测副溶血性弧菌。

摘要

副溶血性弧菌 (副溶血性)是一种常见的食源性致病菌, 在全球范围内造成很大比例的公共卫生问题, 严重影响人类死亡率和发病率。常规的检测v. 副溶血性的方法, 如基于文化的方法、免疫学化验和基于分子的方法, 需要复杂的样品处理, 耗时、繁琐、费用高昂。近年来, 生物传感器已被证明是一种有前景的综合检测方法, 具有快速检测、性价比高、实用性强等优点。本研究的重点是利用 DNA 杂交原理开发一种快速检测具有高选择性和灵敏度的v. 副溶血性方法。在工作中, 采用 x 射线衍射 (XRD)、紫外可见光谱 (紫外-可见光)、透射电镜 (TEM)、场发射等方法, 对合成聚乳酸稳定金纳米粒子 (PLA-AuNPs) 进行了表征。扫描电镜 (FESEM) 和循环伏安法 (CV)。并对 PLA-AuNPs 的稳定性、灵敏度和重现性进行了进一步的测试。研究发现, PLA-AuNPs 在水溶液中形成了稳定纳米粒子的良好结构。我们还观察到, 由于较小的电荷转移电阻 (Rct) 值和活动表面积 (0.41 厘米2) 的增加, 灵敏度得到了改善。我们的 DNA 生物传感器的发展是基于对 AuNPs 和以亚甲基蓝 (MB) 为氧化还原指标的丝网印刷碳电极 (SPCE) 的改性。用差分脉冲伏安法 (DPV) 对固定化和杂交事件进行了评估。我们发现, 互补, 非互补, 和不匹配的寡核苷酸是专门区分的捏造的生物传感器。它还显示了对各种食物传播病原体的交叉反应性研究和在新鲜的蛤中鉴定v. 副溶血的可靠敏感检测。

引言

近年来公众和科学争论的一个主要话题, 食物中毒主要与3剂有关: 微生物1、化学试剂2和寄生虫3。受污染的食物会对人类造成严重的健康后果, 特别是在免疫系统薄弱、老年人、孕妇、婴儿和年幼儿童的高危人群中,4。由于非洲、亚洲和拉丁美洲5岁以下儿童每年发生100万多例急性腹泻, 食物中毒是全球主要疾病5,6 , 世界卫生组织已建立微生物作为最重要的贡献者7。副溶血弧菌在最广泛公认的毒株中脱颖而出。通常在沿海、河口和海洋环境中发现8, 它是一种革兰阴性菌, 在高盐环境中活跃, 在未充分烹调、处理不当或未加工的海洋中进食时引起严重的人胃肠炎。产品9。此外, 一些人现有的医疗条件使他们容易受到伤口感染、败血症或耳部感染, 这是由v 副溶血症10引起的。溶血素的毒力因子可分为两种类型, 分别为致病致病机制: TDH 基因编码的耐热直接溶血素 (TDH) 和 trh 基因11编码的 TDH 相关溶血素. 在临床标本中, 而不是在环境标本中, tdh 的毒力标志物 (trh 基因) 主要表现为副溶血性。

v. 副溶血性具有在广泛的条件下生存的能力, 迅速响应环境变化12。它的增殖机制随着细胞质量的增加, 其毒性也随之增大13, 从而提升其危险电位。更糟糕的是, 气候变化给这些细菌提供了充足的条件来加速他们的细胞数量增长14。由于其频率高, 需要在食品供应链上对v. 副溶血性进行监测, 特别是在海鲜的贸易和生产方面, 因为这些产品在很大数量上被发现,15,16在世界各地。目前, 细菌的识别和隔离使用了一系列的方法, 包括生物化学试验, 浓缩和选择性培养基17, 酶联磁吸附剂检测 (ELISA)18, 脉冲场凝胶电泳 (PFGE)19、乳胶凝集试验和聚合酶链反应 (PCR) 测试20。这些方法通常需要合格的人员, 先进的仪器, 和费力的技术, 没有立即提供污染的信息。这严重限制了及时检测有害污染和现场应用的可能性。快速检测工具仍然是一个突出的挑战。

生物传感正在成为检测食源性病原体的一个有希望的选择, 因为它提供了节省时间、经济高效、实用和实时分析方法 21, 22, 23, 24.然而, 尽管在尖刺样品和使用生物传感器的标准溶液中分析物检测有许多积极的结果, 但在水混合物或有机萃取物中, 仍缺乏对实际样品的研究25。最近, 利用直接和/或间接脱氧核糖核酸 (DNA) 检测的电化学生物传感器在科学家中得到了越来越多的关注, 因为它们通过杂交事件对互补靶的具体检测26,27,28,29. 与基于酶的生物传感器相比, 这些独特的方法更加稳定, 从而为小型化和商业化提供了一个有前景的技术。这项研究的目标是构建一个快速的工具, 能够检测出具有高选择性、灵敏性和实用性的、基于 DNA 序列特异性的杂交法. 识别策略包括聚乳酸稳定的金纳米粒子 (PLA-AuNPs)30和丝网印刷碳电极 (SPCEs) 在存在杂交指示剂, 亚甲基蓝 (MB)。利用细菌 DNA 裂解液和新鲜的蛤样, 进一步探讨了所研制的检测结构的潜力。

研究方案

注: 所有使用的化学药剂和生化试剂均应采用分析级, 无需进一步纯化。使用无菌去离子水制备所有溶液。灭菌前的所有玻璃器皿。

警告: 在进行实验室活动时, 请使用所有适当的安全做法, 包括使用工程控制 (油烟机、glovebox) 和个人防护设备 (安全眼镜、手套、实验室大衣、全长长裤、闭合脚趾鞋)。

1. 用 PLA-AuNPs 修饰电极的制备与表征

  1. PLA-AuNPs 的制备与表征
    1. 快速添加10毫升柠檬酸钠溶液 (38.8 毫米) 到100毫升的沸腾水四氯金酸溶液 (1 毫米), 并冷却到周围温度。观察准备好的 AuNPs 溶液中的颜色变化, 开始为黄色, 变黑, 最后作为暗红宝石红色。
    2. 将 PLA 颗粒放入不锈钢模具中进行熔化, 并在温度为190摄氏度时将其预热10分钟. 按照按下的程序: 将其置于 2.2 MPa 的压力下, 作为 PLA 板料制备的一部分。在冷却大约3小时后, PLA 板将准备就绪。
    3. 在室温下搅拌, 在5毫升氯仿中溶解0.68 毫克的 PLA 片。将溶解的 PLA 与先前制备的 AuNPs 溶液的10毫升混合, 在室温下均匀搅拌。均匀的混合物可以表示为 PLA-AuNPs, 其特征是使用紫外可见光、XRD、TEM 和 FESEM EDX。
  2. 改性丝网印刷炭电极的制备与表征
    注: 本研究使用的 SPCE 包括三电极系统: 计数器电极、碳工作电极和银/AgCl 参考电极。
    1. 快速吸管25µL 的均匀溶液的 AuNPs 到 SPCE, 然后空气干燥24小时之前使用。
    2. 电化学特征的修饰电极, SPCE/PLA-AuNPs, 在氰化钾 (K3[Fe (CN)6]3-/4-), 以测量有源表面积, 电化学阻抗谱, 重复性,重现性和稳定性30。

2. 电化学 DNA 生物传感器的研制

  1. 探头准备
    注: ssDNA 探针和互补 DNA 序列是根据国家生物技术信息中心 (NCBI) 数据库的信息选择的。
    1. 购买合成寡核苷酸 (20 ssDNA 探针, 20 的互补 dna, 20 不匹配的 dna, 21 的非互补 dna) 作为冻干粉从商业实验室, 根据以下序列:
      thiolated ssDNA 探针: 5′-/5ThioMC6-d-/CGGATTATGCAGAAGCACTG-3′
      补充 DNA: 5′-CAGTGCTTCTGCATAATCCG-3′
      单基地不匹配 DNA: 5′-CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG 3′
      三基不匹配的 DNA: 5′-CAGTGCTTCT ĊṪṪTAATCCG 3′
      非互补 DNA: 5′-CGCACAAGGCTCGACGGCTGA-3′
    2. 用无菌 TE 溶液 (10 毫米三盐酸, 1 毫米 EDTA, pH 7.5) 制备所有寡核苷酸 (100 µM) 的库存溶液, 分为分析部分。保持这个在-4 摄氏度, 然后做适当的稀释在使用之前。
  2. 固定化与杂交的优化
    注: 用 pla-AuNPs 修饰的 SPCE, 以 SPCE/PLA-AuNPs 为研究对象, 采用滴注法进行 DNA 固定化和杂交。
    1. 首先, 固定25µL 的 thiolated ssDNA 探针 SPCE/pla AuNPs, 然后空气干燥24小时室温, 然后它将最后被称为 SPCE/解放军-AuNPs/ssDNA。用三因素确定固定条件的优化: ssDNA 的浓度 (从0.2 到1.4 µM), 时间 (从30到210分钟不等), 温度 (从25到75摄氏度不等)。
    2. 吸管25µL 的补充 DNA 的表面上 SPCE/解放军-AuNPs/ssDNA 进行杂交事件后, 它可以最后被称为 SPCE/解放军-AuNPs/dsDNA。通过两个时间因素 (从5到30分钟不等) 和温度 (范围从25到75°c) 确定杂交条件的优化。
    3. 将固定化和杂交电极浸泡在20µM MB 30 分钟内, 通过洗涤0.5 米 ABS/20 毫米氯化钠 (pH 4.5) 去除非特异吸附的 DNA 和过量 MB, 然后用去离子水冲洗。使用 DPV 技术测量 MB 还原的峰值电流。使用不含指示器的0.1 米 PBS (pH 7) 执行 DPV 测量。
  3. 制备 DNA 生物传感器的特性研究
    1. 浸泡 SPCE/解放军-AuNPs 在20µM MB 30 分钟, 洗0.5 米 ABS/20 毫米氯化钠 (pH 4.5), 然后用去离子水冲洗之前测量。对所有的相互作用, 包括探针 dna, 互补 dna, 不匹配的 dna 和非互补的 dna 样本, 遵循类似的程序。
    2. 测量电化学还原。
      注意: 我们用一个商业制造的 Autolab 与接口软件测量 DPV。
      MB 电化学还原的 DPV 测量在可能范围从-0.5 v 到 0.25 v 进行, 具有 0.005 v 的步长电位, 调制振幅为 0.05 V, 以及 7.73 M PBS (pH-1) 中0.1 个 mv7的扫描速率, 不含指示器。进一步研究了制备的 DNA 生物传感器的选择性、灵敏度、重现性和热稳定性。报告的结果作为平均价值测量被提出了三复制。

3. 用真实样品验证制备的 DNA 生物传感器

  1. 细菌菌种的制备
    1. 根据海鲜的严重污染, 选择细菌样本31,32 。
      注:副溶血性为参考菌株和其他8株细菌 (空肠弯曲菌、李斯特氏细胞增生症、沙门氏菌伤寒、沙门氏菌肠炎、克雷伯杆菌肺炎、本文研究了常见食源性致病菌的大肠杆菌 O157:H7、蜡样芽孢杆菌、弧菌携带溶藻) 的电化学 DNA 生物传感器验证。
    2. 每两周在各自琼脂上进行细菌菌株的例行亚文化以保持其生存能力, 请参阅表 1中的区域性条件。
    3. 保持长期保存的细菌菌株在其各自生长的汤含有 20% (v/v) 甘油在-80 摄氏度, 因为甘油保护细菌, 防止冰晶体的形成, 可以破坏他们在冻结过程中。其次, 将甘油类中保存的细菌细胞培养循环接种到各自的汤中。在需要恢复细菌时, 根据各自的生长时间和温度孵化汤。
    4. 使用扩展板技术 (33) 确定v. 副溶血性细胞的数量, 这是一种用于列举一系列稀释的微生物的标准和众所周知的方法。
      1. 文化v. 副溶血在胰酪胨大豆汤 (3% 氯化钠) 在37°c 在 140 rpm 震动情况。然后, 将细菌细胞培养的1毫升转化为9毫升的3% 氯化钠, 以获得 10-1稀释因子。
    5. 重复此步骤九次以获得多达10个-10稀释因子的完整系列。接下来, 分别将每个稀释因子的0.1 毫升 (从 10-1到 10-10) 传播到一个弧菌的选择性琼脂板上进行菌落计数。孵化的板块孵化在37°c 24 小时。
    6. 使用蚁群计数器计算单个菌落数, 然后返回计算 (计数 CFU/pipetted 量 x 稀释因子) 以获得每毫升密度的菌落形成单位 (CFU mL-1)。从 CFU mL-1的定标图中获得菌落形成单元 (CFUs) 在细菌细胞悬浮液中的浓度。
  2. PCR 法的制备
    1. 在经过改良的煮沸裂解过程中提取基因组 DNA34。首先, 对琼脂培养基上的单个细菌株进行条纹, 并将其接种在肉汤培养基中, 然后在其相对生长条件下孵化, 140 rpm 震动状态。
    2. 将1毫升的肉汤培养成微离心管。离心机这在 4830 x g 和4°c 为1分钟获得药丸。使用约500µL 的无菌 TE 缓冲器, 以重新悬浮与颗粒。在加热块中按住所产生的悬浮10分钟, 在98到2摄氏度, 并立即冷却它在-18 摄氏度为10分钟溶解细胞和释放 DNA。
    3. 离心机的基因组 DNA 在 4830 x g 和4°c 3 分钟, 以获得明确的悬浮和保持在-20 °c 的上清, 进一步使用。使用 biophotometer 测量与紫外线吸收在波长260毫微米 (作为核酸吸收波长的光) 并且在波长280毫微米 (作为蛋白质吸收波长的光) 确定提取的浓度和纯度基因组 DNA, 然后用标准生化化验方法确定所有菌株35并通过 16S rRNA 基因序列36进行验证。最后, 变性基因组 DNA 在92°c 2 分钟, 并在冰水中迅速冷却, 然后再应用到生物传感器。
    4. 通过 PCR 对 toxR 基因的靶向进行进一步确认. 使用底漆对 (5 '-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3 ' 和 5 '-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3 ') 在 thermocycler 中执行此过程。优化 PCR 放大的总反应量25µL 由不育水 (15.5 µL), 缓冲器 (5 µL), 底漆 (1 µL, 10 µM), dNTP 混合 (1 µL), dna 模板 (2 µL), Taq dna 聚合酶 (0.2 µL, 10x)。
    5. 混合的成分, 并安排 PCR 放大的目标序列在 thermocycler 30 周期的放大程序。在我们的研究中, 每个周期包括三步反应i. e., 初始变性 (94 °c, 3 分钟), 其次为30循环变性 (94 °c, 1 分钟), 退火 (63 °c, 1.5 分钟) 和延伸 (72 °c, 1.5 分钟), 后跟最后的延伸 (72 °c, 7 分钟)。
    6. 通过1.5% 琼脂糖凝胶电泳法测定扩增产品及其尺寸。用商业制作的凝胶文件系统捕捉凝胶图像。
  3. 蛤皮样品的制备
    1. 获取新鲜样品。
      注: 我们的新鲜的蛤 (Anadara 蚶) 是从雪兰莪沙登训练班的湿市场获得的, 并迅速带到实验室的冰冷却箱进行分析。将样本分成2组, 即被治疗和未处理的组, 假设在收割开始时, 它们会均匀地收获, 直到放入冷库。
    2. 在治疗组中, 先将其贮存在-20 摄氏度, 24 小时, 然后在 DNA 提取前, 在20摄氏度的紫外线照射下, 进行4小时的治疗。
      注: 用于对照组的冷冻温度和紫外线照射会杀死或至少限制在蛤中自然积聚的v. 副溶血。在本研究中, 不要采用更高的巴氏杀菌70摄氏度, 目的是模拟新鲜的蛤的实际情况。同时, 直接从未经治疗的组中分析样品, 一旦到达实验室就不进行任何预处理。
    3. 亚文化系一种v. 副溶血性 ATCC 17802 的菌株 (3% NaCl)。通过在 CA 上适当稀释 (3% NaCl), 确定接种中可行细胞的水平, 以获得接种 104 CFU mL-1 v. 副溶血性。在冷凝水中清洗每一个蛤, 然后在层流柜中使用无菌钳将其从外壳中取出, 然后将其擦洗干净。
    4. 六十年代, 在90毫升无菌的融汇 (3% NaCl) 中, 对10克的蛤皮组织样品进行了测定. 将已知量的v. 副溶血性添加到9毫升的匀质样品汤中。将 unspiked 示例用作负控制。估计v. 副溶血性的细胞计数通过电镀0.1 毫升样品在 CA, 并且随后, 吹打1毫升样品入离心管为脱氧核糖核酸样品提取, 将被使用在生物传感器和 PCR 试验。
    5. 在经过改良的煮沸裂解过程36后从尖刺和 unspiked 样品中提取出v. 副溶血性的基因组 DNA。最后, 确定 DNA 浓度和纯度的生物光度测量与紫外线吸收在波长 260 nm (作为核酸吸收波长的光), 也在波长 280 nm (作为蛋白质吸收波长的光)。

结果

通过柠檬酸钠的水溶液的颜色变化, 揭示了 AuNPs 的形成。这使颜色从淡黄色变为深宝石红色。从紫外可见光谱 (图 1) 中证实了 PLA-AuNPs 的产生, 其中表面等离子体共振 (SPR) 峰值的增长约为 540 nm。AuNPs 的形成和存在是在 500-600 nm 波长范围内, 这取决于粒子大小37。AuNPs 和 PLA-AuNPs 的 XRD 模式显示在图 2中。在31.7、38...

讨论

这类电化学生物传感器成功发展的框架中的关键步骤是为传感器 (核酸或 DNA) 选择合适的生物识别元件;构造传感器传感层的化学方法转导材料;DNA 固定化与杂交的优化研究并通过实际样品对所研制的生物传感器进行验证。

核心到成功开发的敏感和选择性电化学 DNA 生物传感器, 是优化的固定化和杂交条件。在这项工作中, 我们用 MB 作为氧化还原络合物。有多种原则的 mb DNA 相互...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

作者希望感谢马来西亚马来西亚的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidMerck100056
ChloroformMerck102445
Diaminoethane tetraacetic acidPromegaE5134
Dibasic sodium phosphate Sigma-AldrichS9763
Disodium hydrogen phosphateSigma-Aldrich255793
Ethanol Sigma-Aldrich16368
Gold (III) chloride trihydrateSigma-Aldrich520918
Hydrochloric acidMerck100317
Methylene blueSigma-AldrichM44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrateSigma-AldrichS3522
Phosphate-buffered salineSigma-AldrichP5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042DNatureWorks4042D
Potassium chlorideR&M Chemicals59435
Potassium dihydrogen phosphateSigma-AldrichP9791
Potassium hexacyanoferrate IIIR&M Chemicals208019
Sodium acetate anhydrous saltSigma-AldrichS2889
Sodium chlorideSigma-AldrichS9888
Trisodium citrateSigma-AldrichS1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethaneFisher ScientificT395-100
Tris-BaseFisher ScientificBP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-DyeNorgen Biotek28240
Agarose gelMerck101236
Bolton AgarMerck100079
Bolton BrothMerck100079
CHROMagar VibrioCHROMagarVB910
dNTPsPromegaU1511
Nuclease-free waterThermo ScientificR0581
Eosin methylene blue agar Merck101347
GelRedBiotium41001
GlycerolMerck104092
Go Taq BufferPromegaM7911
Loading dye 100 bp DNA ladderPromegaG2101
Loading dye 1kb DNA ladderPromegaG5711
Magnesium chloridePromega91176
Mannitol egg yolk polymyxin agarMerck105267
McConkey AgarMerck105465
Nutrient BrothMerck105443
Taq polymeraseMerck71003
Trypticase Soy BrothMerck105459
Trypticase Soy AgarMerck105458

参考文献

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