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Resumo

Um protocolo para o desenvolvimento de um biosensor eletroquímico de DNA composta por um eletrodo de carbono ácido-estável, ouro de nanopartículas-modificado, serigrafado polilático para detectar o Vibrio parahaemolyticus é apresentado.

Resumo

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) é um patógeno comum de intoxicação alimentar que contribui para uma grande parte dos problemas de saúde pública no mundo, afetando significativamente a taxa de morbidade e mortalidade humana. Métodos convencionais para a detecção de V. parahaemolyticus como métodos baseados em cultura, testes imunológicos e moleculares com base em métodos requerem manipulação de amostra complicado e são caro, demorado e tedioso. Recentemente, biosensores tem provado para ser um método de deteção promissora e abrangente com as vantagens da detecção rápida, custo-efetividade e praticidade. Esta pesquisa se concentra no desenvolvimento de um método rápido de detectar V. parahaemolyticus com alta seletividade e sensibilidade usando os princípios de hibridização de DNA. No trabalho, caracterização de nanopartículas ouro sintetizado polilático ácido-estabilizado (PLA-AuNPs) foi conseguida usando a difração de raios x (XRD), espectroscopia de ultravioleta-visível (UV-Vis), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), de emissão de campo Microscopia eletrônica (FESEM) e voltametria cíclica (CV). Também realizamos ensaios de estabilidade, sensibilidade e reprodutibilidade do PLA-AuNPs. Nós achamos que o PLA-AuNPs formou uma estrutura sólida de nanopartículas estabilizadas em solução aquosa. Observou-se também que a sensibilidade melhorada como resultado o valor de resistência (Rct) de transferência de carga menor e um aumento da área de superfície ativa (0,41 cm2). O desenvolvimento da nossa biosensor DNA baseou-se na modificação de um eletrodo de carbono serigrafado (SPCE) com PLA-AuNPs e usando azul de metileno (MB) como indicador redox. Foram avaliados os eventos de imobilização e hibridação por voltametria de pulso diferencial (DPV). Descobrimos que complementar, não-complementares, e oligonucleotides incompatíveis especificamente foram distinguidos pelo biosensor fabricado. Também mostrou que confiantemente sensível deteção em estudos de reatividade cruzada contra vários patógenos de origem alimentar e na identificação de V. parahaemolyticus em berbigões frescos.

Introdução

Um importante tópico de debate público e científico nos últimos anos, a intoxicação alimentar é principalmente associada com 3 agentes: microorganismos1, produtos químicos2e parasitas3. Alimentos contaminados podem causar consequências graves para a saúde nos seres humanos, especialmente no grupo de risco mais elevado das pessoas com fraco sistema imunológico, a mulheres grávidas, idosas, bebês e crianças pequenas4. Com mais de 1 milhão de casos de diarreia aguda, ocorrendo anualmente em crianças menores de 5 anos de idade na África, Ásia e América Latina, a intoxicação alimentar é das principais doenças global5,6 e estabeleceu-se a Organização Mundial da saúde microorganismos como o mais importante contribuinte7. Vibrio parahaemolyticus destaca-se entre as cepas virulentas mais amplamente reconhecidas. Geralmente encontrado em ambientes costeiros, estuarinos e marinhos8, é uma bactéria Gram-negativa, que se torna ativo em ambientes de sal elevados e provoca grave gastroenterite humana quando comidos em marine inadequadamente cozida, maltratado ou cru produtos9. Além disso, condições médicas existentes em algumas pessoas tornem propenso a ferida infecção, septicemia ou orelha infecção decorrentes de V. parahaemolyticus10. Os fatores de virulência de V. parahaemolyticus hemolisinas são divididos em dois tipos, que contribuem para a patogênese da doença: thermostable hemolisina directa (TDH) codificadas por genes tdh e hemolisina TDH-relacionados, codificadas por genes de trh11. Os marcadores de virulência (genes tdh e trh) de V. parahaemolyticus são normalmente encontrados em amostras clínicas em vez de amostras ambientais.

V. parahaemolyticus possui a habilidade de sobreviver em uma ampla gama de condições, responder rapidamente às mudanças ambientais12. Seu mecanismo de proliferação se agrava seu potencial de risco à medida que sua toxicidade aumenta em paralelo com a célula em massa13. Pior ainda, mudança climática está fornecendo estas bactérias com amplas condições para acelerar sua de crescimento de população celular14. Devido à sua alta frequência, V. parahaemolyticus necessita de ser acompanhada ao longo da cadeia de abastecimento alimentar, particularmente no comércio e na produção de frutos do mar, desde que esses produtos sejam onde eles são encontrados em quantidades enormes de15,16 em todo o mundo. Atualmente, as bactérias são identificadas e isolados, usando uma variedade de métodos, incluindo testes bioquímicos, enriquecimento e meios selectivos17, enzima-lig Fima adsorvente do ensaio (ELISA)18, eletroforese em gel de pulso-campo (PFGE) 19, testes de aglutinação de látex e de testes de reação em cadeia (PCR) polimerase20. Esses métodos normalmente requerem pessoal qualificado, instrumentos sofisticados e técnicas laboriosas que não fornecem informações sobre contaminação imediatamente. Isto limita severamente a probabilidade de detectar prontamente contaminação prejudicial e aplicações no local. Ferramentas de detecção rápida permanecem um desafio excepcional.

Biosensing está emergindo como uma opção promissora para a detecção de agentes patogénicos de origem alimentar, porque oferece uma economia de tempo, econômico, prático e em tempo real de análise método21,22,23,24 . No entanto, embora tenha havido muitos resultados positivos de detecção de analito em amostras cravadas e solução padrão usando biosensores, ainda há uma falta de pesquisa aplicada a amostras reais em misturas aquosas ou extractos orgânicos25. Recentemente, biosensores eletroquímicos detecção direta ou indireta de Ácido desoxirribonucleico (DNA) têm recebido atenção crescente entre os cientistas, devido a sua detecção específica do alvo complementar através de uma hibridização evento26 , 27 , 28 , 29. essas abordagens únicas são mais estáveis em comparação com biossensores enzimáticos, oferecendo assim uma tecnologia promissora para a miniaturização e comercialização. O alvo do estudo relatado aqui é construir uma ferramenta rápida que pode detectar V. parahaemolyticus com alta seletividade, sensibilidade e praticidade, baseada-se a especificidade de sequência de DNA durante a hibridação. Estratégias de identificação envolvem a combinação de polilático nanopartículas de ouro ácido-estabilizado (PLA-AuNPs)30 e os elétrodos do carbono serigrafado (SPCEs) na presença do indicador de hibridação, azul de metileno (MB). O potencial de construção de deteção desenvolvidos é mais explorado usando amostras de berbigão fresco e lisado de DNA de bactérias.

Protocolo

Nota: Todos os reagentes químicos e bioquímicos para ser usado devem ser de qualidade analítica e usado sem mais purificação. Prepare todas as soluções usando água deionizada estéril. Autoclave todos os produtos vidreiros antes da esterilização.

Atenção: Por favor, use todas as práticas de segurança adequadas ao realizar atividades de laboratório, incluindo o uso de controles (coifa, porta-luvas) de engenharia e equipamentos de proteção individual (óculos de segurança, luvas, jaleco, calça comprida, fechados sapatos).

1. fabricação e caracterização de modificado eletrodo usando PLA-AuNPs

  1. Preparação e caracterização de PLA-AuNPs
    1. Rapidamente, adicionar 10 mL de solução de citrato de sódio (38,8 mM) para 100 mL de solução de Ácido cloroáurico aquosa (1 mM) a ferver e esfriar até a temperatura ambiente. Observe as alterações na cor da solução de AuNPs preparado, que começa como amarelo, alterações enegrecido e finalmente termina como vermelho rubi escuro.
    2. Coloque as bolinhas PLA em um molde de aço inoxidável para o processo de fusão e pré-aqueça-os a uma temperatura de 190 ° C por 10 min. siga com o procedimento de prensagem: colocá-los sob uma pressão de 2,2 MPa para 1 min como parte da preparação de folha PLA. A folha PLA estará pronta para uso após arrefecimento para cerca de 3 h.
    3. Mexendo vigorosamente, dissolva 0,68 mg das folhas de PLA em 5 mL de clorofórmio à temperatura ambiente. Misture o PLA dissolvido com 10 mL da solução de AuNPs previamente preparada e homogênea, misture-o à temperatura ambiente. As misturas homogéneas podem então ser denotadas como PLA-AuNPs e caracteriza-se usando o UV-Vis, XRD, temperatura e FESEM com EDX.
  2. Preparação e caracterização de eletrodos modificados carbono serigrafado
    Nota: A SPCE utilizado neste estudo é composto por um sistema do três-elétrodo: um contador elétrodo, um carbono trabalho e um eletrodo de referência Ag/AgCl.
    1. Rapidamente, Pipetar 25 µ l da solução homogênea de PLA-AuNPs para a SPCE e, em seguida, ar secá-la por 24 h antes da utilização.
    2. Eletroquimicamente caracterizam os eletrodos modificados, SPCE/PLA-AuNPs, em cianeto de potássio ferro (K3[Fe(CN)6]-3/4 -) para medir a área de superfície ativa, espectroscopia de impedância eletroquímica, repetibilidade, reprodutibilidade e estabilidade30.

2. desenvolvimento do Biosensor eletroquímico DNA

  1. Preparação de sonda
    Nota: As sequências do DNA complementar e ssDNA sonda foram escolhidas com base na informação do centro nacional para o banco de dados Biotechnology Information (NCBI).
    1. Compra oligonucleotides sintéticos (20-mer ssDNA sonda, DNA complementar mer-20, 20-mer incompatível DNA e DNA não-complementar 21-mer) como pó liofilizado de laboratórios comerciais, com base na seguintes sequências:
      thiolated ssDNA sonda: 5 ' - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3 '
      DNA complementar: 3 ' 5 ' - CAGTGCTTCTGCATAATCCG -
      um-base DNA incompatível: 3 ' 5 ' - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG -
      três bases DNA incompatível: 3 ' 5 ' - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG -
      DNA não-complementar: 3 ' 5 ' - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA -
    2. Prepare as soluções de todos os oligonucleotides (100 µM) usando uma solução estéril e TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), dividida em parcelas analíticas. Manter a-4 ° C e então fazer as diluições apropriadas apenas antes de usar.
  2. Otimização de imobilização e hibridação
    Nota: Um SPCE modificado com PLA-AuNPs, denotado como SPCE/PLA-AuNPs, foi usado para este estudo e um método de fundição gota foi usado para a imobilização de DNA e a hibridação.
    1. Primeiro, imobilizar 25 µ l de thiolated ssDNA sonda sobre a SPCE/PLA-AuNPs e então ar secar por 24 horas à temperatura ambiente, depois que ele vai ser finalmente denotado como SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. Determinar a otimização da condição imobilização por meio de três fatores: a concentração do ssDNA (variando de 0,2 a 1,4 µM), tempo (variando de 30 a 210 min) e temperatura (variando de 25 a 75 ° C).
    2. Pipete 25 µ l do DNA complementar sobre a superfície da SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA para realizar o evento de hibridação, após o qual pode ser finalmente denotada como SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Determine a otimização da condição da hibridação através de dois fatores de tempo (variando de 5 a 30 min) e temperatura (variando de 25 a 75 ° C).
    3. Mergulhe o imobilizado e eletrodos hibridizados em 20 µM MB por 30 min. remover o DNA não-especificamente adsorvido e excesso MB por lavagem com 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4.5) e em seguida enxaguar com água desionizada. Medida da corrente de pico de redução MB usando a técnica DPV. Executar a medição de DPV usando PBS 0,1 M (pH 7) não contendo nenhum indicador.
  3. Caracterização do biosensor DNA fabricado
    1. Mergulhe a SPCE/PLA-AuNPs em µM de 20 MB por 30 min, lavar com 0,5 M de ABS/20 mM NaCl (pH 4.5) e em seguida enxaguar com água desionizada antes da medição. Segui um procedimento semelhante para todas as interações, incluindo a sonda DNA, DNA complementar, DNA incompatível e amostras de DNA não-complementares.
    2. Medir a redução eletroquímica.
      Nota: Nós medimos DPV usando um Autolab comercialmente fabricado com software de interface.
      As medições de DPV da redução eletroquímica MB realizada em um potencial que varia de -0,5 V a 0,25 V, com um potencial de passo de 0.005 V, amplitude de modulação de 0,05 V e uma taxa de varredura de 7,73 mVs-1 em PBS 0,1 M (pH 7), não contendo nenhum indicador. A seletividade, sensibilidade, reprodutibilidade e estabilidade térmica do biosensor DNA fabricado foram mais estudados. Resultados relatados foram apresentados como média de valor de medições em três repetições.

3. validação do Biosensor DNA fabricado usando amostras reais

  1. Preparação de cepas bacterianas
    1. Selecione amostras bacterianas baseadas sua contaminação significativa de frutos do mar31,32 .
      Nota: V. parahaemolyticus como cepas de referência e 8 outras estirpes bacterianas (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, enterite de Salmonella, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli O157: H7, Bacillus cereuse Vibrio alginolyticus) da origem alimentar comum patógeno foram empregados para a validação de biosensor eletroquímica do DNA neste estudo.
    2. Realizar uma rotina sub-cultura de estirpes bacterianas em seu respectivo agar quinzenalmente para manter a sua viabilidade, consulte a tabela 1 para condições de cultura.
    3. Manter a preservação a longo prazo das cepas bacterianas em seus respectivos caldos crescentes contendo 20% (v/v) glicerol a-80 ° C, como glicerol protege bactérias, impedindo a formação de cristais de gelo que podem danificá-los durante o processo de congelamento. Em seguida, inocule um loop da cultura de pilha bacteriana conservados em estoque de glicerol para os respectivos caldos. Incube os caldos de acordo com seu respectivo crescimento tempo e temperatura, quando precisar de reviver as bactérias.
    4. Determine a quantidade de V. parahaemolyticus células usando uma placa de expansão técnica33, um padrão e um método conhecido para enumerar derivados de uma série de diluições de microorganismos.
      1. Cultura V. parahaemolyticus trypcase soja caldo (TSB + 3% NaCl) a 37 ° C, num estado de agitação 140-rpm. Em seguida, transferir 1 mL de cultura de células de bactérias para 9ml de TSB + 3% NaCl para obter um fator de diluição 10-1 .
    5. Repita essa etapa nove vezes para obter uma série completa de factor de diluição até 10-10 . Em seguida, espalhe 0,1 mL de cada fator de diluição (a partir de 10-1 a 10-10) na placa de ágar seletivo do Vibrio uma colônia contando, respectivamente. Incube as placas incubadas a 37 ° C por 24 h.
    6. Use um contador de colônia para contagem das colónias individuais e depois volta-calcular (contagem a quantidade CFU/pipetado x fator de diluição) para obter uma unidade formadoras de colônia por mililitro densidade (CFU mL-1). Derive a concentração da colônia formando unidades (CFUs) nas suspensões celulares de bactérias do terreno de calibração do UFC mL-1 contra absorvância.
  2. Preparação do ensaio do PCR
    1. Extrair DNA genômico seguindo uma modificada fervido lise procedimento34. Primeira, raia uma bacterianas individuais Coe em meios de ágar e inoculá-lo na mídia de caldo, seguida por incubando-lo em sua condição de crescimento relativo, um 140 rpm tremendo condição.
    2. Pipete uma cultura de 1 mL de caldo de carne para um tubo de centrífuga de micro. Centrifugar-isto a 4830 x g e 4 ° C, durante 1 min obter Pelotas. Use cerca de 500 µ l de tampão estéril de TE para re-suspensão com a pelota. Segure a suspensão resultante durante 10 minutos no 98 ± 2 ° C em um bloco de aquecimento e chill-lo imediatamente a-18 ° C por 10 min lisar as células e liberar o DNA.
    3. Centrifugar o DNA genômico a 4830 x g e 4 ° C por 3 min obter uma suspensão clara e manter o sobrenadante a-20 ° C para utilização posterior. Use uma medida de biophotometer com absorção de UV no comprimento de onda de 260 nm (como os ácidos nucleicos absorver comprimento de onda de luz) e também no comprimento de onda de 280 nm (como as proteínas de absorção de luz de comprimento de onda) para determinar a concentração e pureza do extraído DNA genômico e então identificar todas as estirpes utilizando ensaios bioquímicos padrão35 e verificá-los por 16S rRNA gene sequenciamento36. Finalmente, desnaturar o DNA genômico a 92 ° C por 2 min e resfriá-lo rapidamente em água gelada antes da aplicação para o biosensor.
    4. Confirmar a presença de V. parahaemolyticus usando PCR para o gene toxR-alvo. Execute esse procedimento em um thermocycler usando um par de primer (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' e 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). Otimize a amplificação por PCR em um volume total de reação de 25 μL, consistindo de água esterilizada (15,5 µ l), tampão (5 µ l), primeira demão (1 µ l, 10 µM), dNTP mix (1 µ l), modelo de DNA (2 µ l) e Taq DNA polimerase (0,2 µ l, 10x).
    5. Misture os componentes bem e organizar a amplificação por PCR da sequência de destino em um thermocycler programado para 30 ciclos de amplificação. Em nosso estudo, cada ciclo consistiu em três etapas de reações , ou seja,., desnaturação inicial (94 ° C, 3 min), seguido de 30 ciclos de desnaturação (94 ° C, 1 min), recozimento (63 ° C, 1,5 min) e extensão (72 ° C, 1,5 min), seguido pela extensão final (72 ° C, 7 min).
    6. Determine os produtos amplificados e seus tamanhos através de electroforese em gel de agarose 1,5%. Capture as imagens de gel com um sistema de gel-documentação produzidos comercialmente.
  3. Preparação de amostras de berbigão
    1. Obter amostras frescas.
      Nota: Nosso berbigão fresco (Anadara granosa) foram obtido a partir do mercado molhado em Serdang, Selangor e rapidamente trazido para o laboratório em uma caixa de gelo mais fresca para análise. Divida as amostras em 2 grupos, ou seja, o grupo tratado e não tratado, assumindo que o berbigão foram colhida uniformemente desde o início da safra até colocá-los em armazenamento frio.
    2. Pré-tratamento berbigão no grupo tratado, armazenando-os em-20 ° C por 24 h, seguido de exposição à luz UV, a 20 ° C, por 4h antes da extração de DNA.
      Nota: A temperatura de congelamento e exposição aos raios UV, usado para a controlada grupo mata ou pelo menos limita a naturalmente acumular V. parahaemolyticus nas amêijoas. Não aplica um regime mais elevado de pasteurização de 70 ° C como o objetivo da condição controlada neste estudo é imitar a situação real das amêijoas frescas. Entretanto, analise amostras diretamente do grupo não tratado sem qualquer tratamento prévio, assim que eles chegam no laboratório.
    3. Subcultura de uma estirpe de V. parahaemolyticus ATCC 17802 em TSB (3% NaCl). Determinar o nível de células viáveis em inóculo através de chapeamento de diluições apropriadas de TSB (3% NaCl) na CA a fim de obter um inóculo de 104 UFC mL-1 de V. parahaemolyticus. Lavar cada berbigão em água destilada e esfrega-lo livre de sujeira antes de usar a pinça estéril em um fluxo laminar para remover os tecidos da casca.
    4. Homogeneizar a cerca de 10 g de amostras de tecido de berbigão com um homogeneizador em 90 mL de TSB estéril (3% NaCl) por 60 s. adicionar uma quantidade conhecida de V. parahaemolyticus para 9 mL do caldo para as amostras cravados de amostra homogeneizada. Use as amostras bilirrrubina como controlo negativo. Estimar a contagem de células de V. parahaemolyticus cravado para as amostras de berbigão por chapeamento 0,1 mL das amostras na CA, e posteriormente, Pipetar 1 mL de amostras em um tubo de microcentrifugadora de DNA da amostra extração, para ser usado na biosensor e ensaio PCR.
    5. Extrai o DNA genômico do V. parahaemolyticus das amostras cravadas e bilirrrubina seguindo um modificado de fervido lise procedimento36. Finalmente, determinar a concentração de DNA e pureza, usando uma medição do Fotômetro de bio com absorção UV no comprimento de onda de 260 nm (como os ácidos nucleicos absorver comprimento de onda de luz) e também no comprimento de onda de 280 nm (como as comprimento de onda de absorção de proteínas).

Resultados

Formação de AuNPs foi revelada através da mudança na cor da solução aquosa com citrato de sódio presente. Isto causou a cor mudar de amarelo claro para um vermelho rubi profundo. A geração de PLA-AuNPs foi confirmada de espectros de UV-vis (Figura 1), onde o crescimento do pico de ressonância (SPR) do plasmon de superfície foi encontrado a cerca de 540 nm. A formação e a existência de PLA-AuNPs foi indicado em intervalos de comprimento de onda 5...

Discussão

Os passos críticos em um quadro para o desenvolvimento bem sucedido deste tipo de biosensor eletroquímico são a seleção de elementos de reconhecimento biológico adequado para o transdutor (ácido nucleico ou DNA aqui); abordagem de química para a construção de camada de sensoriamento do transdutor; material de transdução; otimização de imobilização de DNA e hibridação; e validação do biosensor desenvolvido usando amostras reais.

Núcleo para o desenvolvimento bem sucedido de...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostaria de agradecer o apoio da Universiti Putra Malaysia.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidMerck100056
ChloroformMerck102445
Diaminoethane tetraacetic acidPromegaE5134
Dibasic sodium phosphate Sigma-AldrichS9763
Disodium hydrogen phosphateSigma-Aldrich255793
Ethanol Sigma-Aldrich16368
Gold (III) chloride trihydrateSigma-Aldrich520918
Hydrochloric acidMerck100317
Methylene blueSigma-AldrichM44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrateSigma-AldrichS3522
Phosphate-buffered salineSigma-AldrichP5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042DNatureWorks4042D
Potassium chlorideR&M Chemicals59435
Potassium dihydrogen phosphateSigma-AldrichP9791
Potassium hexacyanoferrate IIIR&M Chemicals208019
Sodium acetate anhydrous saltSigma-AldrichS2889
Sodium chlorideSigma-AldrichS9888
Trisodium citrateSigma-AldrichS1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethaneFisher ScientificT395-100
Tris-BaseFisher ScientificBP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-DyeNorgen Biotek28240
Agarose gelMerck101236
Bolton AgarMerck100079
Bolton BrothMerck100079
CHROMagar VibrioCHROMagarVB910
dNTPsPromegaU1511
Nuclease-free waterThermo ScientificR0581
Eosin methylene blue agar Merck101347
GelRedBiotium41001
GlycerolMerck104092
Go Taq BufferPromegaM7911
Loading dye 100 bp DNA ladderPromegaG2101
Loading dye 1kb DNA ladderPromegaG5711
Magnesium chloridePromega91176
Mannitol egg yolk polymyxin agarMerck105267
McConkey AgarMerck105465
Nutrient BrothMerck105443
Taq polymeraseMerck71003
Trypticase Soy BrothMerck105459
Trypticase Soy AgarMerck105458

Referências

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