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요약

브리 parahaemolyticus 감지 polylactic 산 안정, 금 나노 입자 수정, 모티브로 탄소 전극으로 구성 된 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

초록

(대 parahaemolyticus) 브리 parahaemolyticus 크게 인간의 사망률과 질병 률의 속도 영향을 미치는 보건 문제의 큰 비율에 세계적으로, 기여 일반적인 foodborne 병원 체 이다. 문화 기반 방법, 면역학 분석 실험, 분자 기반 방법 등 parahaemolyticus 대 의 검출을 위한 일반적인 방법 복잡 한 샘플 처리를 요구 하 고, 지루한, 시간과 비용이 많이 드는 있습니다. 최근, 바이오 센서는 빠른 검색, 비용 효율성, 실용성의 장점으로 유망 하 고 포괄적인 탐지 방법으로 입증 했습니다. 이 연구는 높은 선택도 및 DNA 교 잡의 원리를 사용 하 여 감도 parahaemolyticus 대 감지 하는 빠른 방법 개발에 중점을 둡니다. 작업, 합성된 polylactic 산 안정 금 나노 입자 (PLA-AuNPs)의 x 선 회절 (XRD), 자외선 보이는 분광학 (UV-Vi), 전송 전자 현미경 (TEM), 필드-방출을 사용 하 여 달성 되었다 스캐닝 전자 현미경 검사 법 (FESEM), 그리고 주기적 Voltammetry (CV). 우리는 또한 추가 안정성, 감도, 및 PLA AuNPs의 재현성의 테스트 실시. 우리는 PLA AuNPs 수성 해결책에서 안정 된 나노 입자의 소리 구조 형성을 발견. 우리는 또한 감도 작은 충전 전송 저항 (Rct) 값과 활성 표면적 (0.41 c m2)의 증가 결과로 향상 된 관찰. 우리의 DNA 바이오 센서의 개발은 PLA AuNPs와 redox 표시기로 메 틸 렌 블루 (MB)를 사용 하 여 모티브로 탄소 전극 (SPCE)의 수정에 근거 했다. 우리는 차동 펄스 voltammetry (DPV)에 의해 동원 정지 및 교 잡 이벤트를 평가. 보완, 보완, 우리 그를 발견 하 고 일치 하지 않는 oligonucleotides 특별히 조작된 바이오 센서에 의해 수훈이 있었다. 그것은 또한 다양 한 식품을 매개로 병원 체에 대 한 분 연구 하 고 신선한 cockles parahaemolyticus 대 의 식별에 안정적으로 민감한 탐지를 보여주었다.

서문

최근 몇 년 동안에서 공공 및 과학적인 논쟁의 주요 주제, 식중독은 주로 3 에이전트와 관련 된: 미생물1, 화학2및 기생충3. 오염 된 음식 인간, 약한 면역 체계, 노인, 임신 여성, 아기, 그리고 어린 아이4에 그들의 더 높은 위험 그룹에서 특히 심각한 건강 결과 일으킬 수 있습니다. 아프리카, 아시아 및 라틴 아메리카에서 5 세 미만의 어린이에서 매년 발생 하는 급성 설사의 경우에 이상 백만, 식중독 주요 글로벌 질병5,6 와 세계 보건 기구 설립 7가장 중요 한 기여자 서의 미생물 비 브리 오 parahaemolyticus 가장 널리 인정 된 악성 종자 들 눈에 띈다. 그램 음성 박테리아는 높은 소금 환경에서 활성화 되 고 부적당 하 게 요리, 분실 또는 원시 해양에 먹을 때 심각한 인간의 위장염은 일반적으로 해안, 강어귀, 및 해양 환경8에서 발견, 제품9. 또한, 기존의 의료 조건을 어떤 사람들 그들을 상처 감염, 패 혈 증 또는 귀 감염 parahaemolyticus 대10에서 발생 하는 경향이 확인. Parahaemolyticus 대 hemolysins의 독성 요인 질병 병 인에 기여 하는 2 가지의 유형으로 분할 된다: 내 직접 hemolysin (TDH) tdh 유전자에 의해 코딩 및 TDH 관련 hemolysin trh 유전자11에 의해. V. parahaemolyticus 의 독성 마커 (tdh와 trh 유전자)는 주로 환경 표본 보다 임상 표본에서 발견 됩니다.

Parahaemolyticus 대 보유 하 고 광범위 한 조건에서 살아남을 수 신속 하 게 환경 변화12응답. 그것의 확산 메커니즘의 독성 세포 대량13와 병렬로 증가 위험 잠재력을 에스컬레이션 합니다. 심지어 최악의 경우, 기후 변화 이러한 박테리아 그들의 세포 인구 성장14를 가속 화 하기 위해 충분 한 조건을 제공 합니다. 그것의 높은 주파수로 인해 parahaemolyticus 대 감시 될 필요가 식품 공급망의 무역 및 해산물 제품 이기 때문에 그들은 거 대 한 수량15,16 에서 발견의 생산에서 특히 따라 통해 세계. 현재 박테리아 식별 및 생화학 테스트, 농축 및 선택적 미디어17, 매 효소 연결 된 immunomagnetic를 포함 하 여 방법의 범위를 사용 하 여 절연 시험 (ELISA)18, 펄스 분야 젤 전기 이동 법 (PFGE) 19, 라텍스 교착 테스트, 그리고 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 시험20. 이러한 메서드는 일반적으로 자격 갖춘된 직원, 정교한 계기 및 힘 드는 기법을 즉시에 오염에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다 필요 합니다. 이 심각 하 게 유해한 오염 및 현장 응용 프로그램을 신속 하 게 감지 가능성을 제한 합니다. 빠른 검색 도구는 뛰어난 도전 남아 있습니다.

시간 절약, 비용 효과적인, 실용적인, 그리고 실시간 분석 방법21,,2223,24 제공 하기 때문에 바이오 센 싱은 foodborne 병원 체의 검출을 위한 유망 옵션으로 나오고 . 그러나, 비록 아군된 샘플 및 바이오 센서를 사용 하 여 표준 솔루션 분석 탐지의 많은 긍정적인 결과 왔다, 있다 아직 수성 혼합물 또는 유기농 추출 물25실제 샘플에 적용 하는 연구의 부족. 최근에, 직접 및 간접 deoxyribonucleic 산 (DNA) 탐지를 사용 하 여 전기 화학 바이오 센서 교 잡 이벤트26 를 통해 보완 대상의 그들의 특정 탐지 때문에 과학자 들 사이에서 증가 관심 받은 , 27 , 28 , 29. 이러한 독특한 접근은 소형화 및 상용화 유망 기술에 따라서 제공 하 고, 효소 기반 바이오 센서에 비해 더 안정. 연구의 대상 보고 여기 parahaemolyticus 대 높은 선택도, 민감도, 실용성, 교 잡 동안 DNA 순서 특이성에 따라 검색할 수 있는 빠른 도구를 생성 하는. 식별 전략 교 잡 표시기, 메 틸 렌 블루 (MB)의 존재 polylactic 산 안정 금 나노 입자 (PLA-AuNPs)30 및 모티브로 탄소 전극 (SPCEs)의 조합을 포함 한다. 개발 된 탐지 구성의 잠재력 추가 박테리아 DNA lysate와 신선한 코 클 샘플을 사용 하 여 탐구 된다.

프로토콜

참고: 모든는 화학과 생 화 확 적인 시 약 사용 될 분석 등급의 고 추가 정화 없이 사용. 살 균 이온된 수를 사용 하 여 모든 솔루션을 준비 합니다. 오토 클레이 브 살 균 전에 모든 유리.

주의: 사용 하십시오 모든 적절 한 안전 관행 공학적 통제 (연기 후드, 글러브)의 사용을 포함 하 여 실험실 활동을 수행할 때 및 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 외 투, 전체 길이 바지, 폐쇄 발가락 신발)입니다.

1. 제조 및 특성의 수정 전극 PLA AuNPs를 사용 하 여

  1. 준비 및 PLA AuNPs의 특성화
    1. 빨리 끓는 수성 chloroauric 산 성 솔루션 (1 mM) 100 mL를 나트륨 구 연산 염 해결책 (38.8 m m)의 10 mL를 추가 하 고 주위 온도 아래로 냉각. 준비 된 AuNPs 솔루션는 노란색, 거 무스 름 한 변경으로 시작 되 고 마지막으로 어두운 루비 빨간색으로 끝나는 색상의 변화를 관찰 합니다.
    2. PLA 펠 릿 용 해 공정에 대 한 스테인레스 스틸 몰드에 놓고 10 분 따라 눌러 절차와 190 ° C의 온도에 그들을 예 열: PLA 시트 준비의 일환으로 1 분에 대 한 2.2 MPa의 압력에서 그들을 넣어. PLA 시트는 약 3 시간 냉각 후 사용 하기 위해 준비가 될 것입니다.
    3. 적극적으로 교 반, 실 온에서 클로 프롬의 5 mL에 PLA 시트의 0.68 mg 분해. 이전 준비 AuNPs 솔루션의 10 mL와 함께 녹아 PLA를 혼합 하 고 균질 실내 온도에 그것을 저 어. 균질 혼합물 다음 PLA AuNPs로 표시 될 수 있습니다 하 고 UV-마주, XRD, TEM, 및 FESEM EDX에 사용 특징.
  2. 준비 및 수정된 모티브로 탄소 전극의 특성
    참고:이 연구에 사용 된 SPCE 구성 3 전극 시스템: 카운터 전극, 탄소 작업 전극과 Ag/AgCl 기준 전극.
    1. 빠르게 SPCE 그리고 공기에 PLA AuNPs의 동질적인 솔루션의 피 펫 25 µ L 24 h 사용 전에 건조.
    2. 수정 된 전극의 화학적 특성 SPCE/PLA-AuNPs, 칼륨 페로 시안 화물에 (K3[Fe(CN)6]3/4-) 활성 표면적, 전기 화학 임피던스 분광학, 반복성, 측정 하 재현성, 고 안정성30.

2입니다. 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발

  1. 조사 준비
    참고: ssDNA 프로브 및 보완 DNA 시퀀스는 생물 공학 정보 (NCBI) 데이터베이스에 대 한 국립 센터에서 정보에 따라 선정 됐다.
    1. 다음 시퀀스에 따라 상업 실험실에서 동결 건조 된 분말 합성 oligonucleotides (20-메 르 ssDNA 프로브, 20-메 르 보완 DNA, 20-메 르 일치 하지 않는 DNA와 21-메 르 비 보완 DNA)를 구입:
      thiolated ssDNA 프로브: 5 '-/ 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG-3
      보완 DNA: 5 '-CAGTGCTTCTGCATAATCCG-3
      한 기반 일치 하지 않는 DNA: 5-CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG-' 3 '
      3 자료 일치 하지 않는 DNA: 5-CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG-' 3 '
      비 보완 DNA: 5 '-CGCACAAGGCTCGACGGCTGA-3
    2. 솔루션을 사용 하는 살 균 테 (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), 분석 부분으로 나누어 모든 oligonucleotides (100 µ M)의 재고 솔루션을 준비 합니다. -4 ° C에 보관 한 다음 적절 한 희석 그냥 사용 하기 전에.
  2. 동원 정지 및 교 잡의 최적화
    참고:는 SPCE PLA AuNPs, SPCE/PLA-AuNPs로 표시로이 연구를 위해 사용 되었다 고 드롭 주조 방법은 DNA 동원 정지 및 교 잡에 대 한 사용 되었다.
    1. 첫째, SPCE/PLA-AuNPs에 thiolated ssDNA 조사의 25 µ L를 무력화 하 고 공기 건조 실 온에서 24 h 이후 그것은 것입니다 수 마지막으로로 표시 SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. 세 가지 요소를 사용 하 여 동원 정지 조건의 최적화를 결정: ssDNA (0.2에서 1.4 µ M에 배열 되는), (에서 30 210 분), 시간 및 온도 (25에서 75 ° C에 배열 되는)의 농도.
    2. SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA 후 그것은 수 수 마지막으로로 표시 SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA 교 잡 이벤트 수행의 표면에 보완 DNA의 25 µ L 플라스틱 (5에서 30 분에 배열 되는) 시간 및 온도 (25에서 75 ° C에 배열 되는)의 두 요소를 통해 교 잡 조건의 최적화를 결정 합니다.
    3. 담가 고정 30 분에 대 한 20 µ M MB에에서 교배 전극을 제거 0.5 m ABS 세척 하 여 비 특히 흡착된 DNA와 초과 MB/20 mM NaCl (pH 4.5)과 다음으로 rinsing 저온. 측정 피크 전류 DPV 기술을 사용 하 여 MB 감소 합니다. DPV 측정 0.1 M PBS (pH 7)를 사용 하 여 실행 없음 표시기를 포함 하.
  3. 조작된 DNA 바이오 센서의 특성
    1. 30 분 동안 20 µ M MB에에서 SPCE/PLA AuNPs를 담가, 0.5 M ABS/20 m m NaCl (pH 4.5), 세척 하 고 이전에 측정 이온을 제거 된 물으로 씻어. 프로브 DNA, 보완 DNA, 일치 하지 않는 DNA 및 비 보완 DNA 샘플을 포함 하 여 모든 상호 작용에 대 한 비슷한 절차를 따릅니다.
    2. 전기 화학 감소를 측정 합니다.
      참고: DPV 인터페이스 소프트웨어와 상업적으로 제조 된 Autolab를 사용 하 여 측정 했습니다.
      0.005 V, 0.05 V의 진폭을 변조 하 고 0.1 M PBS (pH 7)에서 7.73 mVs-1 의 스캔 속도의 잠재적인 단계 V, 0.25-0.5 V에서에서 배열 하는 잠재력에서 MB 전기 화학 감소의 DPV 측정 없음 표시기 포함. 선택도, 감도, 재현성, 및 조작된 DNA 바이오 센서의 열 안정성 더 공부 했다. 보고 결과 3 개의 복제에으로 평균 값 측정을 제시 했다.

3. 실제 샘플을 사용 하 여 조작된 DNA 바이오 센서의 유효성 검사

  1. 세균성 긴장의 준비
    1. 해산물31,32 의 그들의 중요 한 오염에 따라 세균 샘플을 선택 합니다.
      참고: parahaemolyticus V. 참조 긴장 및 다른 8 세균성 긴장 (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, 살 모 넬 라 typhimurium, 살 모 넬 라 장 염, Klebsiella 폐 렴으로 병원 성 대장균 O157:H7, 균 cereus및 비 브리 오 alginolyticus) 일반적인 식중독의 병원 체는이 연구에서 전기 화학 DNA 바이오 센서 유효성 검사에 대 한 고용 했다.
    2. 문화 조건에 대 한 표 1 을 참조 하십시오 그들의 생존을 유지 그들의 각각 agar에 세균성 긴장의 일상적인 하위 문화 2 주마다를 수행 합니다.
    3. 글리세롤 동결 과정에서 그들을 손상 시킬 수 있는 얼음 결정의 형성을 방지 하 여 박테리아를 보호-80 ° C에서 20% (v/v) 글리세롤에 포함 된 그들의 각각 성장 broths에 세균성 긴장의 장기 보존을 유지 합니다. 다음으로, 각각 broths로 글리세롤 주식에 보존 된 세균성 세포 배양의 루프를 예방. 박테리아를 부활 해야 하는 때 그들의 각각 성장 시간과 온도 따라 broths을 품 어.
    4. 희석의 시리즈에서 파생 된 미생물을 열거 하기 위한 확산 플레이트 기술33, 표준 및 잘 알려진 방법을 사용 하 여 parahaemolyticus 대 셀의 수량을 결정 합니다.
      1. Parahaemolyticus V. Trypticase 간장 국물에 문화 (TSB + 3 %NaCl) 140 rpm 진동 상태에서 37 ° C에서. 다음, TSB + 3%의 9 mL에 박테리아 세포 배양의 1ml를 전송 NaCl 10-1 희석 비율을 얻을.
    5. 9 번 10-10 희석 비율의 전체 시리즈를이 단계를 반복 합니다. 다음으로, 식민지 세 고, 각각에 대 한 브리의 선택적 천 배지에 0.1 mL (10-1 에서 10-10에 시작 되는) 각 희석 비율의 확산. 24 h에 대 한 37 ° C에서 incubated 접시를 품 어.
    6. 식민지 카운터를 사용 하 여 개별 식민지를 계산 하 고 다음 다시-수를 계산 (CFU/pipetted 양 희석 요인 x) 밀리 밀도 (CFU mL-1) 당 콜로 니 형성 단위를 얻을 수 있습니다. CFU mL-1 흡 광도 대 한 교정 줄거리에서 박테리아 세포 정지에서 단위 (CFUs)를 형성 하는 식민지의 농도 파생 시킵니다.
  2. PCR 분석 실험의 준비
    1. 삶은 세포 절차34다음 변경 된 게놈 DNA 추출 합니다. 첫 번째, 행진 개별 박테리아 스트레인 agar 미디어에 고 국물 미디어, 그것의 상대 성장 상태, 상태를 떨고 140 rpm에서 잠복기 뒤에 접종
    2. 마이크로 원심 튜브로 국물의 1 mL 문화를 플라스틱. 4830 x g와 펠 릿을 얻기 위해 1 분에 4 ° C에서 원심이. 무 균 테 버퍼의 약 500 µ L를 사용 하 여 펠 릿으로 다시 중단. 98 ± 2 ° C가 열 블록에서에 10 분에 대 한 결과 정지를 누른 즉시 lyse 세포와 DNA를 풀어 10 분-18 ° C에서 그것을 진정.
    3. 4830 x g와 명확한 정지는 상쾌한 추가 사용 하기 위해-20 ° C에서 유지 하는 3 분 4 ° C에서 게놈 DNA를 원심. Biophotometer 측정을 사용 하 여 260의 파장에서 자외선 흡수와 (빛의 파장을 흡수 하는 핵 산)으로 nm 및 280의 파장에 또한 nm (단백질 흡수 하는 빛의 파장)으로 농도 추출의 순도 결정 하 게놈 DNA 다음 표준 생 화 확 적인 분석 실험35 를 사용 하 여 그리고 16S rRNA 유전자 시퀀싱36여 확인 모든 긴장을 식별. 마지막으로 2 분 동안 92 ° C에서 게놈 DNA를 변성 하 고는 바이오 센서에 응용 프로그램 전에 얼음 물에 급속 하 게 냉각.
    4. 더 parahaemolyticus 대 존재 확인 toxR 유전자를 타겟으로 PCR를 사용 하 여. Thermocycler 뇌관 쌍 (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3'와 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3')를 사용 하 여이 절차를 수행 합니다. 메 마른 물 (15.5 µ L), 버퍼 (5 µ L), 뇌관 (1 µ L, 10 µ M), dNTP 믹스 (1 µ L), DNA 템플렛 (2 µ L), 및 Taq DNA 중 합 효소 (0.2 µ L, 10 x)으로 구성 된 25 µ L 양의 총 반응에서 PCR 증폭을 최적화 합니다.
    5. 구성 요소를 잘 믹스 하 고 증폭의 30 주기 위한 프로그램 thermocycler에 대상 시퀀스의 PCR 증폭을 정렬. 우리의 연구에서 각 주기 구성 3 단계 반응 , 즉., 변성 (94 ° C, 1 분), 어 닐 링 (63 ° C, 1.5 분) 및 확장 (72 ° C, 1.5 분), 최종 확장 (72 ° C, 7 분) 뒤의 30 사이클 이어서 초기 변성 (94 ° C, 3 분).
    6. 증폭된 제품 및 그들의 크기에 1.5 %agarose 젤 전기 이동 법을 통해 확인 합니다. 상업적으로 생산된 젤-문서 시스템 젤 이미지를 캡처하십시오.
  3. 코 클 샘플의 준비
    1. 신선한 샘플을 얻습니다.
      참고: 우리의 신선한 새 조개 (Anadara granosa) Serdang, Selangor, 젖은 시장에서 얻은 고 신속 하 게 분석을 위한 아이스 쿨러 상자에 실험실에 가져온. 2 그룹, 즉 치료 및 치료 그룹을 cockles 수확 했다 균일 하 게 추수의 시작에서 냉장으로 배치까지 가정으로 샘플을 나눕니다.
    2. 사전-20 ° C 24 h, 20 ° C 4 h 이전 DNA 추출에서 UV 빛에 노출에 의해 뒤에서 그들을 저장 하 여 대우 그룹 cockles 취급.
      참고: 동결 온도 자외선 노출을 사용 하는 제어에 대 한 그룹 죽이기 또는 적어도 자연스럽 게 축적 parahaemolyticus 대 cockles에 제한. 이 연구에서 제어 상태의 목표 신선한 새 조개의 실제 상황을 모방 하는 70 ° C의 높은 저온 살 균 법 체제를 적용 되지 않습니다. 한편, 그들은 실험실에 도착 하자마자 사전 치료 없이 치료 그룹에서 직접 샘플을 분석 합니다.
    3. Subculture parahaemolyticus 대 17802 TSB에 ATCC의 변형 (3 %NaCl). TSB의 적절 한 희석의 도금을 통해 inoculum 가능한 셀의 수준을 결정 (3 %NaCl) 104 CFU mL-1 parahaemolyticus 대의 inoculum을 얻으려면 CA에. 증류수에 각 코 클 워시와 껍질에서 조직 제거를 층 류 캐비닛에 소독 집게를 사용 하기 전에 흙의 무료 잡 목.
    4. 살 균 TSB의 90 mL에 균질 화기와 약 10 g 코 클 조직 샘플의 균질 (3 %NaCl) 60에 대 한 s. 추가 아군된 샘플에 대 한 무 균된 샘플 국물의 9 ml parahaemolyticus 대 의 알려진된 금액. Unspiked 샘플을 사용 하 여 부정적인 컨트롤. Parahaemolyticus 대 CA에 샘플의 0.1 mL를 도금 하 여 코 클 샘플에 아군의 셀 개수를 추정 고 이후, microcentrifuge 튜브에 dna 샘플의 1 mL를 pipetting 추출, 바이오 센서 및 PCR 분석 실험에 사용할 수 있습니다.
    5. 변경 된 다음 아군 및 unspiked 샘플에서는 parahaemolyticus 대 의 게놈 DNA 추출 삶은 세포 절차36. DNA 농도 및 순도 바이오 광도 측정을 사용 하 여 260의 파장에서 자외선 흡수와 마지막으로, 결정 (빛의 파장을 흡수 하는 핵 산)으로 nm 및 280의 파장에 또한 nm (단백질 흡수 하는 빛의 파장)으로.

결과

AuNPs의 형성 나트륨 시트르산 존재와 용액의 색깔에서 변화를 통해 밝혀졌다. 이 깊은 루비 레드 빛 노란색에서 변경 하려면 색상을 발생 합니다. PLA AuNPs의 세대 표면 플라스몬 공명 (SPR) 피크의 성장 약 540에서 발견 됐다 대 한 UV 스펙트럼 (그림 1)에서 확인 되었다 nm. 형성 및 PLA AuNPs의 존재는 입자 크기37에 따라 500-600 nm 파장 범위?...

토론

전기 화학 바이오 센서의이 종류의 성공적인 개발을 위한 프레임 워크의 중요 한 단계는 핵 산 (DNA 여기); 변환기에 대 한 적절 한 생물학적 인식 요소 선택 트랜스듀서;의 감지 레이어를 생성 하기 위한 화학 접근 변환 자료; 최적화 DNA 동원 정지 및 교 잡; 그리고 실제 예제를 사용 하 여 개발 된 바이오 센서의 유효성 검사.

민감하고 선택적 전기 화학 DNA 바이오 센서의 성공적...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

저자는 Universiti 푸 트 라 말레이시아의 지원을 하 고 싶습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidMerck100056
ChloroformMerck102445
Diaminoethane tetraacetic acidPromegaE5134
Dibasic sodium phosphate Sigma-AldrichS9763
Disodium hydrogen phosphateSigma-Aldrich255793
Ethanol Sigma-Aldrich16368
Gold (III) chloride trihydrateSigma-Aldrich520918
Hydrochloric acidMerck100317
Methylene blueSigma-AldrichM44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrateSigma-AldrichS3522
Phosphate-buffered salineSigma-AldrichP5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042DNatureWorks4042D
Potassium chlorideR&M Chemicals59435
Potassium dihydrogen phosphateSigma-AldrichP9791
Potassium hexacyanoferrate IIIR&M Chemicals208019
Sodium acetate anhydrous saltSigma-AldrichS2889
Sodium chlorideSigma-AldrichS9888
Trisodium citrateSigma-AldrichS1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethaneFisher ScientificT395-100
Tris-BaseFisher ScientificBP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-DyeNorgen Biotek28240
Agarose gelMerck101236
Bolton AgarMerck100079
Bolton BrothMerck100079
CHROMagar VibrioCHROMagarVB910
dNTPsPromegaU1511
Nuclease-free waterThermo ScientificR0581
Eosin methylene blue agar Merck101347
GelRedBiotium41001
GlycerolMerck104092
Go Taq BufferPromegaM7911
Loading dye 100 bp DNA ladderPromegaG2101
Loading dye 1kb DNA ladderPromegaG5711
Magnesium chloridePromega91176
Mannitol egg yolk polymyxin agarMerck105267
McConkey AgarMerck105465
Nutrient BrothMerck105443
Taq polymeraseMerck71003
Trypticase Soy BrothMerck105459
Trypticase Soy AgarMerck105458

참고문헌

  1. Gould, L. H., Rosenblum, I., Nicholas, D., Phan, Q., Jones, T. F. Contributing factors in restaurant-associated foodborne disease outbreaks, FoodNet sites, 2006 and 2007. Journal of Food Protection. 76, 1824-1828 (2013).
  2. Arvanitoyannis, I. S., Kotsanopoulos, K. V., Papadopoulou, A. Rapid detection of chemical hazards (toxins, dioxins, and PCBs) in seafood. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 54, 1473-1528 (2014).
  3. Robertson, L. J., Sprong, H., Ortega, Y. R., van der Giessen, J. W. B., Fayer, R. Impacts of globalisation on foodborne parasites. Trends in Parasitology. 30, 37-52 (2014).
  4. Sandilands, E. A., Bateman, D. N. The epidemiology of poisoning. Medicine. 44, 76-79 (2016).
  5. Boschi-Pinto, C., Velebit, L., Shibuya, K. Estimating child mortality due to diarrhoea in developing countries. Bulletin of the World Health Organization. 86, 710-717 (2008).
  6. Farthing, M. J. G. Diarrhoea: A Significant Worldwide Problem. International Journal of Antimicrobial Agents. 14, 65-69 (2000).
  7. World Health Organization. . WHO estimates of the global burden of foodborne diseases: foodborne disease burden epidemiology reference group 2007-2015. , 1-255 (2015).
  8. Yeung, M., Boor, K. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathogens and Disease. 1, 74-88 (2004).
  9. Sakazaki, R., Cliver, D. O., Riemann, H. P. . Foodborne Diseases. , 127-136 (2002).
  10. Grochowsky, J., Odom, S. R., Akuthota, P., Stead, W. Primary Septicemia and Abdominal Compartment Syndrome From Vibrio parahaemolyticus Infection in a 40-Year-Old Patient With No Known Immunocompromise. Infectious Disease in Clinical Practice. 22, (2013).
  11. Raghunath, P. Roles of thermostable direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin (TRH) in Vibrio parahaemolyticus. Frontiers in Microbiology. 5, 805 (2014).
  12. Kalburge, S. S., Whitaker, W. B., Boyd, E. F. High-Salt Preadaptation of Vibrio parahaemolyticus Enhances Survival in Response to Lethal Environmental Stresses. Journal of Food Protection. 77, 246-253 (2014).
  13. Esteves, K., Hervio-Heath, D., Mosser, T., Rodier, C., Tournoud, M. G., Jumas-Bilak, E., Colwell, R. R., Monfort, P. Rapid proliferation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, and Vibrio cholerae during freshwater flash floods in French Mediterranean Coastal lagoons. Applied and Environmental Microbiology. 81, 7600-7609 (2015).
  14. Khandeparker, L., Anil, A. C., Naik, S. D., Gaonkar, C. C. Daily variations in pathogenic bacterial populations in a monsoon influenced tropical environment. Marine Pollution Bulletin. 96, 337-343 (2015).
  15. Caburlotto, G., Suffredini, E., Toson, M., Fasolato, L., Antonetti, P., Zambon, M., Manfrin, A. Occurrence and molecular characterization of Vibrio parahaemolyticus in crustaceans commercialised in Venice area, Italy. International Journal of Food Microbiology. 220, 39-49 (2016).
  16. Wong, H. C., Chen, M. C., Liu, S. H., Liu, D. P. Incidence of highly genetically diversified Vibrio parahaemolyticus in seafood imported from Asian countries. International Journal of Food Microbiology. 52, 181-188 (1999).
  17. Rosec, J. P., Causse, V., Cruz, B., Rauzier, J., Carnat, L. The international standard ISO/TS 21872-1 to study the occurence of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae in seafood: ITS improvement by use of a chromogenic medium and PCR. International Journal of Food Microbiology. 157, 189-194 (2012).
  18. Maniyankode, R. A., Kingston, J. J., Murali, H. S., Batra, H. V. Specific identification of vibrio parahaemolyticus employing monoclonal antibody based immunoassay. International Journal of Pharmacy and Biological Sciences. 4 (2), B156-B164 (2013).
  19. Suffredini, E., Lopez-Joven, C., Maddalena, L., Croci, L., Roque, A. Pulsed-field gel electrophoresis and PCR characterization of environmental Vibrio parahaemolyticus strains of different origins. Applied and Environmental Microbiology. 77, 6301-6304 (2011).
  20. Bhattacharyya, N., Hou, A. A pentaplex PCR assay for detection and characterization of Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus isolates. Letters in Applied Microbiology. 57, 233-240 (2013).
  21. da Silva, E. T. S. G., et al. Electrochemical Biosensors in Point-of-Care Devices: Recent Advances and Future Trends. ChemElectroChem. 4 (4), 778-794 (2017).
  22. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. Sensitive detection of multiple pathogens using a single DNA probe. Biosensors and Bioelectronics. 86, 398-405 (2016).
  23. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. A simple, portable, electrochemical biosensor to screen shellfish for Vibrio parahaemolyticus. AMB Express. 7 (1), 41 (2017).
  24. Zhang, J., Li, Z., Zhang, H., Wang, J., Liu, Y., Chen, G. Rapid detection of several foodborne pathogens by F0F1-ATPase molecular motor biosensor. Journal of Microbiological Methods. 93, 37-41 (2013).
  25. Barsan, M. M., Ghica, E. M., Brett, C. M. A., Nikolelis, D. P., Varzakas , T., Erdem, A., Nikoleli, G. P. . Portable biosensing of food toxicants and environmental pollutants. , 33-69 (2014).
  26. Kwun, J., Yun, S., Park, L., Lee, J. H. Development of 1,1'-oxalyldiimidazole chemiluminescent biosensor using the combination of graphene oxide and hairpin aptamer and its application. Talanta. 119, 262-267 (2014).
  27. Thavanathan, J., Huang, N. M., Thong, K. L. Colorimetric biosensing of targeted gene sequence using dual nanoparticle platforms. International Journal of Nanomedicine. 10, 2711-2722 (2015).
  28. Hushiarian, R., Yusof, N. A., Abdullah, A. H., Ahmad, S. A. A., Dutse, S. W. Facilitating the indirect detection of genomic DNA in an electrochemical DNA biosensor using magnetic nanoparticles and DNA ligase. Analytical Chemistry Research. 6, 17-25 (2015).
  29. Dutse, S. W., Yusof, N. A., Ahmad, H., Hussein, M. Z., Zainal, Z., Hushiarian, R., Hajian, R. An Electrochemical Biosensor for the Determination of Ganoderma boninense Pathogen Based on a Novel Modified Gold Nanocomposite Film Electrode. Analytical Letters. 47 (5), 819-832 (2014).
  30. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hajian, R. Characterization of Polylactide-Stabilized Gold Nanoparticles and Its Application in the Fabrication of Electrochemical DNA Biosensors. Journal of the Brazilian Chemical Society. 27 (9), 1679-1686 (2016).
  31. Vongkamjan, K., Wang, S., Moreno Switt, A. I. Rapid detection of foodborne bacterial pathogens in seafood. Handbook of Seafood: Quality and Safety Maintenance and Applications. , 247-257 (2016).
  32. Wang, F., Jiang, L., Yang, Q., Han, F., Chen, S., Pu, S., Vance, A., Ge, B. Prevalence and antimicrobial susceptibility of major foodborne pathogens in imported seafood. Journal of Food Protection. 74 (9), 1451-1461 (2011).
  33. Szermer-Olearnik, B., Sochocka, M., Zwolinska, K., Ciekot, J., Czarny, A., Szydzik, J., Kowalski, K., Boratynski, J. Comparison of microbiological and physicochemical methods for enumeration of microorganisms. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 68, 1392-1396 (2014).
  34. Ivanov, I. G., Bachvarov, D. R. Determination of plasmid copy number by the "boiling" method. Analytical Biochemistry. 165 (1), 137-141 (1987).
  35. Gopireddy, V. R. Biochemical tests for the identification of bacteria. International Journal of Pharmacy and Technology. 3 (4), 1536-1555 (2011).
  36. Böhme, K., Fernández-No, I. C., Pazos, M., Gallardo, J. M., Barros-Velázquez, J., Cañas, B., Calo-Mata, P. Identification and classification of seafood-borne pathogenic and spoilage bacteria: 16S rRNA sequencing versus MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 34 (6), 877-887 (2013).
  37. Seoudi, R., Fouda, A. A., Elmenshawy, D. A. Synthesis, characterization and vibrational spectroscopic studies of different particle size of gold nanoparticle capped with polyvinylpyrrolidone. Physica B: Condensed Matter. 405, 906-911 (2010).
  38. Mishra, A., Harper, S., Yun, S. I. Interaction of biosynthesized gold nanoparticles with genomic DNA isolated from E. coli and S. aureus. Nanotechnology (IEEE-NANO). , 1745-1750 (2011).
  39. Sugimoto, T. Formation of modoispersed nano- and micro-particles controlled in size, shape, and internal structure. Chemical Engineering and Technology. 26, 313-321 (2003).
  40. Rath, C., Sahu, K. K., Kulkarni, S. D., Anand, S., Date, S. K., Das, R. P., Mishra, N. C. Microstructure-dependent coercivity in monodispersed hematite particles. Applied Physics Letters. 75, 4171-4173 (1999).
  41. Abbas, M., Wu, Z. Y., Zhong, J., Ibrahim, K., Fiori, A., Orlanducci, S., Sessa, V., Terranova, M. L., Davoli, I. X-ray absorption and photoelectron spectroscopy studies on graphite and single-walled carbon nanotubes: Oxygen effect. Applied Physics Letters. 87 (5), 051923 (2005).
  42. Lim, S. C., Choi, Y. C., Jeong, H. J., Shin, Y. M., An, K. H., Bae, D. J., Lee, Y. H., Lee, N. S., Kim, J. M. Effect of gas exposure on field emission properties of carbon nanotubes arrays. Advanced Materials. 13, 1563-1567 (2001).
  43. Kim, B. H., Kim, B. R., Seo, Y. G. A study on adsorption equilibrium for oxygen and nitrogen into carbon nanotubes. Adsorption. 11, 207-212 (2005).
  44. Bard, A. J., Faulkner, L. R. . Electrochemical methods: Fundamentals and applications. , (2000).
  45. Tan, Q., Wang, L., Ma, L., Yu, H., Ding, J., Liu, Q., Xiao, A., Ren, G. Study on anion electrochemical recognition based on a novel ferrocenyl compound with multiple binding sites. Journal of Physical Chemistry B. 112, 11171-11176 (2008).
  46. Manivannan, S., Ramaraj, R. Polymer-embedded gold and gold/silver nanoparticle-modified electrodes and their applications in catalysis and sensors. Pure and Applied Chemistry. 83, 2041-2053 (2011).
  47. Benali, O., Larabi, L., Traisnel, M., Gengembre, L., Hareka, Y. Electrochemical, theoretical and XPS studies of 2-mercapto-1-methylimidazole adsorption on carbon steel in 1 M HClO4. Applied Surface Science. 253, 6130-6139 (2007).
  48. Shi, Y., Wen, L., Li, F., Cheng, H. M. Nanosized Li4Ti5O12/graphene hybrid materials with low polarization for high rate lithium ion batteries. Journal of Power Sources. 196, 8610-8617 (2011).
  49. Bentiss, F., Traisnel, M., Lagrenee, M. The substituted 1,3,4-oxadiazoles: a new class of corrosion inhibitors of mild steel in acidic media. Corrosion Science. 42, 127-146 (2000).
  50. Wang, M., Gong, W., Meng, Q., Zhang, Y. Electrochemical DNA impedance biosensor for the detection of DNA hybridization with polymeric film, single walled carbon nanotubes modified glassy carbon electrode. Russian Journal of Electrochemistry. 47, 1368-1373 (2011).
  51. Herdt, A. R., Drawz, S. M., Kang, Y., Taton, T. A. DNA dissociation and degradation at gold nanoparticle surfaces. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 51 (2), 130-139 (2006).
  52. Bhatt, N., Huang, P. J. J., Dave, N., Liu, J. Dissociation and degradation of thiol-modified DNA on gold nanoparticles in aqueous and organic solvents. Langmuir. 27, 6132-6137 (2011).
  53. Liu, X., Jang, C. H., Zheng, F., Jürgensen, A., Denlinger, J. D., Dickson, K. A., Raines, R. T., Abbott, N. L., Himpsel, F. J. Characterization of protein immobilisation at silver surfaces by near edge X-ray absorption fine structure spectroscopy. Langmuir. 22, 7719-7725 (2006).
  54. Willey, T. M., Andrew, L., Vance, T., Buuren, V., Bostedt, C., Terminello, L. J., Fadley, C. S. Rapid degradation of alkanethiol-based self-assembled monolayers on gold in ambient laboratory conditions. Surface Science. 576 (1), 188-196 (2005).
  55. Farjami, E., Clima, L., Gothelf, K., Ferapontova, E. E. DNA interactions with a Methylene Blue redox indicator depend on the DNA length and are sequence specific. Analyst. 135, 1443-1448 (2010).
  56. Lin, X., Ni, Y., Kokot, S. An electrochemical DNA-sensor developed with the use of methylene blue as a redox indicator for the detection of DNA damage induced by endocrine-disrupting compounds. Analytica Chimica Acta. 867, 29-37 (2015).
  57. Zhang, F. T., Nie, J., Zhang, D. W., Chen, J. T., Zhou, Y. L., Zhang, X. X. Methylene Blue as a G-Quadruplex Binding Probe for Label-Free Homogeneous Electrochemical Biosensing. Analytical Chemistry. 86, 9489-9495 (2014).
  58. Ning, L., Li, X., Yang, D., Miao, P., Ye, Z., Li, G. Measurement of Intracellular pH Changes Based on DNA-Templated Capsid Protein Nanotubes. Analytical Chemistry. 86, 8042-8047 (2014).
  59. Sani, N. D. M., Heng, L. Y., Surif, S., Lazim, A. M., Murad, A. . AIP Conference Proceedings. 1571, 636-640 (2013).
  60. Xu, P., Wang, J., Xu, Y., Chu, H., Shen, H., Zhang, D., Zhao, M., Liu, J., Li, G. Binding modes and interaction mechanism between different base pairs and methylene blue trihydrate: a quantum mechanics study. Advances in Experimental Medicine and Biology. 827, 187-203 (2015).
  61. Guo, Y., Chen, J., Chen, G. A label-free electrochemical biosensor for detection of HIV related gene based on interaction between DNA and protein. Sensors & Actuators, B: Chemical. 184, 113-117 (2013).
  62. Huang, K. J., Liu, Y. J., Wang, H. B., Wang, Y. Y., Liu, Y. M. Sub-femtomolar DNA detection based on layered molybdenum disulfide/multi-walled carbon nanotube composites, au nanoparticle and enzyme multiple signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 55, 195-202 (2014).
  63. Kong, R. M., Song, Z. L., Meng, H. M., Zhang, X. B., Shen, G. L., Yu, R. Q. A label-free electrochemical biosensor for highly sensitive and selective detection of DNA via a dual-amplified strategy. Biosensors and Bioelectronics. 54, 442-447 (2014).
  64. Rashid, J. I. A., Yusof, N. A., Abdullah, J., Hashim, U., Hajian, R. Novel Disposable Biosensor Based on SiNWs/AuNPs Modified-Screen Printed Electrode for Dengue Virus DNA Oligomer Detection. IEEE Sensors Journal. 15, 4420-4421 (2015).
  65. Yingkajorn, M., Sermwitayawong, N., Palittapongarnpimp, P., Nishibuchi, M., Robins, W. P., Mekalanos, J. J., Vuddhakul, V. Vibrio parahaemolyticus and its specific bacteriophages as an indicator in cockles (Anadara granosa) for the risk of V. parahaemolyticus infection in Southern Thailand. Microbial Ecology. 67, 849-856 (2014).
  66. Ahmad Ganaie, H., Ali, M. N. Short term protocol for the isolation and purification of DNA for molecular analysis. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. 24, 266-270 (2014).
  67. Nakano, K., Kimura, T., Kitamura, Y., Ihara, T., Ishimatsu, R., Imato, T. Potentiometric DNA sensing platform using redox-active DNA probe pair for sandwich-type dual hybridization at indicator electrode surface. Journal of Electroanalytical Chemistry. 720-721, 71-75 (2014).
  68. Yang, J., Jim Yang, L., Heng-Phon, T., Gan-Moog, C. Inhibition of DNA hybridization by small metal nanoparticles. Biophysical Chemistry. 120, 87-95 (2006).
  69. Niu, L. M., Liu, F., Wang, W., Lian, K. Q., Ma, L., Shi, H. M., Kang, W. J. Electrochemical Behavior of Paraquat on a Highly Ordered Biosensor Based on an Unmodified DNA-3D Gold Nanoparticle Composite and Its Application. Electrochimica Acta. 153, 190-199 (2015).
  70. Li, Z., Miao, X., Xing, K., Zhu, A., Ling, L. Enhanced electrochemical recognition of double-stranded DNA by using hybridization chain reaction and positively charged gold nanoparticles. Biosensors and Bioelectronics. 74, 687-690 (2015).
  71. Niu, S., Sun, J., Nan, C., Lin, J. Sensitive DNA biosensor improved by 1,10-phenanthroline cobalt complex as indicator based on the electrode modified by gold nanoparticles and graphene. Sensors and Actuators B: Chemical. 176, 58-63 (2013).
  72. Yi, H., Xu, W., Yuan, Y., Bai, L., Wu, Y., Chai, Y., Yuan, R. A pseudo triple-enzyme cascade amplified aptasensor for thrombin detection based on hemin/G-quadruplex as signal label. Biosensors and Bioelectronics. 54, 415-420 (2014).
  73. Das, R., Sharma, M. K., Rao, V. K., Bhattacharya, B. K., Garg, I., Venkatesh, V., Upadhyay, S. An electrochemical genosensor for Salmonella typhi on gold nanoparticles-mercaptosilane modified screen printed electrode. Journal of Biotechnology. 188, 9-16 (2014).
  74. Han, X., Fang, X., Shi, A., Wang, J., Zhang, Y. An electrochemical DNA biosensor based on gold nanorods decorated graphene oxide sheets for sensing platform. Analytical Biochemistry. 443 (2), 117-123 (2013).
  75. Huang, K. J., Liu, Y. J., Zhang, J. Z., Cao, J. T., Liu, Y. M. Aptamer/Au nanoparticles/cobalt sulfide nanosheets biosensor for 17β-estradiol detection using a guanine-rich complementary DNA sequence for signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 67, 184-191 (2015).

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