JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Un protocollo per lo sviluppo di un biosensore elettrochimico di DNA che comprende un elettrodo di carbonio nanoparticelle-modificato, serigrafata, acido-stabilizzato, oro polilattico per rilevare il vibrione paraemolitico è presentato.

Abstract

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemoliticus) è un agente patogeno comune di origine alimentare che contribuisce a gran parte dei problemi di salute pubblica a livello globale, significativamente che colpiscono il tasso di morbosità e di mortalità umana. I metodi convenzionali per il rilevamento di V. parahaemoliticus quali metodi basati su cultura, analisi immunologiche e metodi molecolari basati richiedono manipolazione complicate e sono che richiede tempo, noioso e costoso. Recentemente, biosensori hanno dimostrato di essere un promettente e completo metodo di rilevamento con i vantaggi di rilevamento rapido, economicità e praticità. Questa ricerca si concentra sullo sviluppo di un metodo rapido per rilevare V. parahaemoliticus con alta selettività e sensibilità utilizzando i principi di ibridazione del DNA. Nel lavoro, caratterizzazione di nanoparticelle d'oro stabilizzato in acido polilattico sintetizzato (PLA-AuNPs) è stata ottenuta utilizzando la diffrazione dei raggi x (XRD), spettroscopia ultravioletto-visibile (UV-Vis), microscopia elettronica in trasmissione (TEM), emissione di campo Microscopia elettronica a scansione (FESEM) e la voltammetria ciclica (CV). Inoltre abbiamo effettuato ulteriori test di stabilità, sensibilità e riproducibilità di PLA-AuNPs. Abbiamo trovato che il PLA-AuNPs formata una solida struttura di nanoparticelle stabilizzate in soluzione acquosa. Inoltre abbiamo osservato che la sensibilità migliorata grazie il più piccolo valore di resistenza (Rct) trasferimento carica ed un aumento della superficie attiva (0,41 cm2). Lo sviluppo del nostro biosensore di DNA si basava sulla modificazione di un elettrodo di carbonio serigrafato (SPCE) con PLA-AuNPs e utilizzando il blu di metilene (MB) come l'indicatore redox. Abbiamo valutato gli eventi immobilizzazione e ibridazione mediante voltammetria impulso differenziale (DPV). Abbiamo trovato che non-complementari, complementari e non corrispondenti oligonucleotidi specificamente si distinguevano per il biosensore fabbricato. Inoltre ha mostrato in modo affidabile sensibile rilevamento negli studi di reattività crociata contro vari agenti patogeni di origine alimentare e nell'identificazione di V. parahaemoliticus in vongole fresche.

Introduzione

Un importante argomento di dibattito pubblico e scientifico negli ultimi anni, l'intossicazione alimentare è principalmente associata con 3 agenti: microrganismi1, prodotti chimici2e parassiti3. Alimenti contaminati possono causare conseguenze gravi per la salute negli esseri umani, soprattutto nel gruppo di rischio più elevato di quelli con un sistema immunitario debole, anziani, donne incinte, neonati e bambini piccoli4. Con più di 1 milione casi di diarrea acuta che accadono annualmente nei bambini sotto i 5 anni in Africa, Asia e America Latina, l'intossicazione alimentare è una malattia globale principale5,6 e l'organizzazione mondiale della sanità ha stabilito microrganismi come il più importante collaboratore7. Vibrio parahaemolyticus spicca i più ampiamente riconosciuti ceppi virulenti. Solitamente si trova in ambienti costieri, estuari e marino8, è un batterio gram-negativo, che diventa attiva in ambienti sale alti e provoca gravi gastroenteriti umana quando mangiato nella Marina non adeguatamente cotta, maltrattato o cruda prodotti9. Inoltre, condizioni mediche esistenti in alcune persone li rendono inclini a infezioni, setticemia o orecchio infezione derivante da V. parahaemolyticus10della ferita. I fattori di virulenza di V. parahaemoliticus emolisine sono divisi in due tipi che contribuiscono alla patogenesi della malattia: termostabile emolisina diretta (TDH) codificati da geni tdh ed emolisina TDH-correlati codificati da geni di trh11. I marcatori di virulenza (geni tdh e trh) di V. parahaemoliticus si trovano principalmente in campioni clinici piuttosto che in campioni ambientali.

V. parahaemoliticus possiede la capacità di sopravvivere in una vasta gamma di condizioni, rispondere rapidamente ai cambiamenti ambientali12. Il suo meccanismo di proliferazione intensifica il potenziale di rischio aumenta la sua tossicità in parallelo con cellula massa13. Peggio ancora, il cambiamento climatico sta fornendo questi batteri con ampio condizioni per accelerare la loro crescita di popolazione cellulare14. A causa della sua alta frequenza, V. parahaemoliticus deve essere monitorato lungo la catena di approvvigionamento alimentare, in particolare nel commercio e produzione di frutti di mare dal momento che tali prodotti sono dove si trovano in enormi quantità15,16 in tutto il mondo. Attualmente i batteri vengono identificati e isolati utilizzando una gamma di metodi tra cui prove biochimiche, arricchimento e selettivi17, enzima-collegata immunomagnetica sorbente assay (ELISA)18, elettroforesi del gel di impulso-campo (PFGE) 19, test di agglutinazione al lattice e della polimerasi reazione a catena (PCR) test20. Solitamente, questi metodi richiedono personale qualificato, sofisticati strumenti e tecniche laboriose che non forniscono informazioni sulla contaminazione immediatamente. Questo limita fortemente la probabilità di rilevare prontamente contaminazione nociva e applicazioni in loco. Strumenti di rilevazione rapida rimangono una sfida eccezionale.

Biosensoristica sta emergendo come un'opzione di promessa per la rilevazione di patogeni di origine alimentare, perché offre un risparmio di tempo, conveniente, pratico e in tempo reale analisi metodo21,22,23,24 . Tuttavia, anche se ci sono stati molti risultati positivi di rilevazione di analita in campioni arricchiti e soluzione standard utilizzando biosensori, c'è ancora una mancanza di ricerca applicata a campioni reali in miscele acquose o estratti organici25. Recentemente, biosensori elettrochimici tramite rilevazione diretta e/o indiretta dell'acido deossiribonucleico (DNA) hanno ricevuto maggiore attenzione tra gli scienziati, a causa della loro specifica per la rilevazione di complementare di destinazione tramite un evento di ibridazione26 , 27 , 28 , 29. questi approcci unici sono più stabili rispetto ai biosensori basati su enzima, offrendo così una tecnologia promettente per la miniaturizzazione e la commercializzazione. L'obiettivo dello studio segnalato qui è quello di costruire uno strumento veloce che può rilevare V. parahaemoliticus con alta selettività, sensibilità e praticità, basata sulla specificità di sequenza di DNA durante l'ibridazione. Strategie di identificazione comportano la combinazione di polilattico acido-stabilizzato di nanoparticelle d'oro (PLA-AuNPs)30 ed elettrodi di carbonio serigrafato (SPCEs) in presenza di indicatore di ibridazione, blu di metilene (MB). Il potenziale del costrutto rilevamento sviluppati è ulteriormente esplorato utilizzando campioni di batteri DNA cockle lisato e fresco.

Protocollo

Nota: Tutti i reagenti chimici e biochimici per essere utilizzati devono essere di purezza analitica e utilizzato senza ulteriore purificazione. Preparare tutte le soluzioni utilizzando acqua deionizzata sterile. Autoclave tutti i bicchieri prima della sterilizzazione.

Attenzione: Si prega di utilizzare tutte le pratiche di sicurezza appropriate quando si eseguono attività di laboratorio, compreso l'uso di controlli (cappa, glovebox) tecnici e dispositivi di protezione individuale (occhiali di sicurezza, guanti, camice, pantaloni di lunghezza completa, chiuse scarpe).

1. fabbricazione e caratterizzazione di elettrodo per volta utilizzando PLA-AuNPs

  1. Preparazione e caratterizzazione di PLA-AuNPs
    1. Aggiungere 10 mL di soluzione di citrato di sodio (38,8 mM) a 100 mL di soluzione di acido cloroaurico acquosa (1 mM) di ebollizione rapidamente e raffreddare fino a temperatura ambiente. Osservare i cambiamenti nel colore nella soluzione preparata AuNPs che inizia come giallo, modifiche a nerastro e infine termina come rosso rubino scuro.
    2. Posizionare i pellet PLA in uno stampo di acciaio inox per il processo di fusione e li preriscaldare a una temperatura di 190 ° C per 10 min. Segui la procedura di pressatura: metterli sotto una pressione di 2,2 MPa per 1 min come parte della preparazione foglio PLA. Il foglio PLA sarà pronto per l'uso dopo il raffreddamento per circa 3 ore.
    3. Mescolando energicamente, sciogliere 0,68 mg dei fogli PLA in 5 mL di cloroformio a temperatura ambiente. Mescolare il PLA disciolto con 10 mL di soluzione AuNPs precedentemente preparata e mescolate in modo omogeneo a temperatura ambiente. Le miscele omogenee possono quindi essere denotate come PLA-AuNPs e caratterizzato usando UV-Vis, XRD, TEM e FESEM con EDX.
  2. Preparazione e caratterizzazione di elettrodi di carbonio serigrafato modificate
    Nota: Il SPCE utilizzato in questo studio comprende un sistema di tre elettrodi: un elettrodo contatore, un elettrodo di lavoro di carbonio e un elettrodo di riferimento Ag/AgCl.
    1. Dispensare 25 µ l della soluzione omogenea di PLA-AuNPs sul SPCE e quindi aria asciugare rapidamente per 24 h prima dell'uso.
    2. Elettrochimicamente caratterizzano gli elettrodi modificati, SPCE/PLA-AuNPs-ferro cianuro del potassio (K3[Fe(CN)6]3 -/4 -) per misurare la superficie attiva, spettroscopia di impedenza elettrochimica, ripetibilità, riproducibilità e stabilità30.

2. sviluppo del biosensore elettrochimico del DNA

  1. Preparazione della sonda
    Nota: Le sequenze del DNA complementare e ssDNA sonda sono stati scelti sulla base delle informazioni dal centro nazionale per database Biotechnology Information (NCBI).
    1. Acquisto di oligonucleotidi sintetici (20-mer ssDNA sonda, DNA complementare 20-mer, 20-mer malassortiti DNA e DNA non-complementare 21-mer) come polvere liofilizzata da laboratori commerciali, basato su sequenze seguenti:
      chitosani ssDNA sonda: 5 ′ - / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3 '
      DNA complementare: 3 ′ 5 ′ - CAGTGCTTCTGCATAATCCG -
      DNA non corrispondente uno-base: 3 ′ 5 ′ - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG -
      tre basi DNA non corrispondente: 3 ′ 5 ′ - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG -
      DNA non complementari: 3 ′ 5 ′ - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA -
    2. Preparare soluzioni di riserva di tutti gli oligonucleotidi (100 µM) utilizzando una soluzione TE sterile (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5), suddivisa in porzioni analitiche. Tenere questo a-4 ° C e quindi apportare le appropriate diluizioni appena prima dell'uso.
  2. Ottimizzazione di immobilizzazione e ibridazione
    Nota: Un SPCE modificato con PLA-AuNPs, denotato come SPCE/PLA-AuNPs, è stato utilizzato per questo studio e un metodo di fusione di goccia è stato utilizzato per l'immobilizzazione del DNA e l'ibridazione.
    1. In primo luogo, immobilizzare 25 µ l di sonda ssDNA chitosani su SPCE/PLA-AuNPs e poi aria la asciugare per 24 ore a temperatura ambiente, dopo di che essa verrà infine indicata come SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. Determinare l'ottimizzazione della condizione immobilizzazione utilizzando tre fattori: la concentrazione di ssDNA (che vanno da 0,2 a 1,4 µM), tempo (variabile da 30 a 210 min) e temperatura (che vanno da 25 a 75 ° C).
    2. Pipettare 25 µ l di DNA complementare sopra alla superficie di SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA di svolgere l'evento di ibridazione dopo di che può essere infine indicata come SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Determinare l'ottimizzazione della condizione ibridazione tramite i due fattori di tempo (da 5 a 30 min) e temperatura (che vanno da 25 a 75 ° C).
    3. Immergere l'immobilizzato e ibridati elettrodi in µM 20 MB per 30 min. rimuovere il DNA non specifico adsorbito e MB in eccesso mediante lavaggio con 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5) e poi risciacquo con acqua deionizzata. Misurare la corrente di picco del MB riduzione usando tecnica DPV. Eseguire la misura di DPV con 0.1 M PBS (pH 7) non contenente nessun indicatore.
  3. Caratterizzazione del biosensore DNA fabbricato
    1. Immergere il SPCE/PLA-AuNPs in µM 20 MB per 30 min, lavare con 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5) e poi risciacquare con acqua deionizzata prima della misura. Seguire una procedura simile per tutte le interazioni tra cui la sonda DNA, DNA complementare, DNA non corrispondente e non complementari campioni di DNA.
    2. Misurare la riduzione elettrochimica.
      Nota: Abbiamo misurato DPV utilizzando un Autolab commercialmente manufactured con software di interfaccia.
      Le misurazioni di DPV della riduzione elettrochimica MB eseguita presso un potenziale che vanno da -0.5 V a 0,25 V, con un passo di potenziale di 0.005 V, ampiezza di modulazione di 0.05 V e una velocità di scansione di 7,73 mVs-1 in 0.1 M PBS (pH 7), non contenente nessun indicatore. La selettività, sensibilità, riproducibilità e stabilità al calore del biosensore DNA fabbricato più ulteriormente sono stati studiati. Risultati riferiti sono stati presentati come media valore misurazioni in tre repliche.

3. convalida del biosensore fabbricato del DNA utilizzando campioni reali

  1. Preparazione dei ceppi batterici
    1. Selezionare batterici campioni basati sulla loro significativa contaminazione dei frutti di mare31,32 .
      Nota: V. parahaemoliticus come ceppi di riferimento e 8 altri ceppi batterici (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, polmonite da Klebsiella Escherichia coli O157: H7, Bacillus cereuse alginolyticus del vibrione) delle epidemie alimentari comuni patogeni sono stati impiegati per la validazione di biosensori elettrochimica del DNA in questo studio.
    2. Condurre una routine sub-cultura di ceppi batterici su loro rispettivi agar ogni due settimane per mantenere la loro vitalità, consultare la tabella 1 per le condizioni di coltura.
    3. Mantenere la conservazione a lungo termine dei ceppi batterici nei loro rispettivi brodi crescenti contenente 20% (v/v) glicerolo a-80 ° C come glicerolo protegge i batteri impedendo la formazione di cristalli di ghiaccio che possono danneggiarli durante il processo di congelamento. Successivamente, inoculare un ciclo della cultura di cellula batterica conservati negli stock di glicerolo nei rispettivi brodi. Incubare i brodi secondo le loro rispettive crescita tempo e temperatura quando il bisogno di far rivivere i batteri.
    4. Determinare la quantità di V. parahaemoliticus celle utilizzando una piastra di diffusione tecnica33, standard e un metodo ben noto per l'enumerazione dei microrganismi derivate da una serie di diluizioni.
      1. Cultura V. parahaemoliticus in brodo di soia Trypticase (TSB + 3% NaCl) a 37 ° C in una condizione di agitazione 140 giri/min. Quindi, trasferire 1 mL di coltura delle cellule di batteri in 9 mL di TSB + 3% NaCl per ottenere un fattore di diluizione 10-1 .
    5. Ripetere questo passaggio nove volte per ottenere una serie completa di fattore di diluizione fino a 10-10 . Successivamente, si sono diffuse 0,1 mL di ciascun fattore di diluizione (a partire da 10-1 a 10-10) sulla piastra di agar selettivo di un Vibrio per Colonia contando, rispettivamente. Incubare le piastre incubate a 37 ° C per 24 h.
    6. Utilizzare un contatore per contare diverse colonie e poi retro-calcolare (conteggio la quantità CFU/pipettato x fattore di diluizione) per ottenere un'unità formanti colonie per millilitro densità (CFU mL-1). Derivare la concentrazione della Colonia formando unità (CFUs) in sospensioni di cellule di batteri dalla trama di calibrazione di CFU mL-1 assorbanza.
  2. Preparazione del test PCR
    1. Estrarre DNA genomic seguendo un modificato bollito Lisi procedura34. Primo, streak un batterica individuale ceppo agarizzati e inoculare in media di brodo, seguita da incubazione e alla sua condizione di crescita relativa, un 140 giri/min agitazione condizione.
    2. Dispensare una cultura di 1 mL di brodo in una provetta da centrifuga micro. Questo Centrifugare a 4830 x g e a 4 ° C per 1 min ottenere pellet. Utilizzare circa 500 µ l di tampone sterile TE per risospensione con il pellet. Tenere la sospensione risultante per 10 min a 98 ± 2 ° C in un blocco di riscaldamento e raffreddare immediatamente a-18 ° C per 10 min lisare le cellule e liberare il DNA.
    3. Centrifugare il DNA genomico a 4830 x g e a 4 ° C per 3 minuti ottenere una sospensione di chiara e tenere il supernatante a-20 ° C per un ulteriore uso. Utilizzare una misurazione biofotometro con assorbimento UV a lunghezza d'onda di 260 nm (come acidi nucleici assorbire la lunghezza d'onda della luce) e anche ad una lunghezza d'onda di 280 nm (come le proteine assorbe la lunghezza d'onda della luce) per determinare la concentrazione e la purezza dell'Estratto il DNA genomico e quindi identificare tutti i ceppi utilizzando saggi biochimici standard35 e loro verifica tramite 16S rRNA gene sequenziamento36. Infine, denaturare il DNA genomico a 92 ° C per 2 min e raffreddarlo rapidamente in acqua di ghiaccio prima dell'applicazione per il biosensore.
    4. Confermare ulteriormente la presenza V. parahaemoliticus usando la PCR per il gene toxR di destinazione. Eseguire questa procedura in un termociclatore utilizzando una coppia di primer (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' e 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). Ottimizzare l'amplificazione di PCR in un volume di reazione totale di 25 µ l composto da acqua sterile (15,5 µ l), buffer (5 µ l), primer (1 µ l, 10 µM), miscela del dNTP (1 µ l), mascherina del DNA (2 µ l) e la Taq DNA polimerasi (0,2 µ l, 10 x).
    5. Mescolare bene i componenti e organizzare l'amplificazione di PCR della sequenza dell'obiettivo in un termociclatore programmato per 30 cicli di amplificazione. Nel nostro studio, ogni ciclo consisteva di tre fasi reazioni i. e., denaturazione iniziale (94 ° C, min 3) seguita da 30 cicli di denaturazione (94 ° C, 1 min), ricottura (63 ° C, min 1,5) ed estensione (72 ° C, min 1,5), seguito dall'estensione finale (72 ° C, min 7).
    6. Determinare i prodotti amplificati e le loro dimensioni tramite elettroforesi su gel di agarosio 1.5%. Catturare le immagini di gel con un sistema gel-documentazione prodotta commercialmente.
  3. Preparazione dei campioni di cockle
    1. Ottenere campioni freschi.
      Nota: Il nostro freschi vongole (Anadara granosa) erano ottenuti dal mercato bagnato in Serdang, Selangor e rapidamente portati al laboratorio in una scatola più fredda del ghiaccio per l'analisi. Dividere i campioni in 2 gruppi, vale a dire il gruppo trattato e non trattato, supponendo che le vongole sono state raccolte in modo uniforme dall'inizio della vendemmia fino alla loro immissione in cella frigorifera.
    2. Pretrattare le vongole nel gruppo curato memorizzandole a-20 ° C per 24 h, seguita dall'esposizione alla luce UV a 20 ° C per 4 h prima dell'estrazione del DNA.
      Nota: La temperatura di congelamento e l'esposizione UV utilizzato per la controllata gruppo uccide o almeno limita il naturalmente ad accumulare V. parahaemoliticus nelle vongole. Non applicare un regime di pastorizzazione più alto di 70 ° C come l'obiettivo della condizione controllata in questo studio è quello di imitare la situazione reale dei cardi freschi. Nel frattempo, analizzare campioni direttamente al gruppo non trattato senza alcun pre-trattamento, non appena arrivano in laboratorio.
    3. Sottocultura un ceppo di V. parahaemoliticus ATCC 17802 in TSB (3% NaCl). Determinare il livello di cellule vitali nell'inoculo tramite placcatura di appropriate diluizioni della TSB (3% NaCl) su CA al fine di ottenere un inoculo di 104 CFU mL-1 di V. parahaemoliticus. Lavare ogni cockle in acqua distillata e lo scrub privo di sporco prima di utilizzare pinze sterili in un'unità a flusso laminare per rimuovere i tessuti dalla shell.
    4. Circa 10 g di campioni di tessuto di cockle di omogeneizzare con un omogeneizzatore in 90 mL di TSB sterile (3% NaCl) per 60 s. Aggiungi una quantità nota di V. parahaemoliticus a 9 mL di brodo campione omogeneizzato per i campioni arricchiti. Utilizzare gli esempi sono come controllo negativo. Stimare i conteggi delle cellule di V. parahaemoliticus a spillo per i campioni di cockle da 0,1 mL dei campioni su CA di placcatura, e successivamente, Pipettare 1 mL di campioni in una microcentrifuga per DNA campione estrazione, da utilizzarsi nel biosensore e analisi di PCR.
    5. Estrarre il DNA genomico del V. parahaemoliticus dai campioni a spillo e sono seguito modificato bollito Lisi procedura36. Infine, determinare la concentrazione di DNA e la purezza tramite una misurazione di Fotometro bio con assorbimento UV a lunghezza d'onda di 260 nm (come acidi nucleici assorbire la lunghezza d'onda della luce) e anche ad una lunghezza d'onda di 280 nm (come le proteine assorbe la lunghezza d'onda della luce).

Risultati

Formazione di AuNPs è stato rivelato attraverso il cambiamento di colore della soluzione acquosa con citrato di sodio presente. Ciò ha causato il colore da modificare da giallo chiaro a un colore rosso rubino intenso. La generazione di PLA-AuNPs è stata confermata dagli spettri UV-vis (Figura 1) dove la crescita del picco surface plasmon resonance (SPR) è stata trovata a circa 540 nm. La formazione e l'esistenza di PLA-AuNPs è stato indicato alle gamme d...

Discussione

I passaggi critici in un quadro di sviluppo positivo di questo tipo di biosensore elettrochimico sono selezione di elementi di riconoscimento biologico appropriato per il trasduttore (acido nucleico o DNA qui); approccio chimico per la costruzione di strato sensibile del trasduttore; materiale di trasduzione; ottimizzazione di immobilizzazione del DNA ed ibridazione; e convalida del biosensore sviluppato utilizzando campioni reali.

Core per il corretto sviluppo di un biosensore elettrochimico ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno di Universiti Putra Malaysia.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidMerck100056
ChloroformMerck102445
Diaminoethane tetraacetic acidPromegaE5134
Dibasic sodium phosphate Sigma-AldrichS9763
Disodium hydrogen phosphateSigma-Aldrich255793
Ethanol Sigma-Aldrich16368
Gold (III) chloride trihydrateSigma-Aldrich520918
Hydrochloric acidMerck100317
Methylene blueSigma-AldrichM44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrateSigma-AldrichS3522
Phosphate-buffered salineSigma-AldrichP5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042DNatureWorks4042D
Potassium chlorideR&M Chemicals59435
Potassium dihydrogen phosphateSigma-AldrichP9791
Potassium hexacyanoferrate IIIR&M Chemicals208019
Sodium acetate anhydrous saltSigma-AldrichS2889
Sodium chlorideSigma-AldrichS9888
Trisodium citrateSigma-AldrichS1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethaneFisher ScientificT395-100
Tris-BaseFisher ScientificBP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-DyeNorgen Biotek28240
Agarose gelMerck101236
Bolton AgarMerck100079
Bolton BrothMerck100079
CHROMagar VibrioCHROMagarVB910
dNTPsPromegaU1511
Nuclease-free waterThermo ScientificR0581
Eosin methylene blue agar Merck101347
GelRedBiotium41001
GlycerolMerck104092
Go Taq BufferPromegaM7911
Loading dye 100 bp DNA ladderPromegaG2101
Loading dye 1kb DNA ladderPromegaG5711
Magnesium chloridePromega91176
Mannitol egg yolk polymyxin agarMerck105267
McConkey AgarMerck105465
Nutrient BrothMerck105443
Taq polymeraseMerck71003
Trypticase Soy BrothMerck105459
Trypticase Soy AgarMerck105458

Riferimenti

  1. Gould, L. H., Rosenblum, I., Nicholas, D., Phan, Q., Jones, T. F. Contributing factors in restaurant-associated foodborne disease outbreaks, FoodNet sites, 2006 and 2007. Journal of Food Protection. 76, 1824-1828 (2013).
  2. Arvanitoyannis, I. S., Kotsanopoulos, K. V., Papadopoulou, A. Rapid detection of chemical hazards (toxins, dioxins, and PCBs) in seafood. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 54, 1473-1528 (2014).
  3. Robertson, L. J., Sprong, H., Ortega, Y. R., van der Giessen, J. W. B., Fayer, R. Impacts of globalisation on foodborne parasites. Trends in Parasitology. 30, 37-52 (2014).
  4. Sandilands, E. A., Bateman, D. N. The epidemiology of poisoning. Medicine. 44, 76-79 (2016).
  5. Boschi-Pinto, C., Velebit, L., Shibuya, K. Estimating child mortality due to diarrhoea in developing countries. Bulletin of the World Health Organization. 86, 710-717 (2008).
  6. Farthing, M. J. G. Diarrhoea: A Significant Worldwide Problem. International Journal of Antimicrobial Agents. 14, 65-69 (2000).
  7. World Health Organization. . WHO estimates of the global burden of foodborne diseases: foodborne disease burden epidemiology reference group 2007-2015. , 1-255 (2015).
  8. Yeung, M., Boor, K. Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections. Foodborne Pathogens and Disease. 1, 74-88 (2004).
  9. Sakazaki, R., Cliver, D. O., Riemann, H. P. . Foodborne Diseases. , 127-136 (2002).
  10. Grochowsky, J., Odom, S. R., Akuthota, P., Stead, W. Primary Septicemia and Abdominal Compartment Syndrome From Vibrio parahaemolyticus Infection in a 40-Year-Old Patient With No Known Immunocompromise. Infectious Disease in Clinical Practice. 22, (2013).
  11. Raghunath, P. Roles of thermostable direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin (TRH) in Vibrio parahaemolyticus. Frontiers in Microbiology. 5, 805 (2014).
  12. Kalburge, S. S., Whitaker, W. B., Boyd, E. F. High-Salt Preadaptation of Vibrio parahaemolyticus Enhances Survival in Response to Lethal Environmental Stresses. Journal of Food Protection. 77, 246-253 (2014).
  13. Esteves, K., Hervio-Heath, D., Mosser, T., Rodier, C., Tournoud, M. G., Jumas-Bilak, E., Colwell, R. R., Monfort, P. Rapid proliferation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, and Vibrio cholerae during freshwater flash floods in French Mediterranean Coastal lagoons. Applied and Environmental Microbiology. 81, 7600-7609 (2015).
  14. Khandeparker, L., Anil, A. C., Naik, S. D., Gaonkar, C. C. Daily variations in pathogenic bacterial populations in a monsoon influenced tropical environment. Marine Pollution Bulletin. 96, 337-343 (2015).
  15. Caburlotto, G., Suffredini, E., Toson, M., Fasolato, L., Antonetti, P., Zambon, M., Manfrin, A. Occurrence and molecular characterization of Vibrio parahaemolyticus in crustaceans commercialised in Venice area, Italy. International Journal of Food Microbiology. 220, 39-49 (2016).
  16. Wong, H. C., Chen, M. C., Liu, S. H., Liu, D. P. Incidence of highly genetically diversified Vibrio parahaemolyticus in seafood imported from Asian countries. International Journal of Food Microbiology. 52, 181-188 (1999).
  17. Rosec, J. P., Causse, V., Cruz, B., Rauzier, J., Carnat, L. The international standard ISO/TS 21872-1 to study the occurence of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus and Vibrio cholerae in seafood: ITS improvement by use of a chromogenic medium and PCR. International Journal of Food Microbiology. 157, 189-194 (2012).
  18. Maniyankode, R. A., Kingston, J. J., Murali, H. S., Batra, H. V. Specific identification of vibrio parahaemolyticus employing monoclonal antibody based immunoassay. International Journal of Pharmacy and Biological Sciences. 4 (2), B156-B164 (2013).
  19. Suffredini, E., Lopez-Joven, C., Maddalena, L., Croci, L., Roque, A. Pulsed-field gel electrophoresis and PCR characterization of environmental Vibrio parahaemolyticus strains of different origins. Applied and Environmental Microbiology. 77, 6301-6304 (2011).
  20. Bhattacharyya, N., Hou, A. A pentaplex PCR assay for detection and characterization of Vibrio vulnificus and Vibrio parahaemolyticus isolates. Letters in Applied Microbiology. 57, 233-240 (2013).
  21. da Silva, E. T. S. G., et al. Electrochemical Biosensors in Point-of-Care Devices: Recent Advances and Future Trends. ChemElectroChem. 4 (4), 778-794 (2017).
  22. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. Sensitive detection of multiple pathogens using a single DNA probe. Biosensors and Bioelectronics. 86, 398-405 (2016).
  23. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hushiarian, R. A simple, portable, electrochemical biosensor to screen shellfish for Vibrio parahaemolyticus. AMB Express. 7 (1), 41 (2017).
  24. Zhang, J., Li, Z., Zhang, H., Wang, J., Liu, Y., Chen, G. Rapid detection of several foodborne pathogens by F0F1-ATPase molecular motor biosensor. Journal of Microbiological Methods. 93, 37-41 (2013).
  25. Barsan, M. M., Ghica, E. M., Brett, C. M. A., Nikolelis, D. P., Varzakas , T., Erdem, A., Nikoleli, G. P. . Portable biosensing of food toxicants and environmental pollutants. , 33-69 (2014).
  26. Kwun, J., Yun, S., Park, L., Lee, J. H. Development of 1,1'-oxalyldiimidazole chemiluminescent biosensor using the combination of graphene oxide and hairpin aptamer and its application. Talanta. 119, 262-267 (2014).
  27. Thavanathan, J., Huang, N. M., Thong, K. L. Colorimetric biosensing of targeted gene sequence using dual nanoparticle platforms. International Journal of Nanomedicine. 10, 2711-2722 (2015).
  28. Hushiarian, R., Yusof, N. A., Abdullah, A. H., Ahmad, S. A. A., Dutse, S. W. Facilitating the indirect detection of genomic DNA in an electrochemical DNA biosensor using magnetic nanoparticles and DNA ligase. Analytical Chemistry Research. 6, 17-25 (2015).
  29. Dutse, S. W., Yusof, N. A., Ahmad, H., Hussein, M. Z., Zainal, Z., Hushiarian, R., Hajian, R. An Electrochemical Biosensor for the Determination of Ganoderma boninense Pathogen Based on a Novel Modified Gold Nanocomposite Film Electrode. Analytical Letters. 47 (5), 819-832 (2014).
  30. Nordin, N., Yusof, N. A., Abdullah, J., Radu, S., Hajian, R. Characterization of Polylactide-Stabilized Gold Nanoparticles and Its Application in the Fabrication of Electrochemical DNA Biosensors. Journal of the Brazilian Chemical Society. 27 (9), 1679-1686 (2016).
  31. Vongkamjan, K., Wang, S., Moreno Switt, A. I. Rapid detection of foodborne bacterial pathogens in seafood. Handbook of Seafood: Quality and Safety Maintenance and Applications. , 247-257 (2016).
  32. Wang, F., Jiang, L., Yang, Q., Han, F., Chen, S., Pu, S., Vance, A., Ge, B. Prevalence and antimicrobial susceptibility of major foodborne pathogens in imported seafood. Journal of Food Protection. 74 (9), 1451-1461 (2011).
  33. Szermer-Olearnik, B., Sochocka, M., Zwolinska, K., Ciekot, J., Czarny, A., Szydzik, J., Kowalski, K., Boratynski, J. Comparison of microbiological and physicochemical methods for enumeration of microorganisms. Postepy Higieny i Medycyny Doswiadczalnej. 68, 1392-1396 (2014).
  34. Ivanov, I. G., Bachvarov, D. R. Determination of plasmid copy number by the "boiling" method. Analytical Biochemistry. 165 (1), 137-141 (1987).
  35. Gopireddy, V. R. Biochemical tests for the identification of bacteria. International Journal of Pharmacy and Technology. 3 (4), 1536-1555 (2011).
  36. Böhme, K., Fernández-No, I. C., Pazos, M., Gallardo, J. M., Barros-Velázquez, J., Cañas, B., Calo-Mata, P. Identification and classification of seafood-borne pathogenic and spoilage bacteria: 16S rRNA sequencing versus MALDI-TOF MS fingerprinting. Electrophoresis. 34 (6), 877-887 (2013).
  37. Seoudi, R., Fouda, A. A., Elmenshawy, D. A. Synthesis, characterization and vibrational spectroscopic studies of different particle size of gold nanoparticle capped with polyvinylpyrrolidone. Physica B: Condensed Matter. 405, 906-911 (2010).
  38. Mishra, A., Harper, S., Yun, S. I. Interaction of biosynthesized gold nanoparticles with genomic DNA isolated from E. coli and S. aureus. Nanotechnology (IEEE-NANO). , 1745-1750 (2011).
  39. Sugimoto, T. Formation of modoispersed nano- and micro-particles controlled in size, shape, and internal structure. Chemical Engineering and Technology. 26, 313-321 (2003).
  40. Rath, C., Sahu, K. K., Kulkarni, S. D., Anand, S., Date, S. K., Das, R. P., Mishra, N. C. Microstructure-dependent coercivity in monodispersed hematite particles. Applied Physics Letters. 75, 4171-4173 (1999).
  41. Abbas, M., Wu, Z. Y., Zhong, J., Ibrahim, K., Fiori, A., Orlanducci, S., Sessa, V., Terranova, M. L., Davoli, I. X-ray absorption and photoelectron spectroscopy studies on graphite and single-walled carbon nanotubes: Oxygen effect. Applied Physics Letters. 87 (5), 051923 (2005).
  42. Lim, S. C., Choi, Y. C., Jeong, H. J., Shin, Y. M., An, K. H., Bae, D. J., Lee, Y. H., Lee, N. S., Kim, J. M. Effect of gas exposure on field emission properties of carbon nanotubes arrays. Advanced Materials. 13, 1563-1567 (2001).
  43. Kim, B. H., Kim, B. R., Seo, Y. G. A study on adsorption equilibrium for oxygen and nitrogen into carbon nanotubes. Adsorption. 11, 207-212 (2005).
  44. Bard, A. J., Faulkner, L. R. . Electrochemical methods: Fundamentals and applications. , (2000).
  45. Tan, Q., Wang, L., Ma, L., Yu, H., Ding, J., Liu, Q., Xiao, A., Ren, G. Study on anion electrochemical recognition based on a novel ferrocenyl compound with multiple binding sites. Journal of Physical Chemistry B. 112, 11171-11176 (2008).
  46. Manivannan, S., Ramaraj, R. Polymer-embedded gold and gold/silver nanoparticle-modified electrodes and their applications in catalysis and sensors. Pure and Applied Chemistry. 83, 2041-2053 (2011).
  47. Benali, O., Larabi, L., Traisnel, M., Gengembre, L., Hareka, Y. Electrochemical, theoretical and XPS studies of 2-mercapto-1-methylimidazole adsorption on carbon steel in 1 M HClO4. Applied Surface Science. 253, 6130-6139 (2007).
  48. Shi, Y., Wen, L., Li, F., Cheng, H. M. Nanosized Li4Ti5O12/graphene hybrid materials with low polarization for high rate lithium ion batteries. Journal of Power Sources. 196, 8610-8617 (2011).
  49. Bentiss, F., Traisnel, M., Lagrenee, M. The substituted 1,3,4-oxadiazoles: a new class of corrosion inhibitors of mild steel in acidic media. Corrosion Science. 42, 127-146 (2000).
  50. Wang, M., Gong, W., Meng, Q., Zhang, Y. Electrochemical DNA impedance biosensor for the detection of DNA hybridization with polymeric film, single walled carbon nanotubes modified glassy carbon electrode. Russian Journal of Electrochemistry. 47, 1368-1373 (2011).
  51. Herdt, A. R., Drawz, S. M., Kang, Y., Taton, T. A. DNA dissociation and degradation at gold nanoparticle surfaces. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 51 (2), 130-139 (2006).
  52. Bhatt, N., Huang, P. J. J., Dave, N., Liu, J. Dissociation and degradation of thiol-modified DNA on gold nanoparticles in aqueous and organic solvents. Langmuir. 27, 6132-6137 (2011).
  53. Liu, X., Jang, C. H., Zheng, F., Jürgensen, A., Denlinger, J. D., Dickson, K. A., Raines, R. T., Abbott, N. L., Himpsel, F. J. Characterization of protein immobilisation at silver surfaces by near edge X-ray absorption fine structure spectroscopy. Langmuir. 22, 7719-7725 (2006).
  54. Willey, T. M., Andrew, L., Vance, T., Buuren, V., Bostedt, C., Terminello, L. J., Fadley, C. S. Rapid degradation of alkanethiol-based self-assembled monolayers on gold in ambient laboratory conditions. Surface Science. 576 (1), 188-196 (2005).
  55. Farjami, E., Clima, L., Gothelf, K., Ferapontova, E. E. DNA interactions with a Methylene Blue redox indicator depend on the DNA length and are sequence specific. Analyst. 135, 1443-1448 (2010).
  56. Lin, X., Ni, Y., Kokot, S. An electrochemical DNA-sensor developed with the use of methylene blue as a redox indicator for the detection of DNA damage induced by endocrine-disrupting compounds. Analytica Chimica Acta. 867, 29-37 (2015).
  57. Zhang, F. T., Nie, J., Zhang, D. W., Chen, J. T., Zhou, Y. L., Zhang, X. X. Methylene Blue as a G-Quadruplex Binding Probe for Label-Free Homogeneous Electrochemical Biosensing. Analytical Chemistry. 86, 9489-9495 (2014).
  58. Ning, L., Li, X., Yang, D., Miao, P., Ye, Z., Li, G. Measurement of Intracellular pH Changes Based on DNA-Templated Capsid Protein Nanotubes. Analytical Chemistry. 86, 8042-8047 (2014).
  59. Sani, N. D. M., Heng, L. Y., Surif, S., Lazim, A. M., Murad, A. . AIP Conference Proceedings. 1571, 636-640 (2013).
  60. Xu, P., Wang, J., Xu, Y., Chu, H., Shen, H., Zhang, D., Zhao, M., Liu, J., Li, G. Binding modes and interaction mechanism between different base pairs and methylene blue trihydrate: a quantum mechanics study. Advances in Experimental Medicine and Biology. 827, 187-203 (2015).
  61. Guo, Y., Chen, J., Chen, G. A label-free electrochemical biosensor for detection of HIV related gene based on interaction between DNA and protein. Sensors & Actuators, B: Chemical. 184, 113-117 (2013).
  62. Huang, K. J., Liu, Y. J., Wang, H. B., Wang, Y. Y., Liu, Y. M. Sub-femtomolar DNA detection based on layered molybdenum disulfide/multi-walled carbon nanotube composites, au nanoparticle and enzyme multiple signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 55, 195-202 (2014).
  63. Kong, R. M., Song, Z. L., Meng, H. M., Zhang, X. B., Shen, G. L., Yu, R. Q. A label-free electrochemical biosensor for highly sensitive and selective detection of DNA via a dual-amplified strategy. Biosensors and Bioelectronics. 54, 442-447 (2014).
  64. Rashid, J. I. A., Yusof, N. A., Abdullah, J., Hashim, U., Hajian, R. Novel Disposable Biosensor Based on SiNWs/AuNPs Modified-Screen Printed Electrode for Dengue Virus DNA Oligomer Detection. IEEE Sensors Journal. 15, 4420-4421 (2015).
  65. Yingkajorn, M., Sermwitayawong, N., Palittapongarnpimp, P., Nishibuchi, M., Robins, W. P., Mekalanos, J. J., Vuddhakul, V. Vibrio parahaemolyticus and its specific bacteriophages as an indicator in cockles (Anadara granosa) for the risk of V. parahaemolyticus infection in Southern Thailand. Microbial Ecology. 67, 849-856 (2014).
  66. Ahmad Ganaie, H., Ali, M. N. Short term protocol for the isolation and purification of DNA for molecular analysis. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. 24, 266-270 (2014).
  67. Nakano, K., Kimura, T., Kitamura, Y., Ihara, T., Ishimatsu, R., Imato, T. Potentiometric DNA sensing platform using redox-active DNA probe pair for sandwich-type dual hybridization at indicator electrode surface. Journal of Electroanalytical Chemistry. 720-721, 71-75 (2014).
  68. Yang, J., Jim Yang, L., Heng-Phon, T., Gan-Moog, C. Inhibition of DNA hybridization by small metal nanoparticles. Biophysical Chemistry. 120, 87-95 (2006).
  69. Niu, L. M., Liu, F., Wang, W., Lian, K. Q., Ma, L., Shi, H. M., Kang, W. J. Electrochemical Behavior of Paraquat on a Highly Ordered Biosensor Based on an Unmodified DNA-3D Gold Nanoparticle Composite and Its Application. Electrochimica Acta. 153, 190-199 (2015).
  70. Li, Z., Miao, X., Xing, K., Zhu, A., Ling, L. Enhanced electrochemical recognition of double-stranded DNA by using hybridization chain reaction and positively charged gold nanoparticles. Biosensors and Bioelectronics. 74, 687-690 (2015).
  71. Niu, S., Sun, J., Nan, C., Lin, J. Sensitive DNA biosensor improved by 1,10-phenanthroline cobalt complex as indicator based on the electrode modified by gold nanoparticles and graphene. Sensors and Actuators B: Chemical. 176, 58-63 (2013).
  72. Yi, H., Xu, W., Yuan, Y., Bai, L., Wu, Y., Chai, Y., Yuan, R. A pseudo triple-enzyme cascade amplified aptasensor for thrombin detection based on hemin/G-quadruplex as signal label. Biosensors and Bioelectronics. 54, 415-420 (2014).
  73. Das, R., Sharma, M. K., Rao, V. K., Bhattacharya, B. K., Garg, I., Venkatesh, V., Upadhyay, S. An electrochemical genosensor for Salmonella typhi on gold nanoparticles-mercaptosilane modified screen printed electrode. Journal of Biotechnology. 188, 9-16 (2014).
  74. Han, X., Fang, X., Shi, A., Wang, J., Zhang, Y. An electrochemical DNA biosensor based on gold nanorods decorated graphene oxide sheets for sensing platform. Analytical Biochemistry. 443 (2), 117-123 (2013).
  75. Huang, K. J., Liu, Y. J., Zhang, J. Z., Cao, J. T., Liu, Y. M. Aptamer/Au nanoparticles/cobalt sulfide nanosheets biosensor for 17β-estradiol detection using a guanine-rich complementary DNA sequence for signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 67, 184-191 (2015).

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Bioingegneriaproblema 136nanoparticelle di oro stabilizzato in acido polilatticoelettrodo di carbonio serigrafatobiosensore DNAVibrio parahaemolyticussensore elettrochimicol ibridazione del DNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati