Développement d’un Biocapteur électrochimique ADN pour détecter un pathogène d’origine alimentaire

Résumé

Un protocole pour le développement d’un Biocapteur électrochimique d’ADN comportant une électrode de carbone acide-stabilisé, or de nanoparticules modifiés, sérigraphié de polylactique pour détecter les Vibrio parahaemolyticus est présenté.

Résumé

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) est un pathogène d’origine alimentaire commune qui contribue à une grande partie des problèmes de santé publique dans le monde, affectant de manière notable le taux de morbidité et de mortalité humaine. Les méthodes conventionnelles pour la détection de V. parahaemolyticus tels que les méthodes axées sur la culture, tests immunologiques et moléculaires des méthodes nécessitent la manipulation des échantillons complexes et sont long, fastidieux et coûteux. Récemment, les biocapteurs ont prouvé être une méthode de détection prometteurs et complet avec les avantages d’une détection rapide, coût-efficacité et praticité. Cette recherche porte sur l’élaboration d’une méthode rapide de détection V. parahaemolyticus avec une sélectivité élevée et une sensibilité en utilisant les principes de l’hybridation de l’ADN. Dans le travail, caractérisation des nanoparticules or des stabilisés acide polylactique synthétisés (PLA-AuNPs) a été réalisée à l’aide de la Diffraction des rayons x (DRX), spectroscopie Ultraviolet-visible (UV-Vis), microscopie électronique à Transmission (TEM), émission de champ Microscopie électronique à balayage (FESEM) et la voltampérométrie cyclique (CV). Nous avons effectué également nouveaux essais de stabilité, la sensibilité et la reproductibilité de la PLA-AuNPs. Nous avons trouvé que le PLA-AuNPs forment une structure solide de nanoparticules stabilisées en solution aqueuse. Nous avons également observé que la sensibilité améliorée grâce à la plus petite valeur de la résistance (R_ct) transfert de charge et une augmentation de la surface active (0,41 cm²). Le développement de notre biocapteur ADN reposait sur la modification d’une électrode de carbone sérigraphié (SPCE) avec PLA-AuNPs et à l’aide de bleu de méthylène (MB) comme indicateur rédox. Nous avons évalué les événements de l’immobilisation et l’hybridation par voltamétrie impulsionnelle différentielle (DPV). Nous avons constaté que complémentaires, non complémentaires et oligonucléotides dépareillées étaient particulièrement distingués par le biocapteur fabriqué. Elle a également montré fiable de sensibilité de détection dans les études de réactivité croisée contre divers pathogènes d’origine alimentaire et dans l’identification de V. parahaemolyticus dans les coques fraîches.

Introduction

Un important sujet de débat public et scientifique au cours des dernières années, l’intoxication alimentaire est principalement associée à 3 principes : microorganismes¹, produits chimiques²et parasites³. Des aliments contaminés peuvent provoquer des conséquences graves pour la santé chez les humains, en particulier dans le groupe à risque plus élevé de ceux qui ont un système immunitaire faible, les personnes âgées, les femmes enceintes, bébés et jeunes enfants⁴. Avec plus de 1 million de cas de diarrhée aiguë survenant chaque année chez les enfants âgés de moins de 5 ans en Afrique, Asie et Amérique latine, l’intoxication alimentaire est une maladie mondiale majeure^5,6 , et l’Organisation mondiale de la santé a mis en place microorganismes comme le plus important contributeur⁷. Vibrio parahaemolyticus se distingue parmi les souches virulentes les plus largement reconnues. Trouve généralement dans des environnements côtiers, estuariens et marins⁸, c’est une bactérie Gram-négative, qui devenue actif dans des environnements de sels élevées et provoque sérieuse gastro-entérite humaine lorsqu’ils sont consommés dans les marines mal cuit, mal ou cru produits⁹. En outre, les conditions médicales préexistantes chez certaines personnes rendent sujette à une infection, septicémie ou oreille infection résultant de V. parahaemolyticus¹⁰des plaies. Les facteurs de virulence de V. parahaemolyticus hémolysines sont divisés en deux types qui contribuent à la pathogenèse de la maladie : hémolysine directe thermostable (TDH) codées par des gènes de tdh et hémolysine TDH liées codées par des gènes de trh¹¹. Les marqueurs de virulence (gènes tdh et trh) de V. parahaemolyticus sont surtout présents dans les échantillons cliniques plutôt que dans des échantillons environnementaux.

V. parahaemolyticus possède la capacité de survivre dans un large éventail de conditions, répondre rapidement aux changements environnementaux¹². Son mécanisme de prolifération s’intensifie son potentiel de danger que sa toxicité augmente en parallèle avec la cellule masse¹³. Pire encore, le changement climatique offre ces bactéries avec des conditions suffisamment pour accélérer leur de croissance de population de cellule¹⁴. En raison de sa haute fréquence, V. parahaemolyticus doit être surveillée le long de la chaîne d’approvisionnement alimentaire, en particulier dans le commerce et la production de fruits de mer étant donné que ces produits sont où ils se trouvent en quantités énormes^15,16 dans le monde entier. Actuellement, les bactéries sont identifiés et isolés à l’aide d’un éventail de méthodes, y compris les tests biochimiques, enrichissement et milieux sélectifs¹⁷, immunomagnetic-enzymatique sorbant assay (ELISA)¹⁸, électrophorèse en champ pulse (PFGE) ¹⁹, tests d’agglutination au latex et polymerase chain reaction (PCR) essais²⁰. Ces méthodes exigent habituellement un personnel qualifié, des instruments sophistiqués et techniques laborieuses qui ne fournissent pas d’informations sur la contamination immédiatement. Cela limite fortement la probabilité de détecter promptement contamination nocive et applications sur place. Outils de détection rapide demeurent un défi exceptionnel.

Biodétection s’impose comme une solution prometteuse pour la détection des pathogènes d’origine alimentaire car il offre un gain de temps, économique, pratique et en temps réel analyse méthode^21,22,23,24 . Cependant, bien qu’il y a eu de nombreux résultats positifs de l’analyte détection dans des échantillons enrichis et solution standard à l’aide de biocapteurs, il subsiste un manque de recherche appliquée à des échantillons réels dans des mélanges aqueux ou extraits organiques²⁵. Récemment, des biocapteurs électrochimiques utilisant une détection directe et/ou indirecte l’acide désoxyribonucléique (ADN) ont reçu une attention accrue parmi les scientifiques, en raison de leur détection spécifique de la cible complémentaire via une hybridation événement^{26 , 27 , 28 , 29}. ces approches uniques sont plus stables en comparaison de biocapteurs à base d’enzymes, offrant ainsi une technologie prometteuse pour la miniaturisation et de la commercialisation. L’objectif de l’étude ont signalé ici est de construire un outil rapide pouvant détecter V. parahaemolyticus avec haute sélectivité, la sensibilité et praticité, basée sur la spécificité de séquence d’ADN au cours de l’hybridation. Les stratégies d’identification impliquent la combinaison de polylactique acide-stabilisé nanoparticules d’or (PLA-AuNPs)³⁰ et électrodes en carbone sérigraphié (SPCEs) en présence de l’indicateur de l’hybridation, le bleu de méthylène (MB). Le potentiel de la construction de détection avancés est approfondi en utilisant des échantillons de bactéries ADN cockle lysat et fraîche.

Protocole

Remarque : Tous les réactifs chimiques et biochimiques à utiliser doivent être de qualité analytique et utilisés sans davantage de purification. Préparer toutes les solutions à l’aide de l’eau désionisée stérile. Autoclave toute la verrerie avant la stérilisation.

ATTENTION : S’il vous plaît utilisez toutes les pratiques de sécurité qui s’imposent lors de l’exécution des activités de laboratoire, y compris l’utilisation de contrôles (hotte aspirante, boîte à gants) d’ingénierie et des équipements de protection individuelle (lunettes, gants, blouse, pantalons pleine longueur, fermé-orteil chaussures).

1. fabrication et caractérisation d’électrode modifiée à l’aide de PLA-AuNPs

1. Préparation et caractérisation des PLA-AuNPs
   1. Rapidement, ajouter 10 mL de solution de citrate de sodium (38,8 mM) à 100 mL de solution d’acide chloraurique aqueuse (1 mM) de bouillante et refroidir jusqu'à température ambiante. Observer les changements dans la couleur de la solution préparée de AuNPs qui commence comme jaune, changements à noirâtre et enfin se termine comme rouge rubis foncé.
   2. Placer les boulettes PLA dans un moule en acier inoxydable pour le processus de fusion et les réchauffer à une température de 190 ° C pendant 10 min. Suivez la procédure de pressage : mettez-les sous une pression de 2,2 MPa pendant 1 min dans le cadre de la préparation de feuille PLA. La feuille PLA sera prête à l’emploi après refroidissement pendant environ 3 h.
   3. En remuant vigoureusement, dissoudre 0,68 mg des feuilles PLA dans 5 mL de chloroforme à température ambiante. Mélanger le PLA dissous avec 10 mL de la solution de AuNPs préalablement préparée et remuez de façon homogène à la température ambiante. Les mélanges homogènes peuvent alors être notés comme PLA-AuNPs et caractérisent par UV-Vis, XRD, TEM et FESEM avec EDX.
2. Préparation et caractérisation des électrodes de carbone sérigraphié mis à jour le
   Remarque : La SPCE utilisée dans cette étude comprend un système de trois électrodes : une électrode de référence Ag/AgCl, une électrode de travail carbone et une contre-électrode.
   1. Prélever 25 µL de la solution homogène de PLA-AuNPs sur la SPCE et puis l’air de sécher rapidement il pendant 24 h avant son utilisation.
   2. Électrochimiquement caractérisent les électrodes modifiées, SPCE/PLA-AuNPs, dans le cyanure de potassium ferro (K₃[Fe(CN)₆]^{3 -}/^{4 -}) pour mesurer la superficie active, spectroscopie d’impédance électrochimique, répétabilité, reproductibilité et³⁰de la stabilité.

2. mise au point des biocapteurs électrochimiques ADN

1. Préparation de la sonde
   Remarque : Les séquences de l’ADN simple brin sonde et ADN complémentaire ont été choisis selon les renseignements fournis par le National Center for database Biotechnology Information (NCBI).
   1. Acheter des oligonucléotides synthétiques (sonde ADN simple brin 20-mer, 20-mer ADN complémentaire, 20-mer mismatched ADN et ADN non-complémentaire 21-mer) sous forme de poudre lyophilisée de laboratoires commerciaux, basée sur les séquences suivantes :
      sonde d’ADN simple brin THIOLÉS : 5′ - / D/5ThioMC6-CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3′
      l’ADN complémentaire : 5′ - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - 3′
      une base ADN ne correspondent pas : 5′ - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG - 3′
      trois-base ADN ne correspondent pas : 5′ - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG - 3′
      ADN non-complémentaire : 5′ - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA - 3′
   2. Préparer les solutions de tous les oligonucléotides (100 µM) en utilisant une solution stérile de TE (10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH 7,5), divisée en sections analytiques. Gardez cela à-4 ° C et puis faire des dilutions appropriées juste avant leur utilisation.
2. Optimisation de l’immobilisation et l’hybridation
   Remarque : Un SPCE modifié avec PLA-AuNPs, dénoté comme SPCE/PLA-AuNPs, a été utilisé pour cette étude et un procédé de coulage de chute a été utilisée pour l’immobilisation de l’ADN et l’hybridation.
   1. Tout d’abord, immobiliser 25 µL de sonde ADN simple brin THIOLÉS sur la SPCE/PLA-AuNPs et air sécher pendant 24 h à température ambiante, après quoi il sera finalement établie comme SPCE/PLA-AuNPs/ADN simple brin. Déterminer l’optimisation de la condition de l’immobilisation à l’aide de trois facteurs : la concentration d’ADN simple brin (allant de 0,2 à 1,4 µM), temps (allant de 30 à 210 min) et la température (variant de 25 à 75 ° C).
   2. Pipetter 25 µL de l’ADN complémentaire sur la surface de SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA pour réaliser l’événement de l’hybridation, après quoi il peut être finalement désigné comme SPCE/PLA-AuNPs/ADN double brin. Déterminer l’optimisation de la condition de l’hybridation via les deux facteurs de température (variant de 25 à 75 ° C) et la durée (allant de 5 à 30 min).
   3. Immerger l’immobilisée et électrodes hybrides à 20 µM MB pendant 30 min. enlever l’ADN non spécifiquement adsorbée et excès MB en lavant avec 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5), puis rincer avec l’eau désionisée. Mesure du courant de crête de taux de réduction à l’aide de la technique de la DPV. Exécuter la mesure de DPV aide PBS à 0,1 M (pH 7) ne contenant aucun indicateur.
3. Caractérisation du biocapteur ADN préfabriqué
   1. Immerger la SPCE/PLA-AuNPs à 20 µM MB pendant 30 min, laver avec 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5) et ensuite rincer à l’eau désionisée avant de mesurer. Suivre une procédure similaire pour toutes les interactions, y compris la sonde ADN, ADN complémentaire, ADN ne correspondent pas et des échantillons d’ADN non complémentaires.
   2. Mesurer la réduction électrochimique.
      NOTE : Nous avons mesuré la DPV utilisant un Autolab fabriqué commercialement avec le logiciel d’interface.
      Les mesures de DPV la réduction électrochimique MB effectué à un potentiel allant de -0,5 V à 0,25 V, avec une étape potentielle de 0,005 V, modulation d’amplitude de 0,05 V et une vitesse de balayage de 7,73 mVs^-1 dans du PBS 0,1 M (pH 7), ne contenant aucun indicateur. La sélectivité, la sensibilité, reproductibilité et thermostabilité du biocapteur ADN fabriqué ont été ré-examinées. Résultats rapportés ont été présentés comme moyenne des mesures de valeur en trois répétitions.

3. valider le biocapteur ADN fabriquée à l’aide des échantillons réels

1. Préparation des souches bactériennes
   1. Prélever des échantillons bactériens basés sur leur contamination importante de fruits de mer^31,32 .
      NOTE : V. parahaemolyticus comme des souches de référence et 8 autres souches bactériennes (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, entérite à Salmonella, pneumonie à Klebsiella de Escherichia coli O157 : H7, Bacillus cereuset Vibrio alginolyticus) de la commune d’origine alimentaire pathogène ont été employés pour la validation de biocapteurs électrochimique ADN dans cette étude.
   2. Mener une sous-culture systématique des souches bactériennes sur leur agar respectif toutes les deux semaines à maintenir leur viabilité, veuillez consulter le tableau 1 pour les conditions de culture.
   3. Maintenir la préservation à long terme des souches bactériennes dans leurs respectifs bouillons croissants contenant 20 % (v/v) de glycérol à-80 ° C comme le glycérol protège des bactéries en empêchant la formation de cristaux de glace qui peut les abîmer pendant le processus de congélation. Ensuite, une boucle de la culture de cellule bactérienne préservé dans les stocks de glycérol ensemencer les bouillons respectifs. Incuber les bouillons selon leur croissance respective le temps et la température lorsque nécessitant de faire revivre les bactéries.
   4. Déterminer la quantité de V. parahaemolyticus les cellules à l’aide d’une propagation plaque technique³³, une norme et une méthode bien connue pour la numération des microorganismes dérivés d’une série de dilutions.
      1. La culture V. parahaemolyticus dans un bouillon Trypticase soja (TSB + 3 % NaCl) à 37 ° C dans un état d’agitation 140 tr/min. Ensuite, transférer 1 mL de la culture cellulaire de bactéries dans 9 mL de TSB + 3 % NaCl pour obtenir un facteur de dilution 10^-1 .
   5. Répétez cette étape neuf fois pour obtenir une série complète de facteur de dilution de 10^-10 . Répandre ensuite, 0,1 mL de chaque facteur de dilution (à partir de 10^-1 à 10^-10) sur gélose sélective d’un Vibrio pour colonie comptant, respectivement. Incuber les plaques incubés à 37 ° C pendant 24 h.
   6. Utiliser un compteur de colonies pour dénombrer les colonies individuelles et dos-Calculez (comte le montant CFU/éjectant x facteur de dilution) pour obtenir une unité formant colonie par millilitre densité (CFU mL^-1). Calculer la concentration de la colonie formant des unités (UFC) dans les suspensions cellulaires de bactéries de la parcelle de calibrage de CFU mL^-1 contre l’absorbance.
2. Préparation de la PCR
   1. Extraire l’ADN génomique suite a mis à jour le bouilli lyse procédure³⁴. Tout d’abord, strie un bactériennes individuelles souche sur milieux gélosés et il inoculer en bouillons, suivie de l’incubation à sa condition de croissance relative, un 140 tr/mn, secouant la condition.
   2. Pipeter une culture 1 mL de bouillon dans un tube à centrifuger micro. Cela centrifuger à 4830 x g et 4 ° C pendant 1 min obtenir des boulettes. Utiliser environ 500 µL de tampon TE stérile pour la remise en suspension avec le culot. Tenir la suspension qui en résulte pendant 10 min à 98 ± 2 ° C dans un bloc chauffant et le refroidir immédiatement à-18 ° C pendant 10 min lyser les cellules et de libérer l’ADN.
   3. Centrifuger l’ADN génomique à 4830 x g et 4 ° C pendant 3 min obtenir une suspension claire et garder le liquide surnageant à-20 ° C pour une utilisation ultérieure. Utiliser une mesure de biophotometer avec l’absorption UV à une longueur d’onde de 260 nm (comme les acides nucléiques absorption de longueur d’onde de la lumière) et aussi à une longueur d’onde de 280 nm (comme les protéines, absorption de longueur d’onde de la lumière) pour déterminer la concentration et la pureté de l’extrait l’ADN génomique puis identifiez toutes les souches à l’aide des épreuves biochimiques standard³⁵ et leur vérification par 16 s rRNA gene séquençage³⁶. Enfin, dénaturer l’ADN génomique à 92 ° C pendant 2 minutes et refroidir rapidement dans l’eau glacée avant l’application sur le biocapteur.
   4. Confirmer la présence de V. parahaemolyticus par PCR pour cibler le gène toxR. Exécutez cette procédure dans un thermocycleur à l’aide d’une paire d’amorces (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' et 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). Optimiser l’amplification par PCR dans un volume de réaction totale de 25 µL consistant en eau stérile (15,5 µL), tampon (5 µL), primer (1 µL, 10 µM), Mélange dNTP (1 µL), matrice d’ADN (2 µL) et l’ADN polymérase Taq (0.2 µL, 10 x).
   5. Bien mélanger les composants et organiser l’amplification par PCR de la séquence cible dans un thermocycleur programmé pour 30 cycles d’amplification. Dans notre étude, chaque cycle consistant en trois étapes des réactions, c’est à dire., dénaturation initiale (94 ° C, 3 min) suivie de 30 cycles de dénaturation (94 ° C, 1 min), recuit (63 ° C, 1,5 min) et extension (72 ° C, 1,5 min), suivi d’une extension finale (72 ° C, 7 min).
   6. Déterminer les produits amplifiés et leurs tailles par électrophorèse sur gel d’agarose de 1,5 %. Capturer les images de gel avec un système de gel-documentation disponible dans le commerce.
3. Préparation des échantillons de cockle
   1. Obtenir des échantillons frais.
      NOTE : Nos coques fraîches (Anadara granosa) ont été obtenus à partir du marché humide dans Serdang, Selangor et apportés rapidement au laboratoire dans une boîte de refroidisseur de glace pour analyse. Diviser les échantillons en 2 groupes, à savoir le groupe traité et non-traités, en supposant que les coques ont été récoltés uniformément dès le début de la récolte jusqu'à ce que vous les placez dans l’entreposage au froid.
   2. Traiter les coques dans le groupe traité en les stockant à-20 ° C pendant 24 h, suivie d’une exposition aux rayons ultraviolets à 20 ° C pendant 4 h avant l’extraction de l’ADN.
      Remarque : La température de congélation et l’exposition aux ultraviolets utilisés pour les contrôlés groupe tue ou au moins limite l’accumulation naturellement V. parahaemolyticus dans les coques. Ne pas appliquer un régime supérieur de pasteurisation de 70 ° C car la condition contrôlée dans la présente étude vise à imiter la réalité des coques fraîches. Pendant ce temps, analyser des échantillons prélevés directement dans le groupe non traité sans aucun traitement préalable dès qu’ils arrivent au laboratoire.
   3. Repiquer une souche de V. parahaemolyticus ATCC 17802 au BST (3 % NaCl). Déterminer le niveau de cellules viables dans l’inoculum par électrodéposition des dilutions appropriées du BST (3 % NaCl) sur autorité de certification afin d’obtenir un inoculum de 10 mL UFC^{4 -1} de V. parahaemolyticus. Lavez chaque coque dans l’eau distillée et frottez-le pas d’impuretés avant d’utiliser une pince stérile dans une enceinte à flux laminaire pour enlever les tissus de la coquille.
   4. Homogénéiser les environ 10 g d’échantillons de tissus de cockle avec un homogénéisateur 90 ml de TSB stérile (3 % NaCl) pendant 60 s. Ajouter une quantité connue de V. parahaemolyticus dans 9 mL de bouillon échantillon homogénéisé pour les échantillons enrichis. Utilisez les échantillons enrichit comme témoin négatif. Estimer le nombre de cellules de V. parahaemolyticus dopés sur les échantillons de cockle par l’ensemencement de 0,1 mL des échantillons sur CA, et par la suite, pipette 1 mL d’échantillons dans un tube de microcentrifuge ADN goûter l’extraction, à utiliser dans le biocapteur et test de PCR.
   5. Extraire l’ADN génomique de la V. parahaemolyticus dans les échantillons enrichis et enrichit suite à une modification de bouillie lyse procédure³⁶. Enfin, déterminer la concentration d’ADN et de la pureté à l’aide d’une mesure de photomètre bio avec absorption UV à une longueur d’onde de 260 nm (comme les acides nucléiques absorption de longueur d’onde de la lumière) et aussi à une longueur d’onde de 280 nm (comme les protéines, absorption de longueur d’onde de la lumière).

Résultats

Formation de AuNPs a été révélée par le changement de couleur de la solution aqueuse avec du citrate de sodium présent. Cela a provoqué la couleur changer du jaune clair au rouge rubis profond. La génération de PLA-AuNPs a été confirmée dans les spectres UV-vis (Figure 1) où la croissance du pic surface plasmon resonance (SPR) a été trouvée à environ 540 nm. La formation et l’existence de PLA-AuNPs a été indiqué aux gammes de longueur d?...

Discussion

Les étapes essentielles dans un cadre de mise au point de ce type de biocapteurs électrochimiques sont le choix des éléments de reconnaissance biologique approprié pour le transducteur (acide nucléique ou ADN ici) ; approche chimique pour la construction de la couche sensible du capteur ; matériel de transduction ; optimisation de l’immobilisation de l’ADN et l’hybridation ; et la validation de la biocapteur développé en utilisant des échantillons réels.

De base de la réu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Merck	100056
Chloroform	Merck	102445
Diaminoethane tetraacetic acid	Promega	E5134
Dibasic sodium phosphate	Sigma-Aldrich	S9763
Disodium hydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	255793
Ethanol	Sigma-Aldrich	16368
Gold (III) chloride trihydrate	Sigma-Aldrich	520918
Hydrochloric acid	Merck	100317
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M44907
Monobasic sodium phosphate, monohydrate	Sigma-Aldrich	S3522
Phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P5119
Poly(lactic acid) resin, commercial grade 4042D	NatureWorks	4042D
Potassium chloride	R&M Chemicals	59435
Potassium dihydrogen phosphate	Sigma-Aldrich	P9791
Potassium hexacyanoferrate III	R&M Chemicals	208019
Sodium acetate anhydrous salt	Sigma-Aldrich	S2889
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Trisodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804
Tris(hydroxymethyl) aminomethane	Fisher Scientific	T395-100
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152-500
2X PCR Master Mix with Dual-Dye	Norgen Biotek	28240
Agarose gel	Merck	101236
Bolton Agar	Merck	100079
Bolton Broth	Merck	100079
CHROMagar Vibrio	CHROMagar	VB910
dNTPs	Promega	U1511
Nuclease-free water	Thermo Scientific	R0581
Eosin methylene blue agar	Merck	101347
GelRed	Biotium	41001
Glycerol	Merck	104092
Go Taq Buffer	Promega	M7911
Loading dye 100 bp DNA ladder	Promega	G2101
Loading dye 1kb DNA ladder	Promega	G5711
Magnesium chloride	Promega	91176
Mannitol egg yolk polymyxin agar	Merck	105267
McConkey Agar	Merck	105465
Nutrient Broth	Merck	105443
Taq polymerase	Merck	71003
Trypticase Soy Broth	Merck	105459
Trypticase Soy Agar	Merck	105458