תפוקה גבוהה, נחישות מוחלטת של התוכן של חלבון שנבחר ברמות רקמות באמצעות נקודה כמותיים כתם ניתוח (QDB)

Summary

כאן נדגים הליך מפורט של ניתוח חשופה נקודה כמותית (QDB) על-ידי קביעת התכנים מוחלטת של חלבון יישוב, מיצוי אקטין חלבון, כמו gelsolin (CAPG), ברקמות עכבר אחר שלושה. נדגים עם תפוקה גבוהה, טכניקת immunoblot נוח, כמותיים סמן אימות ברמת הסלולר ורקמות.

Abstract

חסר של נוח, תפוקה גבוהה, כמותיים immunoblot שיטה לקביעת מוחלטת של התוכן של חלבון ספציפי ברמת הסלולר ורקמות הסלים באופן משמעותי את ההתקדמות במחקר פרוטיאומיה מבנית. תוצאות נובע מטכניקות immunoblot זמין כעת גם הם יחסיים, מניעת כל המאמצים לשלב לימודי עצמאי עם ניתוח בקנה מידה גדול של דגימות חלבון. במחקר זה, נדגים את התהליך של ניתוח חשופה נקודה כמותית (QDB) כדי להשיג כימות מוחלט בתבנית תפוקה גבוהה. באמצעות תקן חלבון זמין מסחרית, אנו יכולים לקבוע את התוכן מוחלטת בהגבלת אקטין חלבון, כמו gelsolin (CAPG) דגימות חלבון מקריסטלים של שלושה העכבר שונים רקמות (כליות, טחול, ו הערמונית) יחד עם מפורטת הסבר של הפרטים ניסיוני. אנו מציעים את הניתוח QDB כשיטת immunoblot תפוקת נוח, כמותיים, גבוהה כימות מוחלטת של חלבונים בודדים באותה רמת הסלולר ורקמות. שיטה זו יסייעו באופן משמעותי סמן אימות ואימות נתיב בתחומים שונים של מחקר ביולוגי וביו.

Introduction

לצד ההתפתחויות מרגש מחקר גנומי בשנים האחרונות, המחקר הביו-רפואי שדה גם עדים קידום משמעותי במחקר פרוטיאומיה מבנית. עם הגדלת הצטברות נתונים ביולוגיים בשני גנומית ורמות פרוטיאומיה מבנית, באמצעות bioinformatic כלים לניתוח נתונים אלה הפך המוקד של מחקר ביו בעתיד ונתנים. כתוצאה מכך, ההצלחה של מחקר bioinformatical מעלה את הביקוש יותר וטוב יותר איכות הנתונים מהקהילה מחקר ביולוגי וביו, פעילות תושג רק באמצעות טכניקת קידום-גנומית ורמות פרוטיאומיה מבנית.

ספקטרומטר מסה (MS) וניתוח immunoblot הן שתי טכניקות הרווחת של אנליזת חלבונים תוך זמן קצר. MS השתלט המחקר פרוטיאומיה מבנית בשנים האחרונות כדי לאפשר ניתוח של אלפי חלבונים בודדים בו זמנית. הטכניקות מבוססי immunoblot, כולל תספיג נקודה חשופה, מצד שני, גם שיחקו תפקיד משמעותי במחקר חלבון אפילו מאז שלו ההמצאה^{1,2,3,4, 5}. אנזים מקושרים immunosorbent assay (אליסה)^5,6,7 , שלב הפוכה חלבון microarray (RPPM)^8,9 יכול להיחשב התבנית תפוקה גבוהה של immunoblot ניתוח. עם זאת, כל השיטות מתכלה, למעט אליסה, למדוד את רמת הביטוי היחסי של חלבון ספציפי. האופי היחסי של שיטות אלה יהפכו בעיה אמיתית עבור לימודי אוכלוסיה, כמו הניתוח חייב להיעשות בו זמנית, מניעת כל המאמצים כדי להגדיל את גודל הבריכה באמצעות ניתוחים מרובים. יתר על כן, התוצאות נגזר ממחקרים אלה הן רק חצי כמותית, ובכך מקשים על כל המאמצים ביואינפורמטיקה בניתוח הנתונים. בינתיים, למרות אליסה היא מתאימה לניתוח מוחלטת תפוקה גבוהה של חלבון דגימות, טכניקה זו נראה אתגרי בסביבות מורכבות כגון תאים או רקמות בשל יכולתה קשירה נמוכה ריבוב¹⁰.

יש פיתח שיטה immunoblot מתאים לימודי אוכלוסיה עם המאפיינים המרכזיים של להיות נוח, גבוהה תפוקת, כמותיים, ומתאים קביעה מוחלטת של תכולת החלבון, ואנו בשם חשופה כמותיים נקודה זו טכניקה ניתוח (QDB)¹¹. במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לניתוח QDB, להדגים את השיטה על-ידי קביעת תכולת החלבון המוחלטת של חלבון ספציפי, CAPG, ברקמות עכבר אחר שלושה כולל כליות, טחול של הערמונית. אנו חושבים כי פרוטוקול מפורט זה ממחישה היטב את הכדאיות ואת הנוחות של שיטה זו, ולספק הדרכה על איך להימנע ממלכודות הפוטנציאל בפועל של שיטה זו.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים היו בוצעו בהתאם Binzhou רפואי אוניברסיטת חיה שימוש בהנחיה, אושרו על ידי ועדת הבדיקה האתית של האוניברסיטה לרפואה Binzhou.

1. הכנת הדוגמא

1. לקחת 50 מ"ג העכבר רקמות mL 1.5 שפופרת. להוסיף 200 מאגר פירוק µL (50 מ מ Hepes, pH 7.4, מ מ 137 NaCl, 5 מ מ EDTA, 5 מ מ EGTA, MgCl 1 מ₂, 10 מ מ נה₂P2O₇, 1% טריטון X-100, 10% גליצרול), שהושלם עם מעכבי פרוטאז, פוספטאז (100 מ מ NaF, phenylmethylsulfonyl 0.1 מ מ פלואוריד, pepstatin µg/mL 5, 10 µg/mL leupeptin, aprotinin µg 5/mL).
2. Homogenize הרקמה עם מהמגן עבור 1 דקות על קרח.
3. צנטריפוגה 10 דקות ב g x 8 000 ב 4 º C.
4. לאסוף את תגובת שיקוע לתוך צינורות חדשים (1.5 מ ל), להוציא µL 1 עבור assay ריכוז חלבון עם ערכת BCA.
   הערה: כל המאגרים פירוק נפוץ תספיג ניתוח וניתוח חשופה נקודה יכול לשמש לניתוח QDB.

2. קביעת יחודיות של נוגדן

1. הכנת מדגם lysates (20 µg) בסעיף 1.4, אג BSA חינם (20 µg), חלבון רגיל (עמ' 600), לניתוח תספיג חלבון.
   הערה: אג BSA חינם משמש פקד שלילי ואת החלבון סטנדרטי משמש פקד חיובי. ייחודה של הנוגדן מומחש מציג אחד הלהקה בגודל הנכון באמצעות הניתוח תספיג חלבון.

3. הגדרת הטווח. ליניארית של ניתוח QDB

1. להמיס החלבון סטנדרטי עם ddH₂O. Dilute החלבון כדי ריכוז של 1,200 pg/µL.
2. לדלל את חלבון מרוכז בין דגימות מוכן ב סעיף 1.4 עד 4 µg/µL.
3. התמוססות של BSA עם ddH₂O. Dilute החלבון כדי ריכוז של 1,200 pg/µL ו- µg 4/µL.
4. סדרה של דילול של חלבון סטנדרטית ודוגמאות מוכן הוכנו עם ההדרכה של טבלה 1 ו- 2 בטבלה.
5. מיקס 10 µL דילול חלבון סטנדרטית או דילול מוכן 10 µL 2 x טעינת מאגר ודוגמאות (120 מ"מ טריס-HCl pH 6.8, 20% גליצרול, 4% מרחביות, 0.2% Bromphenol כחול, 200 מ"מ DTT) ביחד.

	S1 (0pg/µl)	S2 (33.3pg / µl)	S3 (100pg/µl)	S3 (300pg/µl)	S5 (600pg/µl)	S6 (1200pg/µl)
protein(1200pg/µl) סטנדרט	0	1.39	4.17	12.5	25	50
אג BSA חינם (4pg/µl)	50	48.61	45.83	37.5	25	0
סה	50	50	50	50	50	50

טבלה 1. סכימת דילול על עקומת חלבון סטנדרטית.

	X1 (0µg/µl)	X2 (0.25µg / µl)	X3 (0.5µg / µl)	X4 (1µg/µl)	X5 (2µg/µl)	X6 (4 µg/µl)
Sample(4µg/µl)	0	3.125	6.25	12.5	25	50
אג BSA(4µg/µl) חינם	50	46.875	43.75	37.5	25	0
סה	50	50	50	50	50	50

בטבלה 2. דילול ערכה עבור דגימות מוכן

6. מחממים את תערובות ב 85 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.

4. תהליך של ניתוח QDB

1. דוגמה ליישום
   1. תומך את הצלחת QDB כדי למנוע את תחתית הצלחת לגעת במשטח של הטבלה. לדוגמה, השתמש קופסת עצה פיפטה ריק כתמיכה.
   2. לטעון µL עד 2 המדגם למרכז של קרום בחלק התחתון של יחידת בודדים של צלחת QDB.
2. ייבוש את הצלחת
   1. להשאיר את הצלחת QDB טעון לשעה בחדר ממוזג (RT) או כחלופה להשאיר את הצלחת טעון ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות במקום מאוורר היטב.
3. חוסם את הצלחת
   1. טובלים את הצלחת QDB במאגר העברה (מ' 0.039 גליצין, טריס 0.048 מ', 0.37% מרחביות, 20% מתיל אלכוהול) ומנערים בעדינות את הצלחת. בשביל 10 s.
   2. לשטוף את הצלחת QDB בעדינות עם TBST (טריס באגירה מלוחים, 0.1% Tween 20) שלוש פעמים ולאחר מכן לשטוף הצלחת. בשביל 5 דקות ב- TBST תחת טלטול מתמיד.
   3. לחסום את הצלחת QDB עם מאגר חסימה (5% חלב דל שומן TBST (100 µL טוב) עבור h 1 תחת טלטול מתמיד.
4. נוגדן ראשוני דגירה
   1. לדלל נוגדן ראשוני במאגר חסימה בריכוז שבחרת (מ 1:500 כדי 000 1:5), ולהוסיף 100 µL לכל טוב בודדים של צלחת רגילה טוב 96. הכנס את הצלחת QDB לתוך הצלחת היטב 96, דגירה הלוחות משולב גם עבור 2 h ב RT או בן לילה ב 4 ° C תחת טלטול מתמיד.
   2. לחלופין, למקם את הצלחת QDB בתוך קופסה, למלא את התיבה עם חסימה מאגר 2-3 מ מ מעל החלק ממברנה של הצלחת אם הנוגדן באותו משמש את כל הצלחת. הוסף נוגדן ראשוני-ריכוז שבחרת, דגירה את הצלחת גם עבור 2 h ב RT או בן לילה ב 4 ° C על ידי תחת טלטול מתמיד.
   3. יש לשטוף את הצלחת בעדינות עם TBST עבור שלוש פעמים לפני זה נשטף עם TBST עבור שלוש פעמים, כל פעם במשך 5 דקות תחת טלטול מתמיד.
5. הדגירה נוגדנים משניים
   1. לדלל הנוגדן משני במאגר החוסמים את הריכוז שבחרת (מ- 1:1, 000 עד 1:50, 000), וכן גם aliquot 100 µL/היטב לתוך צלחת טוב 96 או בתוך קופסה כמפורט בסעיף 4.4.2, דגירה ואז הצלחת QDB פנימה גם את פלה טוב 96 טעון טה או תיבת עבור h 1 ב RT תחת טלטול מתמיד.
   2. לשטוף את הצלחת QDB בעדינות 3 פעמים עם TBST, ולאחר מכן לשטוף את הצלחת. בשביל 3 פעמים, חמש דקות כל אחד עם TBST תחת טלטול מתמיד.
6. כמת
   1. הכנת המצע chemiluminescence משופרת (ECL) לפי הוראות היצרן.
   2. Aliquot המצע ECL לתוך צלחת טוב (100 µL טוב) 96 הוסף הצלחת QDB בתוך הצלחת היטב 96 למשך 2 דקות תחת טלטול מתמיד.
   3. הסר את לוחית QDB של הצלחת היטב 96 ו- shake בקצרה כדי להסיר את עודפי הנוזלים. מקם את הצלחת על צלחת לבנה microtiter.
   4. להפעיל את הקורא microplate ובחר "צלחת עם כיסוי" על ממשק המשתמש לפני הנחת הלוחות המשולב (QDB צלחת + מתאם צלחת לבנה) בתוך הקורא microplate על כימות.
      הערה: הקפד להשתמש במשטח לבן, שאינם שקופים microtiter בתור מתאם כדי למנוע כל הפרעה מהצלחת. הקפד לבחור "צלחת עם מכסה" כדי למנוע שיבוש המכונה בשילוב לוחות (QDB צלחת + 96 צלחת טוב מתאם) ממוקמים בתוך הקורא microplate.

תוצאות

קביעת הסכום מוחלטת של כל חלבון כולל החלבון CAPG ברקמות העכבר דורש של נוגדנים ספציפיים והן חלבון מטוהרים כסטנדרט. הטווח ליניארי של הניתוחים של החלבון סטנדרטיים והן את lysates גם צריך שתוקם לפני כל ניתוח בקנה מידה גדול. הטווח ליניארי של הנוגדן תלויה מאוד הנוגדן כשלעצמה, דילול המתאים טווח נוגדן ספציפי צריך להיות אומת על-ידי משתמש.

קודם קבענו יחודיות של הנוגדן CAPG העכבר כליה, רקמות טחול, הערמונית באמצעות ניתוח תספיג עם שליטה שלילי (BSA חינם IgG), בקרה חיובית (חלבון CAPG זמינים מסחרית) (איור 1א'). נוגדן anti-CAPG היה ספציפי נגד lysates העכבר הטחול, לב, שרירים, הערמונית (פס אחד זוהה). שאינם ספציפיים להקות נצפו ב lysates מן הכליות ואת הכבד. אולם, כליה lysate הלהקות שאינם ספציפיים היו באופן משמעותי יותר הלהקה ספציפיים, שמצביע על שהנוגדן מתאימה לניתוח רקמת הכליה חלש. בשלב הבא, הטווח ליניארי של החלבון הסטנדרטי ואת מידת lysates עבור ניתוחים נקבעו על ידי שתי עקומות מנה לצד השני. חלבון CAPG זמינים מסחרית היה באופן סדרתי מדולל כמצוין בטבלה 1 , על פי ניסיון העבר שלנו lysates את רקמת הכליה העכבר, הטחול ואת הערמונית היו גם מדולל מבוסס על כמות חלבון הכולל lysates נחושה על ידי ערכת נחישות BCA חלבון הכולל. שני מחקרים במינון לבצע על הצד, המותווה ביחד באיור 1ב'. הכמות המתאימה של lysates של העכבר כליות, טחול, הערמונית נבחרו בהתאם אותות QDB נמדדת לקורא microplate ביחידה שרירותי. הקריאה המקורית עבור ניסוי זה מוצג בטבלה3.

השלב האחרון, תקן באופן סדרתי מדוללת של חלבון CAPG, את lysates של העכבר כליות, טחול, הערמונית היו טעון לצלחת QDB. במקרה זה, בחרנו עומס 0.3 µg/דוגמת עבור lysates העכבר כליות, טחול, דוגמת 1/µg עבור lysates של העכבר ניתוח ערמונית, כמו גם ברמות האלה, הקריאה QDB לפחות 20-fold ברקע בזמן בתוך הטווח. ליניארית של ניתוח מבוסס על עקומת מינון של החלבון רגיל והן את lysates. הלוח היה נתון בפרוטוקול QDB תיאר לפני הלוח היה לכמת ישירות על-ידי הקורא microplate. בעזרת החלבון CAPG מטוהרת באופן סדרתי מדולל, אנו היתה אפשרות ליצור עקומת מנה-תגובה משוואה, R2 על ידי ניתוח רגרסיה פשוטה באמצעות תוכנה זמינים (כגון Microsoft office excel). QDB האותות lysates של העכבר כליות, טחולים, ערמונית התגיירו על כמות חלבון CAPG אלה lysates באמצעות המשוואה הוקמה מוחלטת, התוצאות תוקנו על ידי חלבון סה כ הסכום, במקרה זה, µg 0.3 עבור lysates מ העכבר טחולים הכליות ו µg 1 עבור lysates של בלוטת ערמונית העכבר, על הריכוז הסופי של החלבון CAPG ברקמות אלה כמו pg/µg. התוצאות מוצגות באיור איור 1C עם הקריאה המקורית המוצגת בטבלה 4.

איור 1 . נציג תוצאה של ניתוח QDB כדי לקבוע את רמות CAPG מוחלטת ברקמות העכבר שלוש (כליות, טחול, הערמונית). א בחינת יחודיות של נוגדן anti-CAPG הארנב באמצעות העכבר רקמת lysates מקריסטלים של הטחול, הלב שרירים, כליות, כבד ואת הערמונית באמצעות המערבי כתם ניתוח עם שליטה שלילי (BSA חינם IgG), בקרה חיובית (מסחרית זמין CAPG חלבון). B. הגדרת הבדיקות ליניארי טווח של QDB של הארנב נוגדן anti-CAPG באמצעות lysates מקריסטלים של הערמונית, כליות, טחול ושימוש טהור רקומביננטי CAPG חלבון סטנדרטית. התוצאות היו בממוצע triplicates. ג. קביעת מוחלטת של רמות CAPG lysates שהוכנו העכבר הכליות, טחולים, בלוטת ערמונית. כל עמודה מייצגת רקמת אחד מכל עכבר בודדות. התוצאות היו הממוצע של בשלושה עותקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

טבלה 3: כתוצאה microplate קורא המחקרים המינון ולהשתמש בשני באופן סדרתי מדולל, lysates במאגר של העכבר טחולים, כליות, ו בלוטת ערמונית מטוהרים חלבון רקומביננטי CAPG.

טבלה 4: תוצאה של הקורא microplate הניתוח QDB של רמת CAPG מוחלטת של העכבר הכליות (8), טחולים (4), בלוטת ערמונית (5) באמצעות חלבון רקומביננטי CAPG כסטנדרט.

Discussion

בין כל הנוכחי חומרים זמינים הטכניקות של אנליזת חלבונים חוץ אליסה, ניתוח QDB הוא השיטה היחידה להשגת המוחלט תכולת חלבון ספציפי ברמות הסלולר ורקמות בתבנית תפוקה גבוהה. למרות עם תקן התווית על-ידי איזוטופ יציב, ספקטרומטר מסה הוא מסוגל להשיג כימות מוחלטת של כמה חלבונים, שיטה זו לא עדיין מתוכנן לביצועים תפוקה גבוהה. במחקר זה, להדגים את התהליך של ניתוח QDB כדי להשיג קביעה מוחלטת של CAPG רמת החלבון ברקמות העכבר כולל כליות, טחול של הערמונית. רמות CAPG נמצאו להיות בין 200 ל 360 pg/g ברקמות הכליה העכבר, 460 ל 650 pg/g בהעכבר טחולים 330 כדי 390 pg/g ברקמות הערמונית עכבר.

בהשוואה לאליסה, ניתוח QDB דורש מאמץ מינימלי שפותחה במעבדה רגילה. ראשית, הצלחת QDB הוא בהתבסס על קרום ניטרוצלולוזה לחסל את הצעד ציפוי אליסה. שנית, ניתוח QDB מחייבת במקום שני נוגדנים ספציפיים בכריך אליסה. שלישית, הקיבולת מחייבת גבוהה של קרום ניטרוצלולוזה לעומת השטח צלחת אליסה גם מאפשר את הממברנה כדי לספוג את השלבים כביסה מחמירים המשמש בדרך כלל הניתוח immunoblot כדי להפחית את רעש רקע. תכונה זו שימושית מאוד בניתוח מסובך lysates מקריסטלים של תאים ורקמות. לעומת זאת, בשל הקיבולת קשירה נמוכה יחסית של חומרי ניקוי, ההפחתה של הרקע בעת ניתוח מסובך lysates הסלולר ורקמות הופך להיות אתגר אמיתי בתהליך התפתחותי.

QDB ניתוח יכול לאמץ בקלות במעבדה כלשהי עם הגישה של נוגדנים ספציפיים. עם זאת, חשוב לציין כי ייחודה של הנוגדן הוא מונח יחסי, מוגבל על ידי גורמים שונים, לרבות המינים, סוגי רקמות, סוגי תאים. כפי שמוצג באיור 1א, CAPG נוגדנים ספציפיים בעת ניתוח lysate העכבר כליות, טחול, הערמונית, עדיין הופך להיות לא ספציפית בעת ניתוח כבד עכבר. למעשה, באופן שגרתי מצאנו נוגדן אחד להיות ספציפי לסוג רקמה אחת, אבל לא תמיד ספציפי לסוג רקמה אחרים מאותו המין. לפיכך, ניתוח תספיג מוקדמת הוא הכרחי כדי להבטיח יחודיות של הניתוח QDB. למעשה, יחודיות היחסי של הנוגדן עשוי להיות הגורם של תוצאות שגויות קשורה לעיתים קרובות עם אליסה ניתוח, כפי ולא משנה כמה מאמץ החברה הייצור עשוי השקיעו כדי להבטיח יחודיות של וזמינותו, הם לא יכולים למצות בכל דרך אפשרית סוגי דוגמאות המשתמשים רשאים לנתח באמצעות המוצרים אליסה שלהם.

כמו עם כל immunoassays, בעיה פוטנציאלית עם שיטת הניתוח QDB היא חוסר עקביות של האיכות של הנוגדן מסחרי. גם אם האיכות לכאורה של נוגדן מאותו חברה (באותו קטלוג מספר, וכו ') משמשת, יכולים להיות הבדלים גדולים מרכישתה אחת לאחרת עקב השתנות אצווה-כדי-אצווה. לכן, אלא אם כן ביטחון מלא מושגת באיכות הנוגדן זמין, מחדש אפיון הנוגדן לאחר כל רכישה חשובה.

לסיכום, אנו מספקים כאן פרוטוקול מפורט לדוגמה כאשר באמצעות שיטת הניתוח QDB כדי להשיג נחישות כמותי מוחלט של חלבון ספציפי ברמת רקמות. אנו מראים כי שיטת הניתוח QDB הוא כלי נוח עבור כל מי שמעוניין תפוקה גבוהה, ניתוח כמותי immunoblot. יכולתה להשיג קביעה מוחלטת של התוכן של חלבון ספציפי ברמה הסלולר ורקמות להבחין גם טכניקה זו לבין טכניקות immunoblot המסורתי. תכונה זו מאפשרת שילוב של השוואה של תוצאות ניתוחים מרובים, צעד הכרחי במיוחד במחקרים אוכלוסייה גדולה יותר, המימוש של האגודה הרלוונטי ללימודי רמת החלבון בעתיד הקרוב.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microplate reader	Tecan	Tecan Infinite 200 PRO
QDB plate	Yantai Zestern Co.Ltd		Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net.
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)	jackson	711-035-152
Enhanced chemiluminesence substrate	Thermo	32134
Rabbit anti-CAPG	Sino Biologic Inc	14213-T52
CAPG protein	Sino Biologic Inc	14213-HNAE
Hepes	Sigma	H4034
Nacl	Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd	10461220
Mgcl2	Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd	20120802
EDTA	Sigma	E9884-500G
EGTA	Sigma	BNN1913
Na2P2O7	Haituo Chinese medicine test	20160914
Triton X-100	Sigma	T9284
Glycerol	Sigma	G7757
phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma	P7626-5G
pepstatin	Sigma	Z290033
leupeptin	Sigma	L2884
aprotinin	Sigma	A3428
Tris-Hcl	Sigma	T6455
SDS	Sigma	L5750-500G
DTT	Sigma	43815-1G
Bromphenol Blue	Sigma	B-0126
NaF	Sigma	S7920