Yüksek işlem hacmi, mutlak nicel nokta kullanarak doku düzeyleri, seçili bir Protein içeriği tayini Blot Analizi (QDB)

Özet

Burada biz ayrıntılı işlem nicel dot blot Analizi (QDB) mutlak içerik hedefli bir proteinin belirlenerek aktin proteini, gelsolin gibi (CAPG), üç farklı fare dokularda kapatma göstermek. Biz yüksek üretilen iş, cep ve doku düzeyinde biyomarker doğrulama için uygun, nicel immunoblot tekniği göstermektedir.

Özet

Uygun bir eksik, nicel, yüksek üretilen iş immunoblot yöntemi cep ve doku düzeyinde belirli bir protein içeriğinin mutlak belirlenmesi için önemli ölçüde proteomik araştırma sürüyor engellemektedir. Şu anda kullanılabilir immunoblot teknikleri elde edilen sonuçlar da bağımsız çalışmalar büyük ölçekli bir analiz protein örnekleri ile birleştirmek için her türlü çabanın önlenmesi, görecelidir. Bu çalışmada, nicel nokta leke analiz (QDB) yüksek işlem hacmi kartvizitlere mutlak miktar ulaşmak için süreci göstermektedir. Piyasada bulunan protein standardını kullanarak, biz aktin proteini, gelsolin gibi (CAPG) üç farklı fare dokuları (böbrek, dalak ve prostat) ile birlikte ayrıntılı bir hazırlanan protein örneklerinde kapatma mutlak içeriği tespit edebiliyoruz Deneysel detayları hakkında açıklama. Cep ve doku düzeyinde bireysel proteinlerin mutlak miktar uygun, nicel, yüksek üretilen iş immunoblot yöntemi olarak QDB analiz öneriyorum. Bu yöntem önemli ölçüde biyomarker doğrulama ve yol doğrulama çeşitli alanlarda biyolojik ve Biyomedikal araştırma yardımcı olacak.

Giriş

Yanında son yıllarda, heyecan verici gelişmeler genom araştırma ile Biyomedikal araştırma alanı da proteomik araştırma önemli gelişme şahit olur. Genomik hem de biyolojik veri birikimi artan ve proteomik düzeyleri, bu verileri çözümlemek için bioinformatic araçlarını kullanarak algılanabilir gelecekte Biyomedikal araştırma odak noktası haline gelmiştir. Sonuç olarak, biyolojik ve Biyomedikal Araştırma Topluluğu verilerden daha fazla ve daha iyi kalite için talep bioinformatical araştırma başarısı yükseltir, bir görev sadece teknik gelişme, genomik yoluyla elde edilebilir ve proteomik düzeyleri.

Kütle spektrometresi (MS) ve immunoblot analiz iki hakim protein analizi Şu anda tekniklerdir. MS proteomik araştırma analiz bireysel proteinler binlerce aynı anda etkinleştirmek için son yıllarda hakim olmuştur. Batı leke ve dot blot, dahil olmak üzere immunoblot tabanlı teknikleri, öte yandan da önemli bir rol protein araştırmada bile onun buluşu^1,2,3,4beri^{oynamıştır, 5}. Enzim immunosorbent assay (ELISA)^5,6,7 bağlantılı ve ters faz protein mikroarray (RPPM)^8,9 immunoblot yüksek aktarım biçimi olarak kabul edilebilir analiz. Ancak, bu immunoassay dışında tüm yöntemleri, ELISA, belirli bir protein göreli ifade düzeyini ölçmek. Analizi aynı anda birden fazla analizler aracılığıyla havuzu boyutunu artırmak için her türlü çabanın önleme yapmanız gerekir olarak bu yöntemler göreli niteliği Nüfus Etütleri, gerçek bir sorun olacaktır. Ayrıca, bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar yalnızca yarı kantitatif, böylece herhangi bir veri analizi Biyoinformatik çabalarında zorlaştıran vardır. Bu arada, ELISA yüksek işlem hacmi mutlak analiz protein örnekleri için uygun olsa da, bu teknik düşük bağlama kapasitesi ve¹⁰çoğullama nedeniyle hücre ve doku gibi karmaşık ortamlarda zorlukları karşılamak için gibi görünüyor.

Biz uygun, yüksek üretilen iş, nicel ve protein içeriği, mutlak belirlenmesi için uygun olma anahtar özelliklere sahip nüfus çalışmaları için uygun bir immunoblot yöntemi geliştirdik ve bu tekniği nicel nokta leke adlı analiz (QDB)¹¹. Bu çalışmada QDB analiz için detaylı bir protokol sunmak ve mutlak protein içeriği belirli bir protein, CAPG, böbrek, dalak ve prostat gibi üç farklı fare dokularda belirlenerek yöntemi gösterilmektedir. Biz bu detaylı protokolü de fizibilite ve bu yöntem kolaylık gösterir düşünüyorum ve bu yöntemin pratikte potansiyel tuzaklar önlemek nasıl bir kılavuz sağlamak.

Protokol

Tüm hayvan yordamlar Binzhou Tıp Üniversitesi hayvan kullanım yönergesi doğrultusunda yürütülen ve Binzhou Tıp Üniversitesi Etik İnceleme Kurulu tarafından onaylı.

1. numune hazırlama

1. 50 mg fare doku 1,5 mL tüp al. 200 µL lizis arabellek ekleyin (50 mM Hepes, pH 7.4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl₂, 10 mM Na₂P2O₇, % 1 Triton X-100, % 10 gliserol), proteaz ve fosfataz inhibitörleri (100 mM NaF, 0,1 mM phenylmethylsulfonyl ile desteklenmiştir Florür, 5 µg/mL pepstatin, 10 µg/mL leupeptin, 5 µg/mL aprotinin).
2. Buz üzerinde 1 min için bir homogenizer ile doku lunaparkçı.
3. Santrifüj 8 000 x g 4 ° C'de 10 dakika için
4. Süpernatant yeni tüpler içine (1,5 mL) toplamak ve protein konsantrasyonu tayini ile BCA teçhizat için 1 µL çıkar.
   Not: Western blot Analizi ve Dot blot analizi için tüm yaygın olarak kullanılan lizis arabellekleri QDB analizi için kullanılabilir.

2. belirlemek antikor özgüllük:

1. Örnek lysates (20 µg) bölümünde 1.4 hazırlamak, ücretsiz BSA IgG (20 µg), standart protein (600 sayfa), western blot analizi için.
   Not: IgG ücretsiz BSA bir negatif kontrol kullanılan ve standart protein olumlu bir denetim olarak kullanılır. Antikor özgüllük doğru boyutta western blot analizi ile bir grup göstererek gösterilmiştir.

3. QDB analiz doğrusal dizi tanımlama

1. GKD₂O. Dilute protein konsantrasyonu 1200 pg/µL için standart protein geçiyoruz.
2. Bölüm 1.4-4 µg/µL hazırlanan örneklerinde yoğun protein sulandırmak.
3. BSA GKD₂O. Dilute 1200 pg/µL ve 4 µg/µL konsantrasyon için protein ile geçiyoruz.
4. Seyreltme standart protein ve hazır örnekleri bir dizi Tablo 1 ve Tablo 2' nin rehberliğinde hazırlanan.
5. Mix 10 µL seyreltme standart protein veya seyreltme hazırlanan örnekleri ve arabellek yükleme x 10 µL 2 (120mM Tris-HCl pH 6.8, % 20 gliserol, % 4 SDS, %0,2 Bromphenol mavi, 200 mM DTT) birlikte.

	S1 (0pg/µl)	S2 (33.3pg / µl)	S3 (100pg/µl)	S3 (300pg/µl)	S5 (600pg/µl)	S6 (1200pg/µl)
Standart protein(1200pg/µl)	0	1.39	4,17	12,5	25	50
Ücretsiz BSA IgG (4pg/µl)	50	48.61	45.83	37.5	25	0
Toplam	50	50	50	50	50	50

Tablo 1. Seyreltme düzeni için standart protein eğrisi.

	X1 (0µg/µl)	X2 (0.25µg / µl)	X3 (0.5µg / µl)	X4 (1µg/µl)	X5 (2µg/µl)	X6 (4 µg/µl)
Sample(4µg/µL)	0	3.125	6.25	12,5	25	50
Ücretsiz BSA(4µg/µl) IgG	50	46.875	43.75	37.5	25	0
Toplam	50	50	50	50	50	50

Tablo 2. Seyreltme düzeni için hazırlanan örnekleri

6. Karışımlar 5 min için 85 ° C'de ısı.

4. QDB analiz süreci

1. Örnek uygulama
   1. Alt tablo yüzeylere plaka önlemek için QDB plaka destekler. Örneğin, bir boş pipet ucu kutusunu destek kullanın.
   2. En çok 2 µL örneği membran QDB plaka bireysel ünitenin alt ortasına yerleştirin.
2. Plaka kurutma
   1. 1 h için yüklenen QDB levha Oda ılıman (RT) bırakın veya alternatif olarak iyi havalandırılmış bir alanda 15 dakika 37 ° C'de yüklü plaka bırakın.
3. Plaka engelleme
   1. Aktarma arabelleği (0,039 M glisin, 0,048 M Tris, %0,37 SDS, % 20 metil alkol) QDB tabak daldırma ve yavaşça salla 10 plaka s.
   2. QDB plaka TBST ile nazikçe yıkayın (Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik, %0,1 ara 20) üç kez ve daha sonra yıkama plaka sabit sallayarak altında 5 dakika içinde TBST için.
   3. Engelleme arabellek ile QDB plaka engellemek (TBST % 5 yağsız süt (100 µL/de) sürekli sallayarak altında 1 h için.
4. Birincil antikor kuluçka
   1. Birincil antikor (1:500 için 1:5 000) dan seçilmiş bir konsantrasyon, engelleme arabellekte sulandırmak ve 100 µL sıradan bir 96 iyi plaka bireysel her şey için ekleyin. QDB plaka 96 iyi plaka yerleştirin ve kombine tabak 2 h RT veya gecede 4 ° C'de sabit sallayarak altında için kuluçkaya.
   2. Alternatif olarak, QDB plaka bir kutusunun içine yerleştirir ve aynı antikor için bütün tabağı kullanılırsa ile engelleme arabellek 2-3 mm plaka membran kısmı yukarıda kutusunu doldurun. Birincil antikor seçilen konsantrasyon ekleyin ve 2 h RT veya gecede 4 ° C'de sabit sallayarak altında tarafından için plaka kuluçkaya.
   3. Üç kez, her zaman sabit sallayarak altında 5 min için TBST ile yıkanır önce üç kez hafifçe TBST ile plaka durulayın.
5. İkincil antikor kuluçka
   1. İkincil antikor (1:1, 000 1:50, 000)'dan seçilmiş konsantrasyon ve her iki aliquot 100 µL/iyi engelleme arabellekte bir 96 iyi tabak içine veya bölümündeki 4.4.2 kutusunda açıklandığı gibi sulandırmak ve ikisinden biri içinde QDB plaka yüklü 96 iyi pla kuluçkaya te ya da kutusu RT sürekli sallayarak altında 1 h için.
   2. QDB plaka yavaşça 3 kez TBST ile durulama. sonra plaka 3 kez, 5 sabit sallayarak altında min için her TBST ile yıkayın.
6. Miktar
   1. Gelişmiş Kemiluminesan substrat (ECL) üreticinin yönergelerini izleyerek hazırlayın.
   2. 96 iyi plaka (100 µL/de) ve INSERT içinde sürekli sallayarak altında 2 dk 96 iyi plaka QDB plaka içine aliquot ECL alt katman.
   3. QDB plaka 96 iyi plaka ve kısaca aşırı sıvı kaldırmak için sallamak çıkarın. Beyaz microtiter plaka tabağa yerleştirin.
   4. Mikroplaka Okuyucu üzerinde açın ve miktar Mikroplaka Okuyucu içinde kombine tabak (QDB plaka + beyaz tabak adaptör) yerleştirmeden önce "plaka kapak ile" Kullanıcı arabirimi seçin.
      Not: Beyaz, şeffaf olmayan microtiter plaka plaka üzerinden herhangi bir girişimi engellemek için bir adaptör kullandığınızdan emin olun. "Kapak ile plaka" seçtiğinizden emin olun bir araya geldiğinde makine karıştırma önlemek için tabak (QDB plaka + 96 iyi plaka adaptörü) Mikroplaka Okuyucu içinde yerleştirilir.

Sonuçlar

CAPG protein fare dokusunda da dahil olmak üzere herhangi bir protein mutlak miktarı tayini standart olarak spesifik bir antikor ve saf protein gerektirir. Standart protein ve lysates analiz doğrusal dizi de büyük ölçekli herhangi bir analiz önce kurulabilmesi gerekir. Antikor doğrusal dizi başına antikor üzerinde son derece bağlıdır ve spesifik bir antikor uygun seyreltme aralığını her bireysel kullanıcı tarafından doğrulanması gerekir.

Biz ilk negatif kontrol (IgG ücretsiz BSA) ve olumlu denetim (ticari olarak mevcut CAPG protein) ile western blot analizi ile dalak ve prostat dokuları fare böbrek, CAPG antikor özgüllük tespit (Şekil 1A). Anti-CAPG antikor belirli fare dalak, kalp, kas ve prostat (bir grup tespit) lysates karşı. Spesifik olmayan bantları lysates böbrek ve karaciğer gözlendi. Ancak, böbrek lysate, belirsiz bantları önemli ölçüde antikor böbrek doku analizi için uygun olduğunu göstermektedir belirli Grup daha zayıf. Daha sonra standart protein ve lysates analizler için miktarı doğrusal dizi iki yan yana doz eğri tarafından tespit. Piyasada bulunan bir CAPG protein seri olarak bizim geçmiş deneyimler ve fare böbrek doku lysates temel Tablo 1 ' deki belirtildiği şekilde düşürülmüştü, dalak ve prostat da belirlenen lysates toplam protein miktarına göre seyreltilmiş BCA toplam protein tayini paketi tarafından. İki doz çalışmalar yan yana gerçekleştirilen ve birlikte çizilen Şekil 1' deB. Lysates fare böbrek, dalak ve prostat uygun miktarda rasgele biriminde Mikroplaka Okuyucu tarafından ölçülen QDB sinyalleri göre seçilmiştir. Bu deneme için özgün okuma Tablo 3' te gösterilmiştir.

Son adım, seri olarak seyreltilmiş CAPG protein standart ve lysates üzerinden fare böbrek, dalak ve prostat QDB tabağa doluydu. Bu seviyelerde QDB okuma, az 20 de aralığında doğrusal analiz ederken arka plan üzerinde olduğu gibi bu durumda, biz yük 0.3 µg/örnek lysates fare böbrek ve dalak için ve fare prostat analiz, lysates için 1 µg/örnek seçti lysates ve protein standart doz eğri dayalı. Plaka Mikroplaka Okuyucu tarafından sayısal önce plaka açıklanan QDB Protokolü maruz bırakıldı. Seri olarak seyreltilmiş saf CAPG protein kullanarak, biz bir doz-yanıt eğri, denklem ve R2 mevcut yazılım (örneğin Microsoft office excel) kullanarak basit regresyon analizi ile kurabilir. Dalağı ve prostat kurulan denklem kullanılarak bu lysates CAPG protein mutlak miktarı çevrildi ve sonuçları toplam protein miktarına göre bu durumda, lysates için 0.3 µg düzeltildi QDB fare böbrek, lysates sinyalleri fare dalağı ve böbrekler ve lysates pg/µg olarak bu dokularda CAPG protein konsantrasyonu final için fare prostat dan için 1 µg. Sonuçları Şekil 1' deC gösterilen özgün okuma ile gösterilmiştir Tablo 4.

Resim 1 . Üç fare dokularda (böbrek, dalak ve prostat) mutlak CAPG düzeylerini belirlemek için QDB analiz temsilcisi sonucu. A. tavşan anti-CAPG antikor fare doku lysates dalak hazırlanan kullanarak özgüllük inceleyerek, kalp, kas, böbrek, karaciğer ve Batı kullanarak prostat analizi negatif kontrol (IgG ücretsiz BSA) ve pozitif kontrol ile (ticari olarak leke kullanılabilir CAPG protein). B. tavşan anti-CAPG antikor prostattan hazırlanan lysates kullanarak QDB doğrusal Aralık analizleri tanımlama, böbrek, dalak ve kullanarak Rekombinant protein CAPG standart saf. Sonuçlar triplicates ortalaması alındı. C. fare böbrekler, dalağı ve prostat hazırlanan lysates seviyelerinde CAPG mutlak belirlenmesi. Her çubuk bireysel bir fare--dan bir doku temsil eder. Sonuçlar nüsha ortalaması alındı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 3: seri olarak seyreltilmiş, her iki kullanarak doz çalışmaların fare dalağı, böbrekler ve prostat ve saflaştırılmış rekombinant CAPG protein havuza alınan lysates Mikroplaka Okuyucu neden.

Tablo 4: Fare böbrekler (8), dalağı (4) ve rekombinant CAPG protein standart olarak kullanarak prostat (5) mutlak CAPG kademede QDB analizi sonucu Mikroplaka Okuyucu.

Tartışmalar

Tüm geçerli kullanılabilir immunoassay teknikleri protein analizi ELISA dışında arasında QDB analiz mutlak yüksek işlem hacmi formatında cep ve doku düzeyinde belirli bir protein içeriğini elde etmek için tek yöntemdir. Kararlı izotop etiketli standart ile kütle spektrometresi birkaç proteinlerin mutlak miktar ulaşmak mümkün olmakla birlikte, bu yöntem henüz yüksek verim performans için tasarlanmış değil. Bu çalışmada, böbrek, dalak ve prostat gibi fare dokularda CAPG protein düzeyinin mutlak kararlılık elde etmek için QDB analiz süreci gösterdi. CAPG düzeyleri 200-360 pg/g fare böbrek dokularda, 460-650 pg/g fare dalağı ve 330-390 pg/g fare prostat dokularında arasında bulunmuştur.

ELISA için karşılaştırıldığında, QDB analiz düzenli bir laboratuarda geliştirilecek için en az çaba gerektirir. İlk olarak, QDB bağlı olarak kaplama adım ELISA'ortadan kaldırmak için bir nitroselüloz membran plakadır. İkinci olarak, QDB analiz sadece bir sandviç ELISA iki belirli antikor yerine gerektirir. Üçüncü olarak, nitroselüloz membran ELISA plaka yüzeyi ile karşılaştırıldığında yüksek bağlama kapasitesi de genellikle arka plan müdahale azaltmak için immunoblot analizinde kullanılan sıkı çamaşır adımları dayanacak şekilde membran sağlar. Bu özellik çok karmaşık lysates hücre ve dokuların hazırlanan analiz yararlıdır. Buna ek olarak, ELISA plakaları nispeten düşük bağlama kapasitesi nedeniyle, gelişim sürecinin gerçek bir meydan okuma karmaşık cep ve doku lysates analiz ederken arka plan azalma olur.

QDB analiz kolayca spesifik antikor erişimi olan herhangi bir laboratuvarda kabul edilebilir. Ancak, antikor özgüllük türler, doku türleri ve hücre tipleri gibi faktörler tarafından sınırlı göreceli bir terim olduğunu belirtmek önemlidir. Şekil 1içindeAgösterildiği gibi CAPG antikor fare böbrek, dalak ve prostat lysate analiz ederken özeldir ve henüz fare karaciğer analiz ederken belirsiz hale gelir. Aslında, diğer doku türü için aynı türlerden bir doku türü için belirli olmak, ama her zaman belirli bir antikor rutin olarak bulduk. Böylece, önceki western blot Analizi QDB analiz özgüllük sağlamak gereklidir. Üretim şirketi geçirdim ne kadar çaba olursa olsun testin özgüllüğü sağlamak için onlar bütün olası egzoz olamaz gibi aslında, antikor göreli özgüllük çoğu ELISA analizi ile ilgili yanlış sonuçlar neden olabilir örnek kullanıcı türleri ELISA ürünlerini kullanarak analiz seçebilirsiniz.

QDB analiz yöntemi ile ilgili olası bir sorun ile tüm uzun gibi ticari antikor kalitesini tutarlılığını eksikliğidir. Olsa bile bir antikor aynı belirgin kalitesini şirket (aynı katalog numarası, vb.) kullanılan, büyük bir satın alma toplu iş toplu iş değişkenlik nedeniyle diğerine farklılıklar olabilir. Tam güven antikor mevcut kalitesinde elde sürece, bu nedenle, her satın alma üzerine antikor yeniden karakterize önemlidir.

Özetle, biz burada ayrıntılı bir protokol ve bir örnek ne zaman mutlak kantitatif tayin doku düzeyinde belirli bir protein elde etmek için QDB analiz yöntemi kullanarak sağlar. QDB analiz yöntemi yüksek işlem hacmi, nicel immunoblot analiz ilgilenen herkes için uygun bir araç olduğunu göstereceğiz. Cep ve doku düzeyinde belirli bir protein içeriğinin mutlak kararlılık elde etmek için onun yetenek aynı zamanda geleneksel immunoblot teknikleri bu teknik ayırt etmek. Kombinasyon ve karşılaştırma sonuçları birden fazla analizleri, bir adım daha büyük nüfus çalışmalarda özellikle gerekli ve yakın bir gelecekte ilgili dernek çalışmaları protein düzeyinde gerçekleşmesi için bu özellik sağlar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microplate reader	Tecan	Tecan Infinite 200 PRO
QDB plate	Yantai Zestern Co.Ltd		Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net.
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)	jackson	711-035-152
Enhanced chemiluminesence substrate	Thermo	32134
Rabbit anti-CAPG	Sino Biologic Inc	14213-T52
CAPG protein	Sino Biologic Inc	14213-HNAE
Hepes	Sigma	H4034
Nacl	Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd	10461220
Mgcl2	Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd	20120802
EDTA	Sigma	E9884-500G
EGTA	Sigma	BNN1913
Na2P2O7	Haituo Chinese medicine test	20160914
Triton X-100	Sigma	T9284
Glycerol	Sigma	G7757
phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma	P7626-5G
pepstatin	Sigma	Z290033
leupeptin	Sigma	L2884
aprotinin	Sigma	A3428
Tris-Hcl	Sigma	T6455
SDS	Sigma	L5750-500G
DTT	Sigma	43815-1G
Bromphenol Blue	Sigma	B-0126
NaF	Sigma	S7920