Hoher Durchsatz, Absolute Bestimmung des Inhalts eines ausgewählten Proteins auf Gewebe Ebenen mit quantitativen Dot Blot Analyse (QDB)

Zusammenfassung

Hier zeigen wir einen detaillierte Prozess der quantitativen Dot-Blot Analyse (QDB) durch die Bestimmung des absoluten Inhalts eines gezielten Proteins Deckelung Aktin Protein, Gelsolin erinnernden (CAPG), in drei verschiedenen Maus Geweben. Wir zeigen ein hoher Durchsatz, bequem, quantitative Immunoblot-Technik für die Validierung der Biomarker auf zelluläre und Gewebe.

Zusammenfassung

Fehlt eine bequeme, behindert quantitative, hohen Durchsatz Immunoblot Methode zur absoluten Bestimmung des Inhalts eines spezifischen Proteins Mobilfunk und Gewebe Ebene deutlich den Fortschritt in der Proteomik-Forschung. Ergebnisse von derzeit verfügbaren Immunoblot-Techniken abgeleitet sind auch relativ, Verhinderung jeglicher Bemühungen um unabhängige Studien mit einer umfangreichen Analyse der Proteinproben kombinieren. In der vorliegenden Studie zeigen wir den Prozess der quantitativen Dot-Blot Analyse (QDB), absolute Quantifizierung in einem hohen Durchsatz-Format zu erreichen. Mit einem im Handel erhältlichen Protein-Standard, sind wir in der Lage, den absoluten Inhalt der Deckelung Aktin Protein, Gelsolin erinnernden (CAPG) in Proteinproben von drei verschiedenen Maus-Gewebe (Niere, Milz und Prostata) zusammen mit einer detaillierten bestimmen Erklärung der experimentellen Details. Wir schlagen die QDB-Analyse als bequeme, quantitative, hohen Durchsatz Immunoblot Methode der absolute Quantifizierung der einzelnen Proteine auf Mobilfunk und Gewebe. Diese Methode wird im wesentlichen Biomarker Validierung und Verifizierung der Weg in den verschiedenen Bereichen der biologischen und biomedizinischen Forschung unterstützen.

Einleitung

Neben Zeugen biomedizinische Forschung mit der aufregenden Zuführungen in der Genomforschung in den letzten Jahren auch den bedeutenden Fortschritt in der Proteomik-Forschung. Mit zunehmender Anhäufung von biologischen Daten an beiden genomic und Proteomic Ebenen, im Mittelpunkt der biomedizinischen Forschung in der wahrnehmbaren Zukunft geworden mit bioinformatischen Tools, um diese Daten zu analysieren. Folglich, der Erfolg von laborprotokollen Forschung wirft Nachfrage für mehr und bessere Qualität der Daten aus der biologischen und biomedizinischen Forschung, eine Aufgabe kann nur erreicht werden, durch Weiterentwicklung der Technik bei genomischen und Proteomik.

Massenspektrometrie (MS) und Immunoblot Analyse sind derzeit zwei vorherrschenden Techniken der Proteinanalytik. MS hat in den letzten Jahren zur Analyse von Tausenden von einzelnen Proteine gleichzeitig ermöglichen die Proteomic Forschung dominiert. Der Immunoblot-basierten Techniken, einschließlich western-Blot und Dot-Blot, auf der anderen Seite haben auch eine bedeutende Rolle in der Proteinforschung sogar seit seiner Erfindung^{1,2,3,4gespielt, 5}. Enzym verbunden Immunosorbentprobe Assay (ELISA)^5,6,7 und umgekehrter Phase Protein Microarray (RPPM)^8,9 das Hochdurchsatz-Format der Immunoblot angesehen werden kann Analyse. Aber messen alle diese Immunoassay-Methoden außer ELISA, die relative Expression eines spezifischen Proteins. Die relative Natur dieser Methoden wird ein echtes Problem für Bevölkerungsstudien, wie die Analyse zum gleichen Zeitpunkt getan werden muss, alle Anstrengungen zur Erhöhung der Größe des Pools durch mehrere Analysen zu verhindern. Darüber hinaus sind die Ergebnisse aus diesen Studien abgeleitet nur semi-quantitativen, so komplizieren Bioinformatik Bemühungen in der Datenanalyse. Unterdessen zwar ELISA gut geeignet für hohen Durchsatz absolute Analyse der Proteinproben, scheint diese Technik, Herausforderungen in komplexen Umgebungen wie Zellen oder Gewebe wegen seiner niedrigen Bindungskapazität und multiplexing¹⁰entsprechen.

Wir entwickeln ein Immunoblot-Verfahren geeignet für Bevölkerungsstudien mit den wichtigsten Merkmalen, bequem, hoher Durchsatz, quantitative und eignet sich für absolute Bestimmung der Proteingehalt, und nannte diese Technik quantitative Dot-blot Analyse (QDB)¹¹. In dieser Studie wir präsentieren ein detailliertes Protokoll zur QDB-Analyse und die Methode durch die Bestimmung des absoluten Proteingehalts eines spezifischen Proteins CAPG, in drei verschiedenen Maus Gewebe einschließlich der Nieren, Milz und Prostata zu demonstrieren. Wir denken, dass dieses ausführliche Protokoll auch die Machbarkeit und den Komfort dieser Methode veranschaulicht und geben Hinweise auf die möglichen Fallstricke in der Praxis dieser Methode zu vermeiden.

Protokoll

Alle tierische Verfahren nach Binzhou Medizinische Universität Tier Verwendung Richtlinie durchgeführt und von der ethischen fachkollegiat Binzhou Medizinische Universität genehmigt.

1. die Probenvorbereitung

1. Nehmen Sie 50 mg Maus Gewebe in einem 1,5 mL Tube. Fügen Sie 200 µL Lyse Puffer (50 mM Hepes, pH 7,4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl₂, 10 mM Na₂P2O₇, 1 % Triton x-100, 10 % Glycerin), ergänzt mit Protease und Phosphatase-Inhibitoren (100 mM NaF, 0,1 mM Phenylmethylsulfonyl Fluorid, 5 µg/mL Pepstatin, 10 µg/mL Leupeptin, 5 µg/mL Aprotinin).
2. Das Gewebe mit einem Homogenisator für 1 min auf Eis zu homogenisieren.
3. Zentrifuge für 10 min bei 8 000 x g bei 4 ° C.
4. Sammeln des Überstands in neue Schläuche (1,5 mL) und 1 µL für Protein-Konzentration-Assay mit BCA Kit herausnehmen.
   Hinweis: Alle gängigen Lyse-Puffer für western-Blot und Dot-Blot Analyse können für QDB Analyse verwendet werden.

2. Bestimmung der Spezifität der Antikörper

1. Bereiten Sie Probe Lysates (20 µg) in Abschnitt 1.4, IgG kostenlose BSA (20 µg) standard Protein (600 Pg), western-Blot Analyse.
   Hinweis: IgG kostenlose BSA dient als Negativkontrolle und das standard-Protein dient als Positivkontrolle. Die Spezifität des Antikörpers wird durch ein Band der richtige Größe mit der western-Blot Analyse zeigt gezeigt.

3. Definition des linearen Bereichs der QDB Analyse

1. Lösen Sie das standard-Protein mit DdH₂O. verdünnt das Protein zu einer Konzentration von 1.200 Pg/µL.
2. Verdünnen Sie das konzentrierte Protein aus den vorbereiteten Proben in Abschnitt 1.4 bis 4 µg/µL.
3. Lösen Sie die BSA mit DdH₂O. verdünnt das Protein zu einer Konzentration von 1.200 Pg/µL und 4 µg/µL.
4. Eine Reihe von Verdünnung von standard Protein und vorbereiteten Proben waren bereit, unter der Leitung von Tabelle 1 und Tabelle 2.
5. Proben und 10 µL 2 x Ladepuffer Mix 10 µL Verdünnung standard Protein oder Verdünnung vorbereitet (120mM Tris-HCl pH 6,8, 20 % Glycerin, 4 % SDS, 0,2 % Bromphenol blau, 200 mM DVB-t) zusammen.

	S1 (0pg/µl)	S2 (33.3pg / µl)	S3 (100pg/µl)	S3 (300pg/µl)	S5 (600pg/µl)	S6 (1200pg/µl)
Standard protein(1200pg/µl)	0	1.39	4.17	12.5	25	50
Kostenlose BSA igG (4pg/µl)	50	48.61	45.83	37,5	25	0
insgesamt	50	50	50	50	50	50

Tabelle 1. Verdünnung Schema für standard Protein Kurve.

	X1 (0µg/µl)	X2 (0.25µg / µl)	X3 (0.5µg / µl)	X4 (1µg/µl)	X5 (2µg/µl)	X6 (4 µg/µl)
Sample(4µg/µl)	0	3,125	6.25	12.5	25	50
Kostenlose BSA(4µg/µl) igG	50	46.875	43.75	37,5	25	0
insgesamt	50	50	50	50	50	50

Tabelle 2. Verdünnung Schema für vorbereiteten Proben

6. Erhitzen Sie die Mischungen bei 85 ° C für 5 min.

4. Ablauf der QDB Analyse

1. Beispielanwendung
   1. Unterstützen Sie die QDB-Platte um die Unterseite der Platte berühren der Oberfläche des Tisches zu vermeiden. Zum Beispiel verwenden Sie eine leere Pipette-Info-Feld als Unterstützung.
   2. Laden Sie bis zu 2 µL der Probe in die Mitte der Membran an der Unterseite der einzelnen Einheit der QDB-Platte.
2. Trocknung der Plattenrandes
   1. Die geladene QDB-Platte für 1 h bei temperierten Raum (RT) oder als Alternative verlassen Sie die geladene Platte bei 37 ° C für 15 min in einem gut belüfteten Raum.
3. Sperrung der Plattenrandes
   1. Tauchen Sie die QDB-Platte in den Transfer-Puffer (0,039 M Glycin, 0,048 M Tris, 0,37 % SDS, 20 % Methylalkohol) und schütteln die Platte für 10 s.
   2. Spülen Sie die QDB-Platte vorsichtig mit TBST (Tris-gepufferte Kochsalzlösung, 0,1 % Tween 20) dreimal und dann waschen der Platte für 5 min in TBST unter Konstanten schütteln.
   3. Die QDB-Platte mit blockierenden Puffer zu blockieren (5 % Magermilch in TBST (100 µL/Well) für 1 h unter Konstanten schütteln.
4. Primärantikörper Inkubation
   1. Verdünnen Sie den primären Antikörper in den blockierenden Puffer bei einer gewählten Konzentration (von 1:500 bis 1:5 000), und geben Sie 100 µL in jedem einzelnen eine gewöhnliche 96-well-Platte. Legen Sie die QDB-Platte in der 96-well-Platte und inkubieren Sie die kombinierten Platten entweder für 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 ° C unter Konstanten schütteln.
   2. Alternativ legen Sie die QDB-Platte in einer Schachtel, und füllen Sie das Feld mit blockierenden Puffer 2 bis 3 mm über dem Membran-Teil der Platte, wenn die gleichen Antikörper für die ganze Platte verwendet wird. Fügen Sie den primären Antikörper bei der gewählten Konzentration und inkubieren Sie die Platte entweder für 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 ° C durch unter Konstanten schütteln.
   3. Spülen Sie die Platte vorsichtig mit TBST dreimal bevor es dreimal, jeweils 5 min unter Konstanten schütteln mit TBST gewaschen wird.
5. Sekundäre Antikörper Inkubationszeit
   1. Verdünnen Sie der Sekundärantikörper in den blockierenden Puffer bei der gewählten Konzentration (von 1:1 000 um 01:50, 000) und entweder aliquoten 100 µL/Well in eine 96-well-Platte oder in einer Box wie beschrieben in Abschnitt 4.4.2 und dann Brüten Sie der QDB-Platte innen entweder die geladenen 96 gut pla Te oder die Box für 1 h bei RT unter Konstanten schütteln.
   2. Spülen Sie die QDB-Platte vorsichtig 3mal mit TBST ab, dann waschen Sie die Platte für 3 mal 5 min pro mit TBST unter Konstanten schütteln.
6. Quantifizierung
   1. Bereiten Sie verstärkte Chemilumineszenz Substrat (ECL), indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen.
   2. Aliquoten ECL-Substrat zu einem 96 well-Platte (100 µL/Well) und legen Sie die QDB-Platte im Inneren der 96-well-Platte für 2 min. unter ständigen schütteln.
   3. Entfernen Sie die QDB-Platte aus 96 well-Platte und schütteln kurz um die überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Legen Sie die Platte auf einer weißen Mikrotiterplatte.
   4. Schalten Sie den Mikrotestplatte Leser, und wählen Sie "Teller mit Deckel" auf der Benutzeroberfläche vor Platzierung der kombinierten Platten (QDB-Platte + weiße Platte Adapter) im Inneren der Mikrotestplatte Leser zur Quantifizierung.
      Hinweis: Achten Sie darauf, die weißen, undurchsichtigen Mikrotiterplatte als einen Adapter verwenden, um Störungen von der Platte zu vermeiden. Achten Sie darauf, wählen "Teller mit Deckel" um zu vermeiden, Verklemmen der Maschine in Kombination Teller (QDB-Platte + 96-well-Platte Adapter) werden innerhalb der Mikrotestplatte Leser gesetzt.

Ergebnisse

Die Bestimmung der absoluten Höhe der jedes Protein, einschließlich des CAPG-Proteins im Maus-Gewebe erfordert einen spezifischen Antikörper und ein gereinigtes Protein als Standard. Des linearen Bereichs der Analysen der standard Protein und die Lysates muss auch vor eine groß angelegte Analyse eingerichtet werden. Des linearen Bereichs des Antikörpers ist stark abhängig von der Antikörper per se, und das entsprechende Verdünnung an einen spezifischen Antikörper müssen von jedem einzelnen Benutzer überprüft werden.

Wir zunächst ermittelt die Spezifität des Antikörpers CAPG in Mausniere, Milz und Prostata Gewebe mit western-Blot Analyse mit der Negativkontrolle (IgG kostenlose BSA) und Positivkontrolle (handelsübliche CAPG Protein) (Abb. 1A). Der Antikörper Anti-CAPG war spezifisch gegen Lysaten aus Maus Milz, Herz, Muskeln und Prostata (ein Band erkannt). Unspezifische Bänder wurden in Lysaten aus Niere und Leber beobachtet. Allerdings waren die unspezifische Bänder in Niere lysate, deutlich schwächer als die spezifischen Band, was darauf hindeutet, dass die Antikörper für Niere gewebeanalysen eignet. Als nächstes des linearen Bereichs des Proteins standard und die Höhe der Lysates für Analysen wurden durch zwei nebeneinander Dosis-Kurven ermittelt. Ein handelsübliches CAPG Protein wurde seriell verdünnt, wie in Tabelle 1 bezogen auf unsere Erfahrungen und die Gewebe-Lysaten der Mausniere, Milz und Prostata wurden auch verdünnt, bezogen auf die Menge der Gesamt-Protein in der Lysates bestimmt durch ein BCA Gesamtprotein Entschlossenheit Kit. Zwei Dosis Studien wurden nebeneinander durchgeführt und in Abbildung 1Bzusammen gezeichnet. Die entsprechende Menge an Lysates Mausniere, Milz und Prostatakrebs wurden basierend auf den QDB Messsignalen Mikrotestplatte Leser in willkürliche Einheit gewählt. Die ursprüngliche Lesart für dieses Experiment ist in Tabelle 3dargestellt.

In den letzten Schritt, die seriell verdünnten CAPG Protein Standard und Lysaten aus Mausniere wurden Milz und Prostata auf die QDB-Platte geladen. In diesem Fall haben wir Last 0,3 µg/Probe für Lysates aus Mausniere und Milz und 1 µg/Probe für Lysates aus Maus Prostata Analyse, wie auf diesen Ebenen die QDB-Lesung am mindestens 20-fache über dem Hintergrund während gut innerhalb des linearen Bereichs der Analyse basierend auf der Dosis-Kurve die Lysates und das Protein standard. Die Platte wurde des beschriebenen QDB-Protokolls unterzogen, bevor die Platte direkt vom Leser Mikrotestplatte quantifiziert wurde. Mit der seriell verdünnt gereinigtes CAPG Protein, konnten wir aufbauen einer Dosis-Wirkungs-Kurve, die Gleichung und R2 durch einfache Regressionsanalyse mit verfügbaren Software (z. B. Microsoft Office excel). Die QDB Signale von Lysaten von Maus Nieren, Milz und Prostata wurden auf die absolute Menge des Proteins CAPG in diese Lysates unter Verwendung der etablierten Gleichung umgestellt, und die Ergebnisse wurden durch die Gesamt-Protein-Menge, in diesem Fall 0,3 µg für Lysates aus korrigiert Maus-Milz und Nieren und 1 µg für Lysates aus Maus Prostata für die letztendliche Konzentration des Proteins CAPG in diesen Geweben als Pg/µg. Die Ergebnisse sind in Abbildung 1C mit die ursprüngliche Lesart angezeigt dargestellt Tabelle 4.

Abbildung 1 . Repräsentatives Ergebnis einer QDB-Analyse zur Bestimmung der absoluten CAPG Ebenen in drei Maus Geweben (Niere, Milz und Prostata). A. Untersuchung der Spezifität der Kaninchen Anti-CAPG Antikörper mit Maus Gewebe Lysates vorbereitet aus Milz, Herz, Muskel, Niere, Leber und Prostata mit westlichen blot Analyse mit der Negativkontrolle (IgG kostenlose BSA) und Positivkontrolle (kommerziell verfügbaren CAPG Protein). B. Definition der linearen Bereich QDB Analysen der Kaninchen Anti-CAPG Antikörper mit Lysates vorbereitet von Prostata, Niere, Milz und mit gereinigt rekombinante CAPG Protein standard. Die Ergebnisse waren durchschnittlich Triplicates. C. Absolute Bestimmung der CAPG in Lysaten aus Maus Nieren, Milz und Prostata vorbereitet. Jeder Balken repräsentiert ein Gewebe aus einer einzelnen Maus. Die Ergebnisse wurden im Durchschnitt von dreifacher Ausfertigung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 3: Ergeben Sie sich aus Mikrotestplatte Leser der Dosis Studien mit beiden seriell verdünnt, gepoolte Lysates aus Maus Milz, Nieren und Prostata und gereinigtes rekombinante CAPG Protein.

Tabelle 4: Ergebnis von Mikrotestplatte Leser der QDB-Analyse von der absoluten Höhe der CAPG in Maus Nieren (8), Milz (4) und Prostata (5) mit Hilfe eines rekombinanten Proteins CAPG serienmäßig.

Diskussion

Unter all den aktuellen verfügbaren Immunoassay Techniken der Proteinanalytik mit Ausnahme von ELISA ist QDB Analyse die einzige Methode zur absoluten Inhalt eines spezifischen Proteins auf Zell- und Gewebe Ebenen in einem hohen Durchsatz-Format zu erreichen. Obwohl mit stabilen Isotopen-Label Standard, Massenspektrometrie in der Lage, absolute Quantifizierung von ein paar Proteine zu erreichen ist, ist diese Methode noch nicht für hohe Durchsatzleistung entwickelt. In dieser Studie haben wir den Prozess der QDB Analyse zur absoluten Bestimmung der CAPG Protein-Ebene in Maus Gewebe einschließlich der Nieren, Milz und Prostata zu erreichen. CAPG Ebenen erwiesen sich zwischen 200 bis 360 Pg/g in Maus Niere Geweben, 460 bis 650 Pg/g in Maus Milz und 330 bis 390 Pg/g in Maus Prostata Gewebe.

Im Vergleich zu ELISA, erfordert QDB Analyse minimale Anstrengungen in einem normalen Labor entwickelt werden. Erstens ist die QDB-Platte eine basiert auf eine Nitrocellulose-Membran den Beschichtung Schritt bei ELISA zu beseitigen. Zweitens erfordert QDB Analyse nur eine statt zwei spezifische Antikörper in einem Sandwich ELISA. Drittens ermöglicht die hohe Bindungskapazität der Nitrozellulose-Membran im Vergleich zu der ELISA-Platte-Oberfläche auch die Membran gegen die strengen Waschschritte, die normalerweise in der Immunoblot Analyse verwendet, um den Hintergrund Störungen zu reduzieren. Diese Funktion ist sehr nützlich bei der Analyse von komplizierterer Lysates aus Zellen und Geweben hergestellt. Im Gegensatz dazu wird die Reduzierung des Hintergrunds bei der Analyse der komplizierten Mobilfunk und Gewebe Lysates aufgrund der relativ geringen Bindungskapazität von ELISA-Platten, eine echte Herausforderung in den Entwicklungsprozess.

QDB-Analyse kann problemlos in jedem Labor beim Zugriff auf einen spezifischen Antikörper übernommen werden. Es ist jedoch wichtig zu erwähnen, dass die Spezifität des Antikörpers ein relativer Begriff ist, durch Faktoren wie die Art, die Gewebetypen und Zelltypen begrenzt. Wie in Abbildung 1Agezeigt, CAPG Antikörper ist spezifisch, bei der Analyse der lysate aus Mausniere, Milz und Prostata, und noch wird unspezifisch bei der Analyse der Maus Leber. In der Tat fanden wir routinemäßig einen Antikörper spezifisch für einen Gewebetyp, aber nicht immer konkrete zu anderen Gewebetyp von derselben Art sein. So ist die vorherige western-Blot Analyse notwendig, um die Spezifität der QDB Analyse zu gewährleisten. In der Tat kann die relative Spezifität des Antikörpers die falsche Ergebnisse, die oft im Zusammenhang mit ELISA Analyse verursachen wie egal wie viel Mühe die Herstellerfirma kann verbracht haben um die Spezifität des Assays, gewährleisten sie alle möglichen erschöpfen kann nicht Arten von Proben die Benutzer können mit ihren ELISA-Produkten zu analysieren.

Wie bei allen Immunoassays, ist möglicherweise ein Problem mit der QDB-Analyse-Methode die fehlende Konsistenz der Qualität des kommerziellen Antikörpers. Auch wenn die scheinbare Qualität eines Antikörpers aus der gleichen Firma (gleiche Katalog, usw.) wird verwendet, könnte es große Unterschiede von einem Kauf zum anderen aufgrund der Variabilität von Charge zu Charge. Daher, wenn volles Vertrauen in die Qualität der verfügbaren Antikörper erreicht wird, ist neu Charakterisierung des Antikörpers bei jedem Einkauf wichtig.

Zusammenfassend lässt sich sagen stellen wir hier ein detailliertes Protokoll und ein Beispiel, wenn die QDB-Analyse-Methode verwenden, um absolute quantitative Bestimmung eines spezifischen Proteins Ebene der Gewebe zu erreichen. Wir zeigen, dass die QDB-Analyse-Methode ein praktisches Werkzeug für jedermann ist, hoher Durchsatz, quantitative Immunoblot Analyse interessiert ist. Dessen Eignung zur Sicherstellung der unbedingte Wille des Inhalts eines spezifischen Proteins Mobilfunk und Gewebe Ebene auch zeichnen diese Technik aus traditionellen Immunoblot-Techniken. Diese Funktion ermöglicht die Kombination und Vergleich der Ergebnisse aus mehreren Analysen, ein Schritt notwendig, vor allem in größeren Bevölkerungsstudien und die Realisierung von relevanten Assoziationsstudien auf proteinebene in naher Zukunft.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microplate reader	Tecan	Tecan Infinite 200 PRO
QDB plate	Yantai Zestern Co.Ltd		Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net.
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)	jackson	711-035-152
Enhanced chemiluminesence substrate	Thermo	32134
Rabbit anti-CAPG	Sino Biologic Inc	14213-T52
CAPG protein	Sino Biologic Inc	14213-HNAE
Hepes	Sigma	H4034
Nacl	Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd	10461220
Mgcl2	Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd	20120802
EDTA	Sigma	E9884-500G
EGTA	Sigma	BNN1913
Na2P2O7	Haituo Chinese medicine test	20160914
Triton X-100	Sigma	T9284
Glycerol	Sigma	G7757
phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma	P7626-5G
pepstatin	Sigma	Z290033
leupeptin	Sigma	L2884
aprotinin	Sigma	A3428
Tris-Hcl	Sigma	T6455
SDS	Sigma	L5750-500G
DTT	Sigma	43815-1G
Bromphenol Blue	Sigma	B-0126
NaF	Sigma	S7920