높은 처리량, 양적 도트를 사용 하 여 조직 수준에서 선택 된 단백질의 내용의 절대 결정 오 점 분석 (QDB)

요약

여기 설명 양적 점 오 점 분석 (QDB)의 상세한 과정 대상된 단백질의 절대 내용을 확인 하 여 상한 걸 단백질, 3 개의 다른 마우스 조직에서 gelsolin 같은 (CAPG), 합니다. 높은 처리량, 세포 및 조직 수준에서 바이오 마커 검증에 대 한 편리 하 고, 양적 immunoblot 기술을 설명합니다.

초록

세포 및 조직 수준에서 특정 단백질의 내용의 절대 결심을 위한 양적, 높은 처리량 immunoblot 방법은 크게 proteomic 연구에서 진행 지장을 초래할 수는 편리한 부족. 현재 사용 가능한 immunoblot 기법에서 파생 된 결과 상대, 대규모 분석 단백질 견본을 가진 독립적인 연구를 결합 하는 어떤 노력 든 지 방지도 있습니다. 이 연구에서 양적 점 오 점 분석 (QDB) 높은 처리량 형태로 절대 정량화를 달성 하기의 과정을 설명 합니다. 우리는 상한 걸 단백질, 단백질 견본 함께 상세한 3 다른 마우스 조직 (신장, 비장, 그리고 전립선)에서 준비에 gelsolin 같은 (CAPG)의 절대 콘텐츠를 확인할 수 있습니다 상용 단백질 표준을 사용 하 여, 실험 내용을 설명. 우리는 세포와 조직 수준에서 개별 단백질의 절대 정량화의 편리 하 고, 양적, 높은 처리량 immunoblot 방법으로 QDB 분석을 제안합니다. 이 방법은 바이오 마커 검증 및 생물 학적 및 생물 의학 연구의 다양 한 분야에서 경로 확인에 실질적으로 도움이 됩니다.

서문

와 함께 최근 몇 년 동안, 게놈 연구에 흥미 진 진한 발전와 생물 의학 연구 분야 또한 증인 proteomic 연구에 중요 한 발전. 둘 다 게놈 생물학 데이터의 축적을 증가 함께 및 proteomic 수준 인지할 미래에 생물 의학 연구의 초점이 되었다 bioinformatic 공구를 사용 하 여 이러한 데이터를 분석. 따라서, bioinformatical 연구의 성공을 점점 더 나은 품질의 생물 학적 및 생물 의학 연구 커뮤니티에서 데이터에 대 한 수요를 제기, 작업 게놈에서 기술 발전을 통해 달성 될 수 있다 및 proteomic 수준.

질량 분석 (MS)와 immunoblot 분석 단백질 분석의 두 가지 일반적인 기술을 현재 있습니다. MS는 동시에 개별 단백질의 수천의 분석을 가능 하 게 최근 몇 년 동안에서 proteomic 연구를 지배 했다. Immunoblot 기반 기술을, 포함 서쪽 오 점 및 점 오 점, 다른 한편으로, 또한 역할 중요 한 단백질 연구에 그것의 발명^{1,2,,34, 이후도 5}. 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)^5,,67 와 역 위상 단백질 microarray (RPPM)^8,9 immunoblot의 높은 처리량 형식으로 간주 될 수 있습니다. 분석입니다. 그러나, ELISA, 제외 하 고 이러한 모든 immunoassay 방법을 특정 단백질의 상대적 식 수준을 측정합니다. 분석 여러 분석을 통해 풀 크기를 증가 시키는 어떤 노력 든 지 방지를 동시에 수행 되어야 합니다 이러한 방법의 상대적인 자연 인구 연구에 대 한 진짜 문제가 될 것입니다. 또한, 이러한 연구에서 파생 된 결과 반 정량, 따라서 데이터 분석에서 어떤 생물 정보학의 노력을 복잡 하 게만. 한편, ELISA는 높은 처리량 절대 분석 단백질 견본을 위한 적합,이 기술은 낮은 바인딩 용량 및 멀티플렉싱¹⁰세포 또는 조직 같은 복잡 한 환경에서 과제를 충족 것으로 보인다.

우리 단백질 함량의 절대 측정에 적합 하 고 양적, 편리 하 고, 높은 처리량의 주요 특성을 가진 인구 연구에 적합 한 immunoblot 방법을 개발 하 고 명명 된이 기술은 양적 점 오 점 분석 (QDB)¹¹. 이 연구에서 우리는 QDB 분석에 대 한 상세한 프로토콜을 제시 하 고 특정 단백질의, CAPG, 신장, 비장, 전립선 등 세 가지 다른 마우스 조직에 절대 단백질 함량을 결정 하 여 메서드를 보여 줍니다. 우리가 생각 하는이 상세한 프로토콜을 잘 타당성과이 방법의 설명이 방법의 연습에서 잠재적인 함정을 피하기 위해 하는 방법에 지침을 제공 하 고.

프로토콜

모든 동물 절차 Binzhou 의료 대학 동물 사용 지침에 따라 실시 되었고 Binzhou 의과대학의 윤리적 검토 위원회에 의해 승인.

1. 샘플 준비

1. 1.5 mL 튜브에 50mg 마우스 조직 고려. 200 µ L 세포의 용 해 버퍼를 추가 (50 mM Hepes, pH 7.4, 137 m m NaCl, 5 mM EDTA, 5mm EGTA, 1 mM MgCl₂, 10 m m 나₂P2O₇, 1% 트라이 톤 X-100, 10% 글리세롤), 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제제 (100 m m NaF, 0.1 m m phenylmethylsulfonyl와 보충 불 소, 5 µ g/mL pepstatin, 10 µ g/mL leupeptin, 5 µ g/mL aprotinin).
2. 얼음에 1 분 동안 균질 화기로 조직 균질.
3. 4 ° c.에 8 000 x g에서 10 분 원심 분리기
4. 새로운 튜브 (1.5 mL)에 상쾌한을 수집 하 고 1 µ L BCA 키트 단백질 농도 분석 결과 대 한 밖으로.
   참고: 서쪽 오 점 분석 및 점 오 점 분석에 대 한 모든 일반적으로 사용 되 세포의 용 해 버퍼 QDB 분석에 사용할 수 있습니다.

2. 항 체의 특이성을 결정

1. 1.4 단원의 샘플 lysates (20 µ g)을 준비, 무료 BSA IgG (20 µ g), 서쪽 오 점 분석을 위한 표준 단백질 (600 페이지).
   참고: IgG 무료 BSA 부정적인 제어로 사용 되 고 표준 단백질 긍정적인 컨트롤로 사용 됩니다. 항 체의 특이성은 서쪽 오 점 분석을 사용 하 여 적당 한 크기의 한 밴드를 표시 하 여 보여 줍니다.

3. QDB 분석의 선형 범위 정의

1. DdH₂O. Dilute 1200 pg / µ L의 농도에 단백질 표준 단백질 분해.
2. 섹션 4에 1.4 µ g / µ L의 준비 된 샘플에서 집중된 단백질을 희석.
3. BSA ddH₂O. Dilute 1200 pg / µ L와 4 µ g / µ L의 농도에 단백질 분해.
4. 표준 단백질 및 준비 샘플의 희석의 시리즈는 표 1 과 표 2의 지도 함께 준비 되었다.
5. 혼합 10 µ L 희석 표준 단백질 또는 희석 준비 샘플 및 버퍼 로드 x 10 µ L 2 (120 mM Tris HCl pH 6.8, 20% 글리세롤, 4 %SDS, 0.2 %Bromphenol 블루, 200mm DTT) 함께.

	S1 (0pg / µ l)	S2 (33.3pg / µ l)	S3 (100pg / µ l)	S3 (300pg / µ l)	S5 (600pg / µ l)	S6 (1200pg / µ l)
표준 protein(1200pg/µl)	0	1.39	4.17	12.5	25	50
무료 BSA igG (4pg / µ l)	50	48.61	45.83	37.5	25	0
총	50	50	50	50	50	50

표 1입니다. 표준 단백질 곡선에 대 한 희석 체계입니다.

	X1 (0µg / µ l)	X2 (0.25µg / µ l)	X3 (0.5µg / µ l)	X4 (1µg / µ l)	X5 (2µg / µ l)	X6 (4 µ g / µ l)
Sample(4µg/µl)	0	3.125	6.25	12.5	25	50
무료 BSA(4µg/µl) igG	50	46.875	43.75	37.5	25	0
총	50	50	50	50	50	50

표 2입니다. 준비 된 샘플에 대 한 희석 체계

6. 5 분 동안 85 ° C에 혼합물이 열.

4입니다. QDB 분석의 과정

1. 샘플 응용 프로그램
   1. 테이블의 표면을 접시의 바닥을 피하기 위해 QDB 접시를 지원 합니다. 예를 들어, 빈 피 펫 팁 상자를 사용 하 여 지원.
   2. QDB 플레이트의 개별 단위의 맨 아래에 막의 중심을 샘플의 최대 2 µ L을 로드 합니다.
2. 접시 건조
   1. 룸 온대 (RT)에서 1 시간에 대 한 로드 QDB 접시를 두고 또는 환기가 공간에서 15 분 동안 37 ° C에서 로드 된 접시 안으로 두고.
3. 접시를 차단
   1. 전송 버퍼 (0.039 M 글리신, 0.048 M Tris 0.37 %SDS, 20% 메 틸 알콜)에 QDB 접시를 찍어와 부드럽게 흔들어 10 접시 s.
   2. 린스 부드럽게 TBST 가진 QDB 플레이트 (식 염 수, 0.1 %Tris 버퍼 트윈 20) 세 번 및 다음 세척 일정 떨고 아래 TBST에 5 분 동안 접시.
   3. QDB 플레이트 블로킹 버퍼와 차단 (TBST에 5% 탈지 우유 (100 µ L/잘) 상수 떨고 아래 1 h.
4. 1 차적인 항 체 외피
   1. (1: 1:5 000 500)에서 선택한 농도에서 블로킹 버퍼에 1 차적인 항 체를 희석 하 고 일반 96 잘 접시의 각 개별 음을 100 µ L를 추가 합니다. 96 잘 접시에 QDB 플레이트를 삽입 하 고 결합된 플레이트 RT 또는 하룻밤 상수 떨고 아래 4 ° C에서 2 시간에 대 한 중 하나를 품 어.
   2. 또는 QDB 접시, 상자 안에 놓고 전체 접시 같은 항 체를 사용 하는 경우 블로킹 버퍼 판의 막 부분 위에 2 ~ 3 mm와 상자를 작성 합니다. 선택한 농도에서 1 차적인 항 체를 추가 하 고 접시 RT 또는 하룻밤 상수 떨고 아래 여 4 ° C에서 2 시간에 대 한 중 하나를 품 어.
   3. 세 번, 일정 떨고 아래 5 분 동안 각 시간에 대 한 TBST를 가진 씻어 전에 세 번에 대 한 부드럽게 TBST 가진 접시를 헹 구 십시오.
5. 2 차 항 체 외피
   1. 2 차 항 체 (1:1, 000 1:50, 000에)에서 선택한 농도 및 중 aliquot 100 µ L/잘 차단 버퍼에 96 잘 접시 또는 4.4.2, 단원의 설명 대로 상자에 희석 하 고 중 하나 내부 QDB 접시를 로드 96 잘 pla 품 어 테 나 상수 떨고 아래 RT에 1 시간에 대 한 상자.
   2. QDB 플레이트 부드럽게 3 회로 씻어 TBST, 다음 3 시간, 5 분 각 TBST 가진 지속적인 떨고 아래 접시를 세척.
6. 정량화
   1. 제조업체의 지침에 따라 향상 된 화학 기판 (ECL)를 준비 합니다.
   2. 96 잘 접시 (100 µ L/잘) 및 삽입 일정 떨고 아래 2 분 96 잘 접시 안에 QDB 플레이트 aliquot ECL 기판.
   3. 96 잘 접시를 짧게 과잉 액체를 제거 하는 쉐이크 QDB 플레이트를 제거 합니다. 흰색 결정 접시에 접시를 놓습니다.
   4. 켜고 microplate 리더 microplate 리더 정량화에 대 한 내부 결합된 플레이트 (QDB 플레이트 + 화이트 플레이트 어댑터)를 배치 하기 전에 사용자 인터페이스에서 "커버 플레이트"를 선택 합니다.
      참고: 사용 하 여 흰색, 투명 하지 않은 결정 플레이트 어댑터로 접시에서 어떤 방해를 피하기 위해 있는지 확인 합니다. "커버 플레이트"를 선택할 수 있는지 확인 기계 결합 될 때 방해를 피하기 위해 번호판 (QDB 플레이트 + 96 잘 접시 어댑터) microplate 리더 안에 배치 됩니다.

결과

마우스 조직에서 CAPG 단백질을 포함 하 여 어떤 단백질의 절대 금액의 결정 기준으로 특정 항 체와 순화 된 단백질을 요구 한다. 표준 단백질 및는 lysates의 분석의 선형 범위는 또한 대규모 분석 전에 설립 될 필요가 있다. 선형의 범위 항 체는 항 체에 상당히 의존 라기보다, 고 특정 항 체의 적절 한 희석 범위 각 개별 사용자에 의해 확인 될 필요가 있다.

우리는 먼저 비장 및 전립선 조직 부정적인 제어 (IgG 무료 BSA)와 긍정적인 제어 (상용 CAPG 단백질) 서쪽 오 점 분석을 사용 하 여 마우스 신장에서 CAPG 항 체의 특이성을 결정 (그림 1A). 안티-CAPG 항 체 lysates 마우스 비장, 심장, 근육, 및 전립선 (한 밴드 감지)에 대 한 특정 했다. 비 특정 밴드에서 신장과 간 lysates에서 관찰 되었다. 그러나, lysate 신장, 일반적인 밴드는 항 체는 신장 조직 분석에 적합 제안 특정 밴드 보다 훨씬 약한 했다. 다음, 분석 lysates의 양과 표준 단백질의 선형 범위 두 나란히 복용량 곡선에 의해 결정 되었다. 우리의 과거의 경험, 그리고 조직 lysates의 마우스 신장에 따라 표 1 에 표시 된 대로 상용 CAPG 단백질 희석 직렬로 했다, 비장 및 전립선 결정 lysates의 총 단백질의 금액에 따라 또한 희석 했다 의해 BCA 총 단백질 결정 키트. 2 개의 복용량 연구 병행 하 여 수행 되었고 그림 1B에 함께 꾸몄다. 마우스 신장, 비장 및 전립선의 lysates의 적절 한 금액은 임의의 단위로 microplate 리더에 의해 측정 하는 QDB 신호에 따라 선정 됐다. 이 실험에 대 한 원래 읽기 표 3에 표시 됩니다.

마지막 단계에서 연속적으로 희석된 CAPG 단백질 표준 마우스 신장에서 lysates, 비장 및 전립선 QDB 격판덮개에 로드 되었습니다. 이 경우에, 우리 하기로 부하 0.3 µ g/샘플 lysates 마우스 신장과 비장 및 1 µ g/샘플 마우스 prostates 분석에서 lysates 되면서 이러한 수준 QDB 읽기에 적어도 20-fold 분석의 선형 범위 내에서 잘 동안 배경 위에 lysates의 단백질 표준 복용량 곡선을 기반으로 합니다. 접시는 접시 microplate 리더에 의해 직접 계량은 전에 설명된 QDB 프로토콜을 복종 되었다. 순차적으로 희석된 순화 CAPG 단백질을 사용 하 여, 우리 설정할 수 복용량 응답 곡선, 방정식, 및 R2 사용할 수 있는 소프트웨어 (예: Microsoft office excel)를 사용 하 여 단순 회귀 분석에 의해. Spleens, prostates 설립된 방정식을 사용 하 여 이러한 lysates의 CAPG 단백질의 절대 금액으로 변환 되었습니다 lysates의 마우스 신장에서 신호는 QDB 및 결과 총 단백질 양에 의해,이 경우에, 0.3 µ g에서 lysates에 대 한 수정 했다 마우스 spleens 및 신장, 1 µ g lysates pg / µ g으로 이러한 조직에 CAPG 단백질의 최종 농도 대 한 마우스 prostates에서에 대 한. 결과 그림 1C 에서처럼 원래 읽기와 표시 됩니다 표 4.

그림 1 . 3 마우스 조직 (신장, 비장, 전립선)에 절대 CAPG 수준을 결정 하는 QDB 분석의 대표적인 결과입니다. A. 마우스 조직 lysates 비장에서 준비를 사용 하 여 토끼 안티-CAPG 항 체의 특이성을 검사, 심장, 근육, 신장, 간, 그리고 서 부를 사용 하 여 전립선 오 점 부정적인 제어 (IgG 무료 BSA)와 긍정적인 제어 분석 (상업적으로 사용 가능한 CAPG 단백질)입니다. B. lysates 전립선에서 준비를 사용 하 여 토끼 안티-CAPG 항 체의 선형 QDB 분석 정의 신장, 비장, 그리고를 사용 하 여 재조합 표준 CAPG 단백질 정화. 결과 triplicates의 평균 했다입니다. C. 절대 결정의 CAPG 수준 lysates 마우스 신장, spleens, 및 prostates에서 준비. 각 막대는 개별 마우스에서 한 조직을 나타냅니다. 결과 3 중의 평균 했다입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 3: 복용량 연구 직렬로 희석, 둘 다를 사용 하 여 마우스 spleens, 신장, 그리고 prostates 및 순화 된 재조합 CAPG 단백질에서 풀링된 lysates의 microplate 리더에서 유래한 다.

표 4: 마우스 신장 (8), spleens (4), prostates (5) 표준으로 재조합 CAPG 단백질을 사용 하 여 절대 CAPG 레벨의 QDB 분석의 microplate 리더에서 결과.

토론

모든 현재 사용 가능한 immunoassay의 기술을 ELISA 제외한 단백질 분석, 중 QDB 분석 높은 처리량 형태로 휴대 및 조직 수준에서 특정 단백질의 절대 콘텐츠를 달성 하는 유일한 방법입니다. 안정 동위 원소 분류 표준, 질량 분석은 몇 가지 단백질의 절대 정량화를 얻을 수 있다, 하지만이 메서드는 아직 높은 처리량 성능을 위해 설계 되지 않았습니다. 이 연구에서 우리는 CAPG 단백질 수준 마우스 조직 신장, 비장, 전립선 등의 절대적인 결정을 달성 하기 위해 QDB 분석의 과정 시연. CAPG 레벨 360을 200 pg/g 마우스 신장 조직에, 460 650 pg/g 마우스 spleens, 및 330 390 pg/g 마우스 전립선 조직에 사이 발견 됐다.

ELISA에 비해, QDB 분석 일반 실험실에서 개발 최소 노력을 요구 한다. 첫째, QDB 격판덮개는 ELISA에 코팅 단계를 제거 하는 니트로 막에 따라 이다. 둘째, QDB 분석만 대신 샌드위치 ELISA에에서 두 개의 특정 항 체 하나가 필요합니다. 셋째, ELISA 격판덮개 표면에 비해 니트로 막의 높은 바인딩 용량 또한 막을 배경 간섭을 줄이기 위해 immunoblot 분석에서 일반적으로 사용 되는 엄격한 세척 단계를 견딜 수 있습니다. 이 기능은 세포와 조직에서 준비 하는 복잡 한 lysates 분석에 매우 유용 합니다. 반면, ELISA 격판덮개의 상대적으로 낮은 바인딩 용량으로 인해 복잡 한 세포와 조직 lysates를 분석할 때 백그라운드의 감소 발달 과정에서 진정한 도전이 된다.

QDB 분석 특정 항 체의 액세스와 모든 실험실에서 쉽게 채택 될 수 있다. 그러나, 그것은 항 체의 특이성 종, 조직 유형 및 종류를 포함 하 여 요인에 의해 제한 된 상대적인 용어는 언급 하는 것이 중요. 그림 1A같이 CAPG 항 체 특정 마우스 신장, 비장, 그리고 전립선, lysate를 분석할 때 이며 아직 때 일반적인 마우스 간 분석. 사실, 우리는 정기적으로 다른 조직 유형 동일한 종에서 특정 한 조직 유형, 하지만 항상 특정 수 한 항 체를 발견. 따라서, 이전 서쪽 오 점 분석은 QDB 분석의 특이성을 확인 해야 합니다. 사실, 상대 특이성 항 체의 제조 회사 보낸 수 있습니다. 얼마나 많은 노력이 아무리 분석 결과, 특이성을 보장 하기 위해 그들은 수 없습니다 배출 가능한 모든으로 종종 ELISA 분석, 연관 false 결과의 원인이 있을 수 있습니다. 샘플 사용자 유형의 분석 ELISA 제품을 사용 하 여 선택할 수 있습니다.

모든 immunoassays과 마찬가지로 QDB 분석 방법으로 잠재적인 문제는 상업 항 체의 품질의 일관성의 부족 이다. 경우에 같은 항 체의 명백한 품질 회사 (동일한 카탈로그 번호, 등) 사용 하는, 일괄 배치 다양성으로 인해 다른 한 구매에서 큰 차이가 있을 수 있습니다. 따라서, 사용할 수 있는 항 체의 질에 완전 한 자신감을 얻을 하지 않는 한 모든 구매 시 항 체를 다시 특성화이 중요 합니다.

요약, 제공 여기 상세한 프로토콜 예를 들어 조직 수준에서 특정 단백질의 절대 양적 결정 달성 하기 위해 QDB 분석 메서드를 사용할 때. 우리는 QDB 분석 방법은 높은 처리량, 양적 immunoblot 분석에에서 관심이 있는 사람에 대 한 편리한 도구 임을 보여줍니다. 셀룰러 및 조직 수준에서 특정 단백질의 내용의 절대 결정을 달성 하는 능력 또한 전통적인 immunoblot 기법에서이 기법을 구별. 이 기능은 여러 분석, 특히 더 큰 인구 연구에에서 필요한 단계를 가까운 장래에 관련 협회 연구는 단백질 수준에서의 실현 결과의 비교와 조합 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microplate reader	Tecan	Tecan Infinite 200 PRO
QDB plate	Yantai Zestern Co.Ltd		Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net.
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)	jackson	711-035-152
Enhanced chemiluminesence substrate	Thermo	32134
Rabbit anti-CAPG	Sino Biologic Inc	14213-T52
CAPG protein	Sino Biologic Inc	14213-HNAE
Hepes	Sigma	H4034
Nacl	Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd	10461220
Mgcl2	Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd	20120802
EDTA	Sigma	E9884-500G
EGTA	Sigma	BNN1913
Na2P2O7	Haituo Chinese medicine test	20160914
Triton X-100	Sigma	T9284
Glycerol	Sigma	G7757
phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma	P7626-5G
pepstatin	Sigma	Z290033
leupeptin	Sigma	L2884
aprotinin	Sigma	A3428
Tris-Hcl	Sigma	T6455
SDS	Sigma	L5750-500G
DTT	Sigma	43815-1G
Bromphenol Blue	Sigma	B-0126
NaF	Sigma	S7920