High Throughput, assoluta determinazione del contenuto di una proteina selezionato presso i livelli del tessuto utilizzando quantitativi Dot Blot analisi (QDB)

Riepilogo

Qui dimostriamo un dettagliato processo di analisi di quantitativi dot blot (QDB) determinando il contenuto assoluto di una proteina mirato, tappatura proteina actina, gelsolin-come (CAPG), in tre tessuti di diverso tipo di mouse. Dimostriamo un throughput elevato, la tecnica di immunoblot conveniente, quantitativa per la convalida di biomarcatore a livello cellulare e tissutale.

Abstract

In mancanza di un conveniente, metodo immunoblot quantitativa, high throughput per assoluta determinazione del contenuto di una specifica proteina a livello cellulare e tissutale significativamente ostacola il progresso della ricerca proteomica. Risultati derivati dalle tecniche di immunoblot attualmente disponibili sono anche relativi, impedendo qualsiasi sforzo di combinare studi indipendenti con un'analisi su larga scala di campioni della proteina. In questo studio, dimostriamo il processo di analisi di quantitativi dot blot (QDB) per raggiungere quantificazione assoluta in un formato di throughput elevato. Utilizzando uno standard di proteina commercialmente disponibili, siamo in grado di determinare il contenuto assoluto di tappatura proteina actina, gelsolin-come (CAPG) nei campioni della proteina preparato da tre tessuti di diverso tipo di mouse (rene, milza e prostata) insieme ad una dettagliata spiegazione dei dati sperimentali. Vi proponiamo l'analisi QDB come metodo immunoblot conveniente, quantitativi, ad alta velocità effettiva di quantificazione assoluta delle singole proteine a livello cellulare e tissutale. Questo metodo sarà sostanzialmente di aiuto biomarcatore validazione e verifica di percorso nelle varie aree di ricerca biologica e medica.

Introduzione

A fianco con gli avanzamenti emozionanti nella ricerca genomica negli ultimi anni, campo di ricerca biomedica testimonia anche l'avanzamento significativo nella ricerca proteomica. Con l'aumento dell'accumulo di dati biologici a entrambi di genomica e proteomica livelli, utilizzando strumenti bioinformatici per analizzare questi dati è diventata il fulcro della ricerca biomedica in futuro percepibile. Di conseguenza, il successo di bioinformatical ricerca genera domanda di maggiore e migliore qualità dei dati della comunità di ricerca biologica e medica, un'attività può essere raggiunto solo attraverso avanzamento tecnica in genomica e proteomica livelli.

Spettrometria di massa (MS) e l'analisi di immunoblot sono attualmente prevalente due tecniche di analisi della proteina. MS ha dominato la ricerca proteomica negli ultimi anni per consentire l'analisi di migliaia di singole proteine contemporaneamente. Le tecniche basate su immunoblot, tra cui il western blot e macchia del puntino, d'altra parte, hanno anche svolto un ruolo significativo nella ricerca della proteina anche dal suo invenzione^{1,2,3,4, 5}. Enzima collegata dell'immunosorbente (ELISA) dosaggio^5,6,7 e fase inversa proteina microarray (RPPM)^8,9 può essere considerato il formato elevato throughput di immunoblot analisi. Tuttavia, tutti questi metodi di immunoassay, tranne ELISA, misurano il livello di espressione relativa di una proteina specifica. Il carattere relativo di questi metodi diventerà un vero problema per gli studi di popolazione, come l'analisi deve essere fatto allo stesso tempo, impedendo qualsiasi gli sforzi per aumentare la dimensione del pool attraverso analisi multiple. Inoltre, i risultati derivati da questi studi sono solo semi-quantitativi, complicando così eventuali sforzi di bioinformatica nell'analisi dei dati. Nel frattempo, anche se ELISA è adatta per analisi assoluta throughput elevato di campioni della proteina, questa tecnica sembra di affrontare sfide in ambienti complessi come le cellule o tessuti a causa della sua capacità di legare basso e multiplexing¹⁰.

Abbiamo sviluppato un metodo di immunoblot adatto per gli studi di popolazione con le caratteristiche chiave di essere conveniente, ad alta velocità effettiva, quantitativa e adatto per assoluta determinazione del tenore di proteine e denominato questa macchia del puntino quantitativa di tecnica analisi (QDB)¹¹. In questo studio, presentiamo un protocollo dettagliato per analisi QDB e dimostrare il metodo di determinazione del contenuto di proteina assoluta di una proteina specifica, CAPG, in tre tessuti del mouse differenti tra cui rene, milza e la prostata. Pensiamo che questo protocollo dettagliato illustra bene la fattibilità e la convenienza di questo metodo e fornire indicazioni su come evitare i trabocchetti potenziali nella pratica di questo metodo.

Protocollo

Tutte le procedure di animali effettuate in linea con direttiva Use di Binzhou Medical University animale e approvate dal Consiglio di revisione etica di Binzhou Medical University.

1. preparazione del campione

1. Prendere del tessuto del mouse di 50 mg in un tubo da 1,5 mL. Aggiungere 200 µ l di tampone di lisi (50 mM Hepes, pH 7.4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl₂, 10mm Na₂P2O₇, 1% Triton X-100, 10% glicerolo), supplementato con inibitori di proteasi e fosfatasi (100 mM NaF, 0,1 mM phenylmethylsulfonyl fluoro, 5 µ g/mL pepstatin, 10 µ g/mL leupeptina, aprotinina 5 µ g/mL).
2. Omogeneizzare il tessuto con un omogeneizzatore per 1 min sul ghiaccio.
3. Centrifugare per 10 min 8 000 x g a 4 ° C.
4. Raccogliere il surnatante in nuove provette (1,5 mL) e togliere 1 µ l per analisi di concentrazione di proteina con kit di BCA.
   Nota: Tutti i buffer di lisi comunemente utilizzati per l'analisi western blot e Dot blot possono essere utilizzati per l'analisi QDB.

2. determinare la specificità dell'anticorpo

1. Preparare campione lisati (20 µ g) nella sezione 1.4, IgG gratis BSA (20 µ g), proteina standard (600 pg), per l'analisi western blot.
   Nota: IgG gratis BSA viene utilizzato come controllo negativo e la proteina standard è usato come controllo positivo. La specificità dell'anticorpo è dimostrata mostrando una banda di giusta dimensione utilizzando l'analisi di western blot.

3. definizione della gamma lineare dell'analisi QDB

1. Sciogliere la proteina standard con ddH₂O. Diluire la proteina ad una concentrazione di 1.200 pg / µ l.
2. Diluire il concentrato della proteina da campioni preparati in sezione 1.4 a 4 µ g / µ l.
3. Sciogliere la BSA con ddH₂O. Diluire la proteina ad una concentrazione di 1.200 pg / µ l e 4 µ g / µ l.
4. Una serie di diluizione di proteina standard e campioni preparati sono stati preparati con la Guida di tabella 1 e tabella 2.
5. Miscelare 10 µ l diluizione proteina standard o diluizione preparati campioni e 10 µ l 2 x tampone di caricamento (120 millimetri Tris-HCl pH 6.8, 20% glicerolo, 4% SDS, 0,2% blu di bromofenolo, 200 mM DTT) insieme.

	S1 (0pg / µ l)	S2 (33.3pg / µ l)	S3 (100pg / µ l)	S3 (300pg / µ l)	S5 (600pg / µ l)	S6 (1200pg / µ l)
protein(1200pg/µl) standard	0	1.39	4.17	12.5	25	50
IgG BSA gratis (4pg / µ l)	50	48,61	45,83	37.5	25	0
totale	50	50	50	50	50	50

Tabella 1. Schema di diluizione per curva standard della proteina.

	X1 (0µg / µ l)	X2 (0.25µg / µ l)	X3 (0.5µg / µ l)	X4 (1 µ g / µ l)	X5 (2 µ g / µ l)	X6 (4 µ g / µ l)
Sample(4µg/µl)	0	3.125	6.25	12.5	25	50
IgG BSA(4µg/µl) gratis	50	46.875	43,75	37.5	25	0
totale	50	50	50	50	50	50

Tabella 2. Schema di diluizione per campioni preparati

6. Riscaldare le miscele a 85 ° C per 5 min.

4. il processo di analisi QDB

1. Applicazione di esempio
   1. Il QDB piastra per evitare il fondo del piatto toccando la superficie del tavolo di supporto. Per esempio, è possibile utilizzare una casella di punta di pipetta vuoto come supporto.
   2. Caricare fino a 2 µ l del campione al centro della membrana nella parte inferiore dell'unità individuali della piastra QDB.
2. La piastra di secchezza
   1. La piastra QDB caricata per 1 h di lasciare la camera temperato (RT) o in alternativa lasciare la piastra caricata a 37 ° C per 15 min in uno spazio ben ventilato.
3. La piastra di blocco
   1. Immergere la piastra QDB nel buffer di trasferimento (0,039 M glicina, 0,048 M Tris, 0,37% SDS, 20% alcool metilico) e scuotere delicatamente la piastra per 10 s.
   2. Sciacquare la piastra QDB delicatamente con TBST (Tris-buffered saline, 0.1% Tween 20) tre volte e poi lavare la piastra per 5 min in TBST sotto agitazione costante.
   3. Bloccare la piastra QDB con tampone bloccante (5% di latte scremato in TBST (100 µ l/pozzetto) per 1 h sotto agitazione costante.
4. Incubazione dell'anticorpo primario
   1. Diluire l'anticorpo primario in tampone bloccante ad una concentrazione selezionata (da 1:500 a 1:5 000) e aggiungere 100 µ l a ciascun pozzetto individuo di una piastra ben 96 ordinaria. Inserire la piastra QDB nella piastra ben 96 e incubare le piastre combinate sia per 2 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C sotto agitazione costante.
   2. In alternativa, posizionare la piastra QDB all'interno di una scatola e riempire la casella con tampone bloccante 2-3 mm sopra la parte di membrana della piastra se lo stesso anticorpo è usato per tutta la piastra. Aggiungere l'anticorpo primario alla concentrazione selezionata e incubare la piastra sia per 2 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C di sotto agitazione costante.
   3. Sciacquare la piastra delicatamente con TBST per tre volte prima viene lavata con TBST per tre volte, ogni volta per 5 min sotto agitazione costante.
5. Incubazione dell'anticorpo secondario
   1. Diluire l'anticorpo secondario in tampone bloccante la concentrazione selezionata (da 1:1, 000 a 01:50, 000), e a entrambi aliquota 100 µ l/pozzetto in una piastra ben 96 o in una casella come descritto in sezione 4.4.2 e poi incubare la piastra QDB all'interno sia il pla ben 96 caricato te o la casella per 1h a RT in agitazione costante.
   2. Sciacquare la piastra QDB delicatamente 3 volte con TBST, poi lavare la piastra per 3 volte, 5 minuti ciascuno con TBST sotto agitazione costante.
6. Quantificazione
   1. Preparare substrato di chemiluminescenza (ECL) seguendo le istruzioni del produttore.
   2. Substrato di ECL aliquota in un 96 ben piatto (100 µ l/pozzetto) e inserire la piastra QDB all'interno della piastra ben 96 per 2 min sotto agitazione costante.
   3. Rimuovere la piastra QDB dalla piastra ben 96 e agitare brevemente per togliere il liquido in eccesso. Posizionare la piastra su una micropiastra bianca.
   4. Accendere il lettore di micropiastre e selezionare "piastra con coperchio" sull'interfaccia utente prima di posizionare le piastre combinate (piastra QDB + adattatore piatto bianco) all'interno del lettore di micropiastre per quantificazione.
      Nota: Assicurarsi di utilizzare la piastra per microtitolazione bianca, non trasparente come un adattatore per evitare qualsiasi interferenza dalla piastra. Assicurarsi di scegliere "piatto con copertura" per evitare inceppamenti della macchina quando combinato piastre (QDB piastra + 96 ben piastra adattatore) sono collocati all'interno del lettore di micropiastre.

Risultati

La determinazione della quantità assoluta di proteine tra cui la proteina CAPG nel tessuto del mouse richiede sia un anticorpo specifico e una proteina purificata come standard. La gamma lineare delle analisi della proteina standard sia i lisati deve inoltre essere stabilito prima di qualsiasi analisi su larga scala. La gamma lineare dell'anticorpo è altamente dipendente dell'anticorpo di per sé, e la gamma di diluizione appropriata di un anticorpo specifico devono essere verificati da ogni singolo utente.

Abbiamo determinato in primo luogo la specificità dell'anticorpo CAPG in rene del topo, milza e prostata tessuti mediante analisi western blot con il controllo negativo (IgG gratis BSA) e il controllo positivo (proteina CAPG commercialmente disponibile) (Figura 1A). L'anticorpo anti-CAPG era specifico contro lisati da mouse milza, cuore, muscolo e prostata (una banda rilevata). Fasce non specifiche sono state osservate nei lisati dal rene e fegato. Tuttavia, nel rene lisato, le fasce non specifiche sono state significativamente più debole rispetto alla banda specifica, che suggerisce che l'anticorpo è adatto per l'analisi del tessuto del rene. Successivamente, la gamma lineare della proteina standard e la quantità di lisati per le analisi sono state determinate mediante due curve dose di fianco a fianco. Una proteina CAPG disponibile in commercio è stata diluita in serie come indicato in tabella 1 in base alle nostre esperienze passate e i lisati di tessuto del rene del mouse, della milza e della prostata sono stati diluiti anche basato sulla quantità di proteine totali nei lysates determinato di un kit di determinazione della proteina totale BCA. Due studi a dose sono stati eseguiti fianco a fianco e tracciati insieme nella Figura 1B. La quantità appropriata di lisati di rene del topo, la milza e la prostata sono stati scelti in base sui segnali QDB misurati con il lettore di micropiastre in unità arbitrarie. La lettura originale per questo esperimento è mostrata nella tabella 3.

Nell'ultimo passaggio, lo standard di proteina CAPG diluito serialmente e i lisati dal rene del topo, milza e della prostata sono stati caricati sulla piastra QDB. In questo caso, abbiamo scelto di carico 0.3 µ g/campione per lisati dal rene del topo e della milza e 1 µ g/campione per lisati da analisi di prostate di mouse, come a questi livelli, la lettura di QDB era almeno 20 volte sopra il fondo mentre ben all'interno della gamma lineare dell'analisi basato sulla curva dose di entrambi i lisati e la proteina standard. La piastra è stato sottoposto al protocollo QDB descritto prima la piastra è stata quantificata direttamente tramite il lettore di micropiastre. Utilizzando la proteina purificata in serie diluita di CAPG, potremmo stabilire una curva dose-risposta, l'equazione e R2 dall'analisi di regressione semplice utilizzando il software disponibile (ad esempio Microsoft office excel). Il QDB segnali da lisati di reni del mouse, milze e prostate sono state convertite nella quantità assoluta di proteine CAPG in questi lisati mediante l'equazione stabilita, e i risultati sono stati corretti dalla quantità della proteina totale, in questo caso, 0,3 µ g di lisati da milze del mouse e reni e 1 µ g di lisati da prostate del mouse, per la concentrazione finale della proteina CAPG in questi tessuti come pg / µ g. I risultati sono mostrati in Figura 1C con la lettura originale illustrata nella tabella 4.

Figura 1 . Risultato rappresentativo di un'analisi QDB per determinare i livelli assoluti di CAPG in tre tessuti di topo (rene, milza e della prostata). R. esaminando la specificità dell'anticorpo di coniglio anti-CAPG utilizzando lisati di tessuto del mouse preparato dalla milza, cuore, muscolo, rene, fegato e prostata mediante western blot analisi con il controllo negativo (IgG gratis BSA) e il controllo positivo (commercialmente proteina CAPG disponibile). B. definire le analisi di gamma lineare di QDB dell'anticorpo di coniglio anti-CAPG utilizzando lisati preparato dalla prostata, rene, milza e usando purificato ricombinante proteina CAPG standard. I risultati sono stati mediamente di triplici copie. C. assoluta determinazione dei livelli di CAPG nei lysates preparato da prostate, milza e reni del mouse. Ogni barra rappresenta un tessuto da un mouse individuo. I risultati sono stati la media dei tre esemplari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 3: Il risultato di lettore di micropiastre degli studi dose usando entrambi diluito serialmente, pool lysates dalle milze del mouse, i reni e prostate e proteina CAPG ricombinante purificata.

Tabella 4: Risultato da lettore di micropiastre dell'analisi QDB del livello assoluto CAPG in reni del mouse (8), milze (4) e prostate (5) utilizzando una proteina ricombinante CAPG come standard.

Discussione

Tra tutte le tecniche attuali di immunoassay disponibili di analisi della proteina tranne ELISA, analisi QDB sono l'unico metodo per ottenere contenuto assoluto di una proteina specifica a livello cellulare e tessutale in un formato di throughput elevato. Anche se con standard con etichetta isotopo stabile, spettrometria di massa è in grado di raggiungere quantificazione assoluta di alcune proteine, questo metodo non è ancora progettato per alte prestazioni. In questo studio, abbiamo dimostrato il processo di analisi QDB raggiungere assoluta determinazione del livello della proteina CAPG nei tessuti del mouse tra cui rene, milza e la prostata. CAPG livelli sono stati trovati per essere tra 200 a 360 pg/g nei tessuti del rene del mouse, 460 a 650 pg/g in milze del mouse e 330 a 390 pg/g nei tessuti della prostata del mouse.

Rispetto a ELISA, QDB analisi richiede sforzi minimi per essere sviluppato in un normale laboratorio. In primo luogo, la piastra QDB è basato su una membrana di nitrocellulosa per eliminare il passo di rivestimento in ELISA. In secondo luogo, analisi QDB richiede solo uno invece di due anticorpi specifici in un sandwich ELISA. In terzo luogo, la capacità di legame di membrana di nitrocellulosa rispetto la superficie della piastra ELISA consente inoltre la membrana sopportare i passaggi di lavaggio rigorose in genere utilizzati nell'analisi di immunoblot per ridurre le interferenze di sfondo. Questa funzione è molto utile per analizzare complicati lisati preparato dalle cellule e tessuti. Al contrario, a causa della capacità di associazione relativamente basso delle piastre ELISA, la riduzione dello sfondo quando si analizzano complicati lisati cellulari e tissutali diventa una vera e propria sfida nel processo inerente allo sviluppo.

Analisi QDB possono essere adottata facilmente in qualsiasi laboratorio con l'accesso di un anticorpo specifico. Tuttavia, è importante ricordare che la specificità dell'anticorpo è un termine relativo, limitato da fattori tra cui la specie, i tipi di tessuto e delle cellule. Come illustrato nella Figura 1A, CAPG anticorpo è specifico quando si analizzano lisato da prostata, milza e rene del topo e diventa ancora non specifici quando si analizza il fegato di topo. In realtà, abbiamo trovato ordinariamente un anticorpo ad essere specifici per il tipo di un tessuto, ma non sempre specifiche per altro tipo di tessuto dalla stessa specie. Così, l'analisi western blot preventiva è necessario garantire la specificità dell'analisi QDB. Infatti, la relativa specificità dell'anticorpo può essere la causa di risultati falsi, spesso associati all'analisi ELISA, come non importa quanto sforzo dell'azienda di produzione può avere speso per garantire la specificità del test, non può esaurire tutte le possibili tipi di campioni gli utenti possono scegliere di analizzare l'utilizzo dei loro prodotti di ELISA.

Come con tutti i test immunologici, un potenziale problema con il metodo di analisi QDB è la mancanza di coerenza della qualità dell'anticorpo commerciale. Anche se la qualità apparente di un anticorpo dalla stessa azienda (stesso catalogo numero ecc.) viene utilizzato, ci potrebbero essere grandi differenze da un acquisto a un altro a causa della variabilità lotto. Pertanto, a meno che nella qualità dell'anticorpo disponibile è raggiunto piena fiducia, ri-che caratterizza l'anticorpo su ogni acquisto è importante.

In sintesi, forniamo qui un protocollo dettagliato e un esempio quando si utilizza il metodo di analisi QDB per raggiungere assoluta determinazione quantitativa di una proteina specifica a livello tissutale. Indichiamo che il metodo di analisi QDB è un comodo strumento per chiunque sia interessato a resa elevata, l'analisi di immunoblot quantitativa. Sua capacità di raggiungere l'assoluta determinazione del contenuto di una specifica proteina a livello cellulare e tissutale anche distinguere questa tecnica da immunoblot tradizionali tecniche. Questa funzionalità consente la combinazione ed il confronto dei risultati delle analisi multiple, un passo necessario soprattutto nei più grandi studi di popolazione e la realizzazione di studi di associazione relativa al livello della proteina nel prossimo futuro.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microplate reader	Tecan	Tecan Infinite 200 PRO
QDB plate	Yantai Zestern Co.Ltd		Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net.
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)	jackson	711-035-152
Enhanced chemiluminesence substrate	Thermo	32134
Rabbit anti-CAPG	Sino Biologic Inc	14213-T52
CAPG protein	Sino Biologic Inc	14213-HNAE
Hepes	Sigma	H4034
Nacl	Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd	10461220
Mgcl2	Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd	20120802
EDTA	Sigma	E9884-500G
EGTA	Sigma	BNN1913
Na2P2O7	Haituo Chinese medicine test	20160914
Triton X-100	Sigma	T9284
Glycerol	Sigma	G7757
phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma	P7626-5G
pepstatin	Sigma	Z290033
leupeptin	Sigma	L2884
aprotinin	Sigma	A3428
Tris-Hcl	Sigma	T6455
SDS	Sigma	L5750-500G
DTT	Sigma	43815-1G
Bromphenol Blue	Sigma	B-0126
NaF	Sigma	S7920