高スループット、定量的なドットを使用して組織レベルで選択されたタンパク質の含有量の絶対測定のしみの分析 (おっ)

要約

ここゲルゾリンのようなの (の CAPG)、3 つの異なるマウス組織におけるアクチン タンパク質をキャッピング標的蛋白質の絶対的なコンテンツを決定することにより定量点のしみの分析 (おっ) の詳細なプロセスを示します。高スループット、定量的、便利 immunoblot 細胞およびティッシュのレベルでのバイオ マーカーの検証法を紹介しています。

要約

便利な欠けている、細胞およびティッシュのレベルで特定の蛋白質の量の絶対測定の定量的、高スループット イムノブロット法の大幅プロテオーム研究の進行を妨げます。イムノブロットの現在利用可能な手法から得られた結果は、相対的な蛋白質のサンプルの大規模解析と独立した研究を結合するすべての努力を防ぐことも。本研究では、定量的ドットのしみの分析 (おっ) 高スループット形式で絶対的な数量を達成するためにプロセスを示します。市販蛋白質の標準を使用して、我々 はアクチン蛋白質、ゲルゾリンのような (CAPG) とともに詳細な 3 つの異なるマウス臓器 (腎臓、脾臓、前立腺) から調製したタンパク質サンプルをキャッピングの絶対的なコンテンツを決定することができます。実験の詳細の説明。細胞およびティッシュのレベルでの個々 のタンパク質の絶対定量の便利な量的な高スループット イムノブロット法としておっ解析を提案します。このメソッドは、バイオ マーカーの検証および生物医学研究の様々 な分野で経路確認を大幅に支援します。

概要

と一緒に近年、ゲノム研究の刺激的な進歩と生物医学研究フィールドも目撃するプロテオーム研究の大幅な進歩。両方のゲノムの生物学的データの蓄積を増加およびプロテオーム レベル、将来的に知覚できる生物医学研究の焦点となっている bioinformatic ツールを使用してこれらのデータを分析します。その結果、基づく研究の成功は、生物学的および生物医学の研究コミュニティからのデータより良い品質のための需要を発生させます、タスクはゲノムで技術進歩によってのみ達成できるとプロテオーム レベル。

質量分析法 (MS) とイムノブロット解析、タンパク質解析の 2 つの支配的な技術は現在。MS は、近年たくさんの個々 の蛋白質の解析を同時に有効にするのに、プロテオーム研究を支配しています。西部のしみやドットのしみなど、イムノブロット ベースの手法、他の一方で、また役割を果たしている重要なタンパク質の研究における発明^{1,2,3,4、以降も 5}。酵素リンク免疫測定法 (ELISA)^5,6,7とイムノブロットの高スループット形式と考えられる逆相蛋白質マイクロ アレイ (RPPM)^8,9解析。ただし、ELISA を除いて、すべてのこれらの免疫測定法は、特定のタンパク質の相対発現レベルを測定します。これらのメソッドの相対的な性質は、分析、同時に行う必要があります複数の解析を通してプール サイズを大きく任意の努力を防止すると人口研究の実際の問題になります。さらに、これらの研究から派生した結果は、定量的データ解析におけるバイオインフォマティクス努力をこのように複雑。一方、ELISA はよく蛋白質のサンプルの高スループット絶対解析に適していますが、この手法は、低結合容量と¹⁰を多重化のための細胞や組織などの複雑な環境の課題に対応するようです。

便利で、高スループット、定量的、かつ、タンパク質含有量の絶対測定に適したであることの特徴と人口研究に適したイムノブロット法を開発し、この手法の定量的ドットしみを名前付き分析 (おっ)¹¹。本研究でっ分析のための詳しいプロトコルと腎臓、脾臓、前立腺など 3 つの別のマウス組織における特定の蛋白質、CAPG、絶対タンパク質含有量を決定することによって、メソッドを示します。我々 はこの詳細なプロトコルは可能性とこのメソッドの利便性も示していますだと思うし、このメソッドの練習の潜在的な落とし穴を回避する方法に関するガイダンスを提供します。

プロトコル

動物のすべてのプロシージャは、賓県医科大学動物使用に関する指令に沿った実施され、賓県医科大学倫理審査委員会によって承認されました。

1. サンプル準備

1. 1.5 mL チューブに 50 mg マウス組織を取る。200 μ L の換散バッファーを追加 (50 mM Hepes、pH 7.4 では、137 mM の NaCl、5 ミリメートルの EDTA、5 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、1 mM MgCl₂, 10 mM Na₂P2O₇, 1% トリトン X-100, 10% グリセロール)、プロテアーゼとホスファターゼ阻害剤 (100 mM 0.1 mM 特異 NaF と補われました。フッ化物、5 μ G/ml ペプスタチン、10 μ G/ml leupeptin、5 μ G/ml アプロチニン)。
2. 氷の上の 1 分のホモジナイザーを用いた組織をホモジナイズしてください。
3. 4 ° C で 8 000 x g で 10 分間遠心
4. 上清を新しいチューブ (1.5 mL) に収集、BCA キットと蛋白質の集中の試金のための 1 μ L を取り出してください。
   注:西部のしみの分析とドットのしみの分析のためのすべての一般的に使用される換散バッファーは、おっ分析に使用できます。

2. 抗体の特異性を決定します。

1. セクション 1.4 でサンプル溶解液 (20 μ g) を準備、無料 BSA を IgG (20 μ g) 標準的なタンパク質 (600 pg)、西部のしみの分析のため。
   注:IgG 無料 BSA、ネガティブ コントロールとして使用され、標準タンパク質が肯定的な制御として使用されます。西部のしみの分析を使用して適切なサイズの 1 つのバンドを示すことによって、抗体の特異性を示した。

3. おっ解析の線形の範囲を定義します。

1. DdH₂O. Dilute 1,200 pg/μ L の濃度タンパク質標準タンパク質を溶解します。
2. セクション 1.4 を 4 μ g/μ L で作製されたサンプルから高濃度のタンパク質を希釈します。
3. DdH₂O. Dilute 1,200 pg/μ L と 4 μ g/μ L の濃度にタンパク質と BSA を溶解します。
4. 表 1および表 2の指導標準タンパク質と作製した試料の希釈系列を調製されました。
5. ミックス 10 μ L 希釈標準蛋白質または希釈調製サンプルおよびバッファーを読み込んで x 10 μ L 2 (120 mM トリス塩酸 pH 6.8, 20% 0.2% 4 %sds、グリセロール、Bromphenol ブルー、200 mM DTT) 一緒に。

	S1 (0pg/μ l)	S2 (33.3pg/μ l)	S3 (100pg/μ l)	S3 (300pg/μ l)	S5 (600pg/μ l)	S6 (1200pg/μ l)
標準 protein(1200pg/µl)	0	1.39	4.17	12.5	25	50
無料の BSA を igG します。 (4pg/μ l)	50	48.61	45.83	37.5	25	0
合計	50	50	50	50	50	50

表 1。標準蛋白質のカーブのため希釈方式です。

	X1 (0µg/μ l)	X2 (0.25µg/μ l)	X3 (0.5µg/μ l)	X4 (1µg/μ l)	X5 (2µg/μ l)	X6 (4 μ g/μ l)
Sample(4µg/µl)	0	3.125	6.25	12.5	25	50
無料 BSA(4µg/µl) を igG します。	50	46.875	43.75	37.5	25	0
合計	50	50	50	50	50	50

表 2。作製した試料の希釈方式

6. 5 分の 85 ° c の混合物を加熱します。

4. おっ分析のプロセス

1. サンプル アプリケーション
   1. テーブルの表面に触れるプレートの下部を避けるためおっプレートをサポートします。たとえば、サポートとして空のピペット チップ ボックスを使用します。
   2. おっプレートの個々 の単位の下で膜の中央にサンプルの最大 2 μ L をロードします。
2. プレートを乾燥
   1. 部屋温帯 (RT) で 1 時間ロードおっプレートを残したり、代わりとして換気の空間で 15 分間 37 ° C でロード プレートを残します。
3. ブロック プレート
   1. 転送バッファー (0.039 M 0.048 M トリス、グリシン 0.37% SDS 20% メチル アルコール) でおっ板を浸し、軽く振る 10 プレート s。
   2. TBST でやさしくおっその皿を洗う (トリス緩衝生理食塩水、0.1% Tween 20) 3 回と洗い TBST で一定振動下での 5 分間プレート。
   3. ブロック ブロック バッファーおっプレート (TBST で 5% 無脂肪牛乳 (100 μ L/ウェル) 一定振動下で 1 時間。
4. 一次抗体の孵化
   1. ブロック バッファー (1:500 000 1:5) から選択した濃度の一次抗体を希釈し、普通の 96 ウェル プレートの各ウェルに 100 μ L を追加します。96 ウェル プレートにおっプレートを挿入し、常温または一晩一定振動下の 4 ° C で 2 h のいずれかの複合板を孵化させなさい。
   2. また、ボックス、内おっプレートを置き、全体の板に同じ抗体を使用する場合ブロック バッファー板の膜の部分 2 ~ 3 mm のボックスを埋めます。選択した濃度に一次抗体を追加、常温または一晩一定振動下で 4 ° C で 2 h のいずれかのプレートを孵化させなさい。
   3. それは 3 回一定振動の下で 5 分間ずつの TBST と洗浄される前に 3 回の TBST で軽くプレートをすすいでください。
5. 二次抗体の孵化
   1. 96 well プレートまたはセクション 4.4.2 で記述としてボックスにブロック バッファー (1:50, 000 にする 1:1, 000) から選択した濃度とどちらかの分注 100 μ L/ウェルの二次抗体を希釈し、読み込まれた 96 よく人民解放軍内部のいずれかおっプレートをインキュベーションしてテまたは一定振動下で RT で 1 h のボックス。
   2. Tbst では、軽く 3 回のおっプレートをリンスし、3 回、5 分ずつ tbst 一定振動下のプレートを洗います。
6. 定量化
   1. 製造元の指示に従うことによって基板化学発光 (ECL) を準備します。
   2. 96 well プレート (100 μ L/ウェル) と挿入定数揺れ 2 分の 96 ウェル プレート内おっプレートに分注の ECL 基板。
   3. おっプレート 96 ウェル プレートと簡単に余分な液体を削除する振るから取り外します。白いマイクロタイター プレート上にプレートを配置します。
   4. マイクロ プレート リーダーにし定量化のためのマイクロ プレート リーダー内部結合プレート (おっプレート + 白プレート アダプター) を配置する前に「カバー付きプレート」、ユーザー インターフェイスを選択します。
      注:プレートからの干渉を避けるためにアダプターとして白、非透明マイクロ プレートを使用することを確認します。「プレート カバー付き」を選択してください組み合わせるとき機械を妨害を避けるためにプレート (おっプレート + 96 well プレート アダプター) がマイクロ プレート リーダー内に配置します。

結果

マウス組織における CAPG タンパク質を含むすべてのタンパク質の絶対量の定量には、標準として特異的抗体と浄化された蛋白質の両方が必要です。標準蛋白質の lysates 解析の線形範囲は、任意の大規模解析の前に制定される必要があります。抗体の線形範囲は抗体依存性自体、特定の抗体の適切な希釈範囲は個々 のユーザーによって検証する必要があります。

我々 はまず、脾臓、前立腺の組織陰性対照 (IgG 無料 BSA) 肯定的な制御 (市販 CAPG タンパク質) と西部のしみの分析を使用してマウス腎臓における CAPG 抗体の特異性が決定 (図 1A)。抗 CAPG 抗体はマウスの脾臓、心臓、筋肉、前立腺 (1 つのバンドが検出された) からの lysates に対して特異だった。非特異バンドは、腎臓や肝臓から溶解液で観察されました。しかし、腎ライセート、無指定バンドいた抗体が腎臓組織解析に適した特定のバンドに比べて極めて弱かった。次に、標準の蛋白質および分析用溶解液の量の線形範囲は、2 つのサイド バイ サイド線量曲線により決定しました。市販 CAPG 蛋白質連続希釈表 1に基づいて私たちの過去の経験やマウス腎臓の組織溶解液で示されているように、脾臓、前立腺も希釈された決定 lysates の総蛋白質の量に基づくで BCA 総蛋白質定量キットです。2 つの線量調査はサイド バイ サイド実行され、図 1Bで一緒にプロットされます。マウス腎臓、脾臓、前立腺の lysates の適切な量は、任意の単位のマイクロ プレート リーダーによる測定おっ信号に基づいて選ばれました。この実験のため元の読みは表 3に示します。

おっプレートの上には、最後のステップ、希釈した CAPG 蛋白質の標準マウス腎臓から lysates 脾臓、前立腺を読み込みました。この場合をロード 0.3 μ g/マウス腎臓および脾臓から溶解液のサンプルとしましたマウス前立腺の分析から溶解液を 1 μ g/サンプルされたこれらのレベルでおっ読書で少なくとも 20 倍分析の線形範囲内にしながら背景の上lysates のタンパク質標準線量曲線に基づいています。プレートは、プレートのマイクロ プレート リーダーで直接定量化を行った前に説明おっプロトコルに服従しました。希釈した精製 CAPG 蛋白質を使用して、我々 は使用可能なソフトウェア (例: Microsoft office excel) を使用して単純な回帰分析による用量-反応曲線の方程式、R2 を確立でした。脾臓、前立腺は確立された式を使用してこれらの lysates CAPG タンパク質の絶対量に変換された、マウス腎臓の lysates からの信号は、おっ、結果総蛋白量、この場合からの lysates を 0.3 μ g で修正マウス脾臓と腎臓、および pg/μ g としてこれらの組織における CAPG タンパク質の最終濃度のマウス前立腺から溶解液に 1 μ g。結果に示すように元の読書と図 1Cに示す表 4.

図 1.3 つのマウス臓器 (腎臓、脾臓、前立腺) に絶対 CAPG レベルを決定するおっ分析代表結果。A.脾臓から作製したマウスの組織溶解液を用いたウサギ抗 CAPG 抗体の特異性を調べると、心臓、筋肉、腎臓、肝臓、西部を用いた前立腺のしみのネガティブ コントロール (IgG 無料 BSA) 肯定的な制御と分析 (商業的利用可能な CAPG 蛋白質)。B.前立腺から調製したライセートを用いたウサギ抗 CAPG 抗体おっ線形範囲解析の定義、腎臓、脾臓、および使用組換え標準 CAPG 蛋白質を精製しました。結果は、トリプリケートの平均だった。C.マウス腎臓、脾臓、前立腺から調製したライセートの CAPG レベルの絶対定量。各バーは、個々 のマウスから 1 つの組織を表します。結果は、3 通を平均しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 3: 連続希釈、両方を使用して線量研究マウス脾臓、腎臓、前立腺、精製組換え CAPG 蛋白質からプールされた lysates のマイクロ プレート リーダーからの結果します。

表 4: マイクロ プレート リーダーから分析の結果、おっ (8) のマウスの腎臓、脾臓 (4)、前立腺 (5) 標準として組換え CAPG 蛋白質を使用して絶対的な CAPG レベルの。

ディスカッション

技術の中ですべての現在利用可能な免疫測定法 ELISA 以外のタンパク質解析のおっ分析は高スループット形式の細胞およびティッシュのレベルで特定の蛋白質の絶対的なコンテンツを実現する唯一の方法です。安定同位体標識標準質量は、いくつかのタンパク質の絶対定量を達成することが、このメソッドは、まだ高いスループット ・ パフォーマンスの設計されていません。本研究では、腎臓、脾臓、前立腺などマウス組織における CAPG 蛋白質レベルの絶対定量を達成するためにおっ分析のプロセスを示した。CAPG レベルは、360 に 200 pg/g マウス腎組織で、460 に 650 pg/g マウスの脾臓では 330 に 390 pg/g マウス前立腺組織内のことがわかった。

おっ解析 elisa 法と比較して、通常のラボで開発する最低限の努力が必要です。まず、おっプレートはに基づいて ELISA の塗装手順を除去するために硝酸セルロースの膜です。第二に、のみおっ分析のサンドイッチ elisa 法の 2 つの特定の抗体の代わりに 1 つ必要があります。第三に、ELISA プレート表面に比べて硝酸セルロースの膜の高い結合容量通常バック グラウンド干渉を低減するイムノブロット解析で使用される厳しい洗浄手順に耐えるように膜ができます。この機能は、非常に複雑な lysates セルおよびティッシュから準備の分析に便利です。対照的に、ELISA プレートの比較的低結合容量、ため複雑な細胞およびティッシュの lysates を分析する際のバック グラウンドの低減の発達過程で本当の課題になります。

おっ分析は特定の抗体のアクセス権を持つ任意のラボで簡単に適用できます。ただし、抗体の特異性は種、組織細胞の種類などの要因によって制限、相対的な用語であることを言及することが重要です。図 1Aのように、CAPG 抗体マウス腎臓、脾臓、前立腺、ライセートを分析する際は、固有なりまだ非特異的マウス肝臓を解析するとき。実際には、我々 は日常的が 1 つの組織の種類、常に固有ではないその他の組織型に同じ種から 1 つの抗体を発見します。したがって、前の西部のしみの分析はおっ解析の特異性を確保するため必要です。実際には、製造会社が費やしているどれだけの努力に関係なく、アッセイの特異性を確保するため彼らできない排気すべての可能な抗体の相対的な特異性 ELISA 解析に多くの場合関連付けられている偽の結果の原因である可能性があります。サンプル ユーザーの種類は、ELISA 製品の使用を分析できます。

すべてイムノアッセイと同様おっ分析方法の潜在的な問題は市販抗体の品質の一貫性の欠如です。たとえ同じ抗体の見かけの品質会社 (同じカタログ番号等) が使用されて、別のバッチ間の変動に起因する 1 つの購入から大きな違いがある可能性があります。したがって、使用可能な抗体の品質に絶対の自信を達成しない限り、再すべての購入時に抗体の特性が重要です。

要約すると、ここで詳細なプロトコル ・実施例おっ分析メソッドを使用して組織レベルで特定のタンパク質の絶対定量法を達成するためにします。おっ解析法が高スループット、定量的イムノブロット解析に興味がある人のための便利なツールであることを示します。細胞およびティッシュのレベルで特定の蛋白質の量の絶対測定を達成するためにその能力はまた伝統的なイムノブロット法からこの手法を区別します。この機能は、複数の解析、大きい人口研究に特に必要なステップおよび蛋白質レベルで関連する学会の実現は近い将来の結果の比較と組み合わせにできます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microplate reader	Tecan	Tecan Infinite 200 PRO
QDB plate	Yantai Zestern Co.Ltd		Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net.
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot)	jackson	711-035-152
Enhanced chemiluminesence substrate	Thermo	32134
Rabbit anti-CAPG	Sino Biologic Inc	14213-T52
CAPG protein	Sino Biologic Inc	14213-HNAE
Hepes	Sigma	H4034
Nacl	Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd	10461220
Mgcl2	Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd	20120802
EDTA	Sigma	E9884-500G
EGTA	Sigma	BNN1913
Na2P2O7	Haituo Chinese medicine test	20160914
Triton X-100	Sigma	T9284
Glycerol	Sigma	G7757
phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma	P7626-5G
pepstatin	Sigma	Z290033
leupeptin	Sigma	L2884
aprotinin	Sigma	A3428
Tris-Hcl	Sigma	T6455
SDS	Sigma	L5750-500G
DTT	Sigma	43815-1G
Bromphenol Blue	Sigma	B-0126
NaF	Sigma	S7920