אוונס ממוטבת כחול פרוטוקול כדי להעריך את דליפת דם העכבר

Summary

במאמר זה מתואר פרוטוקול חסכוני, אופטימיזציה, ופשוט אשר משתמשת בשיטת צבע כחול אוונס להערכת extravasation פלזמה באיברים של עכברים FVBN אשר ניתן להתאים לשימוש זנים אחרים, מינים, ואת שאר איברים או רקמות.

Abstract

דליפת דם, או פלזמה extravasation, יש מספר סיבות, עשוי להיות עם תוצאה חמורה או סימפטום מתגובה דלקתית. מחקר זה עשוי להוביל בסופו של דבר הידע החדש בדבר הגורמים או דרכים חדשות כדי לעכב או לטפל extravasation פלזמה. חשוב כי החוקרים יש כלים מתאימים, כולל את השיטות הטובות ביותר הזמינות, לימוד פלזמה extravasation. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול, שימוש בשיטת הצבע הכחול אוונס, להערכת extravasation פלזמה באיברים של עכברים FVBN. פרוטוקול זה היא פשוטה במכוון, כדי גדול תואר ככל האפשר, אבל מספק נתונים באיכות גבוהה. אוונס כחול צבע נבחר בעיקר כי זה קל עבור המעבדה הממוצע להשתמש. השתמשנו פרוטוקול זה לספק ראיות ותמיכה עבור ההשערה כי neprilysin האנזים עשויה להגן את להערכת כנגד פלזמה extravasation. עם זאת, פרוטוקול זה ייתכן השפעול בשימוש ויש להתאים בקלות לשימוש זנים אחרים של עכברים או מינים אחרים, רבים איברים שונים או רקמות, עבור מחקרים אשר עשוי לכלול גורמים אחרים, חשובים להבנת, מניעת או לטיפול extravasation פלזמה. פרוטוקול זה הותאם בהרחבה, שונה מן הפרוטוקולים הקיימים, המשלב אמינות, להקל על השימוש, הכלכלה, ואת הזמינות הכללית של חומרים וציוד, הפיכת פרוטוקול זה מעולה עבור המעבדה הממוצע להשתמש ב לכימות פלזמה extravasation של איברים.

Introduction

דליפת דם באברים מתייחס extravasation, או דליפה של פלזמה דם דרך פערים מיוצר על אנדותל של פוסט venules נימי באיברים. Extravasation פלזמה או חדירות כלי דם מוגבר, אשר עשויה לנבוע סוג מתגובה דלקתית, זו עשויות להיות השלכות חמורות. לכן חשוב כי תופעה זו, את הסיבות, מאפננים, וההשלכות, הם למדו והבינו, באופן דומה, כי החוקרים יש יופי כלים, פרוטוקולים שבה ללמוד אותן. הפערים אנדותל עשויים להיווצר באמצעות שורה של גירויים, אך בדרך כלל מיוצרים על ידי הפעולה של נוירוטרנסמיטורים פפטיד ו/או tachykinins על endothelia. אחד המתווכים המתרחשים באופן טבעי העיקריים של תהליך זה, דבר המתבטא פלזמה מוגברת extravasation, הוא undecapeptide tachykinin neuropeptide, חומר P¹.

שיטות כדי לחקור ולמדוד את חדירות כלי דם או פלסמה extravasation, אשר להשתמש במאפיין אלבומין-איגוד של צבע כחול אוונס, פותחו, ידועים בדרך כלל עבור דיוק, פשטות, הכלכלה, ביטחונם, היכולת לאפשר קביעת extravasation פלזמה רקמות כמה בבת אחת, אם כן רצוי^{2,3,4,5,6,7,8,9} . פרוטוקול זה אוונס כחול להערכת extravasation פלזמה באיברים של עכברים FVBN משתמשת כל אלה, אך מוסיף כמה שינויים חשובים, זה עושה את זה בדרך כלל שימושי וישימה עבור מחקרים עתידיים, מעורבים הממוצע המעבדה מבצעת או יהיה לנהל מחקרים חשובים של גורמים הקשורים extravasation פלזמה או חדירות כלי דם. ב פרוטוקול זה, חומר P הוא הציג העכברים-1 nmol/ק ג, אשר מרחיב את extravasation של פלזמה על-ידי 1.5-fold. זה מגביר את הרגישות של הפרוטוקול, וכתוצאה מכך תוצאות הנצפה, השגה בקלות רבה יותר. גורמים נוספים שמשפיעים על חדירות, כמו פפטידים שונים אחרים, כימיקלים או כמה צורות של פגיעה רעילים, עשוי להשתמש בו או נחקר על ידי מעבדות אחרות, כרצונכם. זריקות ומוחלף נמצאים בשימוש פרוטוקול זה להציג את אוונס כחול, חומר P מערכתית, אשר דורש ניתוח מסוף. עם זאת, ומוחלף זריקות^5,7,10, גם לאחר התחשבות הטכניקות הנדרשות מסוף כירורגי, קלים יותר לשלוט ולהוביל הייצור של תוצאות עקביות יותר מהאחרים זריקות ורידים, כולל הזנב הווריד זריקות^4,9. למרות שזה עשוי להיות אפשרי אוונס כחול מועברת על ידי זריקות סינוסים ורידים רטרו-מסלולית, אין הפניות בספרות נמצאו זה להשתמש בשיטה זו של מסירת אוונס כחול. אולם, לגבי זריקות וריד הזנב, רמה גבוהה של מומחיות ותרגול לשלוט בטכניקה זו reproducibly באופן משמעותי מגביל את השימוש זריקות אוונס כחול מוצלחת. לעומת זאת, בשיטת הזרקת אלטרנטיביות. ווריד הצוואר כפי שמתואר הפרוטוקול שלנו מציע פתרון טכנית השגה. שגרה מכריע עבור זלוף של הוורידים של העכבר, לבצע רק לאחר ההקרבה של אוונס perfused כחול העכבר, מסיר עודפי צבע כחול אוונס, בוצע שעבר סטנדרטיזציה של פרוטוקול זה. שיטות שתואר לעיל זלוף כבר בזהירות בדק, שונה כדי לקבל את ההליך הנוכחי. שינויים אחרים המתוארים כאן הם כל ממוטבת, פשוטה וזולה.

ישנן כמה מגבלות חשובות של השיטה צבע כחול אוונס. לדוגמה, רגישות נמוכה המשויכות לעתים שיטה זו עלולה למנוע כמה נוספים ברוטו פתולוגיים ומאפיינים היסטולוגית בדיקה של רקמות מחיות המוזרק כחול אוונס. עם זאת, אלה ומגבלות אחרות הובילו לפיתוח שיטות אלטרנטיביות ומודלים זה, בכל זאת, עדיין להשתמש אוונס כחול. המדד של אוונס כחול על-ידי קרינה פלואורסצנטית (במקום visual-טווח) ספקטרוסקופיה עשוי להגביר את הרגישות של השיטה. בנוסף, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה של אוונס מוכתם כחול רקמות פותחה כדי לאפשר התבוננות דליפת דם מיקומים ברורים יותר¹¹. בנוסף, לכל הגוף הדמיה וסריקה של-חיים בעבר הזריקו אוונס כחול¹² מאפשר חקירה של ריכוזים אוונס כחול באופן רציף, במקום ספציפי אחד נבחר הזמן בנקודה של הניסוי. עם זאת, שיטה זו דורש את הזמינות של מתקני הדמיה המתאימה, וזה עשוי להיות יקר מאוד. השינויים הכרוכים אוונס כחול והושמעה בסוג במבחנה של מודל, כגון בתא תרבות או דגם chorioallantoic¹³ (CAM) גם תוארו. מודלים אלה מפוקח על-ידי קרינה פלואורסצנטית, מיקרוסקופ intravital¹⁴ , לאפשר כימות של חדירות כלי דם שינויים לאורך זמן, אבל עלול להעלות שאלות הנוגעות דוגמנות מדויק של תנאים ויוו ו אולי גם יקר.

היו שיטות אחרות שפותחו כדי לקבוע ולכמת דליפת דם או חדירות, שאינן כוללות את הניהול של אוונס כחול. שיטות אלה עשויה להשתמש של מולקולה פלורסנט המתאים (כגון אלבומין או fluorescein), או isotopically עם תוויות או אחרת מתויג מולקולה, לחיות חיות (או לתא תרבות או chorioallantoic (CAM) מודלים¹³, ואחריו לא פולשנית הדמיה (PET סריקה, MRI, מיקרוסקופ intravital, כל הגוף סריקה) או על-ידי פולשני הדמיה (מיקרוסקופ פלואורסצנטי)^3,12,15. למרות הטכניקות הללו עשויים להציע מספר יתרונות על פני אחרים אוונס שיטות כחול, יש להם גם חסרונות, אשר עשויים לכלול שלהם ניכר המורכבות הנדרשות מומחיות, משאבים, עלויות כספיות גבוהות.

Neprilysin¹⁶ (peptidase האנזים NEP, הידוע גם בשם CD10, גברת או Enkephalinase) הוצע להיות מעורב עיכוב פלזמה extravasation, לפחות בחלקו, דרך מטבוליזם אנזימטי איון אנדוגני פ חומר לפיכך, ברקמות שבו מתרחשת תא השטח peptidase NEP, ייתכנו הנחתה השפעת חומר P, ככל הנראה על ידי פעילות peptidase NEP.

בתחילה, בדקנו עבור חומר P-induced פלזמה extravasation ניצול פרוטוקול זה אוונס כחולה ששונו, עם FVBN פראי סוג (WT) ועכבר נוקאאוט (KO) NEP. NEP מעורבות פלזמה בתוספת חומר P extravasation נחשד ממחקרים אלה הראשונית, אנו מתארים אלה, בהמשך הניסויים תפקיד של NEP מעורבים פלזמה extravasation. עם זאת, המוקד של כתב יד זה אינה NEP או תפקידה פלזמה extravasation, אלא מעדיף extravasation פלזמה הניסויים עצמם. התוצאות NEP הן נציג של סוג התוצאות שניתן להשיג באמצעות שימוש של פרוטוקול זה שונה. השיטה אוונס כחול כדי למדוד פלזמה extravasation יש כבר אופטימיזציה, שינוי, כפי שיתואר בפירוט להלן עבור עכברים FVBN.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההנחיות הבינלאומי, הלאומי, ו/או מוסדיים החלים על טיפוח ועל השימוש בבעלי חיים (עכברים) הובילו ב הניסויים המתוארים בכתב היד.

שיטה זו משתמשת עכברים בוגרים FVBN, בגילאי 16-20 שבועות, יימצא אופטימלית לצורך מחקר זה. יום 1 כולל שלבים 1-5 וכוללת יום 2 שלבים 6-7 (איור 1).

1. ציוד הכנה

1. מאובטח על אספקה נאותה של סטריליות, חד פעמיות מזרקים ומחטים, אם חריגות קטמין/השירותים הווטרינריים משמש ההרדמה (כפי שמומלץ). אם איזופלוריין משמש ההרדמה, בדוק את מיכל החמצן ואת רמת נוזלים של איזופלוריין כדי לוודא שלא יהיו אספקה נאותה לניסוי לפני שמתחילים. בנוסף, להרכיב את nosecone נושם מעגלים ולצרף אותם אל תיבת אינדוקציה; לצרף המיכלים פחם חדשים המעגלים נשימה. הכן תיבת אינדוקציה על ידי הפעלת את החמצן, ברור כי השלב השני קורא כ 50 psi.
2. הפעל את כרית החימום כדי 37 מעלות צלזיוס.
3. להכין את החללית טמפרטורה רקטלית לניתוח.

2. העכבר הכנה

שלב זה כולל הרדמה, הסרת שיער, מיצוב (למבוגרים FVBN עכברים-גיל 16-20 שבועות).

1. שוקל העכברים ולהקליט את המשקולות.
2. עזים ומתנגד העכברים.
   1. לנהל את ה-IP קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים (80-100 מ"ג/ק"ג ו- 7.5-16 מ"ג/ק"ג, בהתאמה). עם זאת, מומלץ להתחיל עם מינונים נמוכים יותר של קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים (30 מ"ג/ק"ג ועל 6 מ"ג/ק"ג, בהתאמה).
   2. לשמור על ההרדמה עם 0.1 - 0.25 פעמים הראשוני מינונים של קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים במהלך הניתוח. קטמין חריגות השירותים הווטרינריים היו agent(s) הרדמה להתמקד במחקר מסוים זה, כפי יותר הפארמצבטית, שרידות נצפו. ניתן למצוא את agent(s) הרדמה להתמקד במחקרים אחרים יהיו שונים.  אם איזופלוריין, להכניס את העכבר תא אינדוקציה והפעל איזופלוריין ל 5% עד העכבר מאבד הכרה מלאה. לאחר מכן השתמש nosecone האף שוכן בגובה 1.5-2.5% איזופלוריין תוצרי הלמידה ההליך.
3. לפקח על העכברים כל 2-3 דקות על ידי צביטה הבוהן כדי לבדוק לעומק המתאים של הרדמה.
4. לגלח את האזור הצוואר הגחון של העכבר.
5. הנח את העכבר במצב פרקדן על משטח preheated. אבטח את כפות הידיים וכפות הרגליים של העכבר על פני השטח כירורגית עם קלטת.
6. במקום דמעות מלאכותיות משחה על גבי העיניים כדי למנוע ייבוש במהלך הניתוח.

3. ניתוח פרטי

1. עושים חתך 1 ס מ בצוואר הגחון ממש מעל ומוחלף.
2. החל טיפות אחת או שתיים של לידוקאין (1-2%) אל אזור החתך לניהול כאב וכדי לקדם את התרחבות. המתן 2 דק. עבור לידוקאין שהשינויים ייכנסו לתוקף.
3. לחשוף ולבודד נכון הפנימי, ווריד הצוואר באמצעות עמום. . תקשור את הווריד 4-0 בתפר ומשכו בעדינות את הסוף rostral של כלי השיט עם עוצר דימום. לחתוך חור, באמצעות מספריים בסדר, בערך 3 מ מ מתחת או סימטרית לעניבה, בערך באמצע הקוטר של הווריד.
4. מארק קטטר פוליויניל PV-1 1.5 ס מ מהקצה להכניס אותו לתוך ומוחלף על דרך החור באמצעות מרחיב כלי השיט ו לשרשר את הצנתר לקראת הסוף סימטרית של כלי השיט, כ- 1.5 ס מ.
5. לקשור את הצנתר באופן מאובטח בתוך החלק סימטרית של כלי השיט (להלן גזירה), עם 4-0 משי. לקשור את החלק rostral של כלי השיט החיצוני של הקטטר עם הקצוות של התפר ששימש לקשור rostral ומוחלף, בשלב 3.3.
6. נעץ העור באופן רופף חזרה יחד הקטטר עם 4-0 משי כדי למנוע איבוד חום הגוף והתייבשות רקמות.
7. להתחבר הקטטר המזרק המכיל heparinized מלוחים (10 U/mL) ומורידים את הקטטר.

4. זריקות

1. להזריק את הפתרון אוונס כחול (50 μL של פתרון 30 מ"ג/מ"ל תמיסת מלח, נורמלי, unheparinized, 0.9% או כ 50 מ"ג/ק"ג) לתוך הצנתר ומוחלף, ואחריו נפח קטן של מלוחים heparinized לרוקן את הקו.
2. 2 דקות אחר כך, להזריק חומר P (100 μL של פתרון 0.3 μM saline 0.9% נורמלי, unheparinized, או 1 nmol/ק ג), ואחריו נפח קטן של מלוחים heparinized לרוקן את הקו. חומר P מגבירה את extravasation של פלזמה חלבונים דרך השכבה אנדותל; ב פרוטוקול זה, הוא יוצר באופן שגרתי של הגדלת פלזמה הערכים extravasation של 1.5-fold, המקל פלזמה extravasation ערכים למדוד.
3. לחכות 18 דקות לאחר מוזרק חומר P. במהלך תקופה זו, הצבע הכחול אוונס equilibrate, לזרום.
4. לסיים את הניסוי 18 דקות לאחר ההזרקה של חומר P (20 דקות לאחר ההזרקה אוונס כחול) ע י הקרבת את העכבר עם נקע בצוואר הרחם. סביר להניח כי העכבר ניתן ישירות cervically נקע, בלי הראשון לתת מנת יתר של סם הרדמה, כמו העכבר הוא כנראה עדיין היטב anesthetized מהניתוח. עם זאת, אם זה הכרחי, ממנת יתר של חומרי הרדמה קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים, איזופלוריין או פנטוברביטל יכול להינתן, ואחריו נקע בצוואר הרחם.

5. בידוד איברים

1. לפתוח את החזה של העכבר, כוח המשיכה-perfuse (מגובה של-51 ס מ או 20") של הלב וכלי הדם עם 50 מ של 50 מ מ סודיום ציטרט, pH 3.5. pH 3.5 משמר ככל הנראה מחייב אוונס כחול אלבומין.
2. בלו 1-5 האיברים הרלוונטיים (רקמות) עם איזמל ויבתר (למשל שלפוחית השתן, הכליה, הקיבה, הכבד, הלבלב, צינתור או דיסטלי קולון, מעי, תריסריון, האגף העור, האוזניים, הזנב, הלב, ו/או הריאות) ולהסיר כל תוכן שיורית, אם נוכח.
3. יש לשטוף את האיברים בתוך בטמפרטורת החדר (RT) באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS; 1.44 g של נה₂HPO4, 0.24 גר' ח'₂PO4, 8.0 גר' של NaCl ו- g 0.20 של אשלגן כלורי ב- 1 ליטר, pH 7.4).
4. כתם האברים ברקמות לחצי כל איבר ואיבר, שוקלים כל חצי (רטוב משקולות, ב- g).
5. יבש אחד חצי של הרקמה בתנור ייבוש ב 150 ° C, על רדיד, במשך 48 שעות.
6. מקם את רקמות אחרות חצי נפח עקבית (עד 200 µL) של formamide ב microfuge הצינור עבור 48 שעות (ועד 72 h) כדי לחלץ את אוונס כחול.

6. מדידה של רקמות OD

1. הסר µL 50 של אוונס חלוטים כחול formamide (לאחר 48-72 h RT הדגירה) צינור microfuge והמקום לבאר אחת של צלחת פוליסטירן 96-ובכן. יש להיזהר לא העברת רקמות חתיכות יחד עם formamide.
2. במקום 50 µL של formamide חדש, טהור לתוך כל אחד שתי בארות ריק של צלחת 96-ובכן עבור החסר.
3. למדוד ולהקליט את יתר₆₂₀ של כל טוב של הלוחית 96-ובכן בקורא צלחת ספיגת. 620 ננומטר הוא ספיגת מקסימום של אוונס כחול.

7. חישוב של פלזמה Extravasation

1. שוקל הרקמה יבש חצי אשר כבר בתנור במשך 48 שעות.
2. לחשב את יחס משקל משקל רטוב/יבש ספציפי האיבר ריבית כל לעכבר הבודד, החל המשקל הרטוב של רקמה זו חצי (שלב שהושג ב- 5.4), מחולק לפי משקל יבש של זו רקמת אותו חצי (שלב שהושג ב- 7.1).
3. לחשב משקל יבש (ב- g) של הרקמה חצי formamide על ידי חלוקת המשקל הרטוב של הרקמה חצי לפני זה בוצעה ב- formamide (שהושג בשלב 5.4) על-ידי רטובה: יחס משקל יבש של איבר מסוים ריבית (שחושבו בצעד 7.2).
4. לחשב את הערכים₆₂₀ OD מתוקן . החל יתר₆₂₀ ערך מכל קידוח ניסיוני של צלחת 96-ובכן (מכיל אוונס חלוטים כחול formamide מרקמות כל, שהושג בשלב 6.3), לחסר ריק טוב OD₆₂₀ הערך (את יתר₆₂₀ הערך הממוצע של שתי הבארות המכיל formamide טהור, מוכן בשלב 6.2, כמנת₆₂₀ הערכים שהתקבלו בשלב 6.3) מכל ערך ניסיוני.
5. לחשב את הערך extravasation פלזמה על-ידי חלוקת את המתוקן OD₆₂₀ (שלב מחושבים ב- 7.4) לפי המשקל היבש של הרקמה חצי formamide (שלב מחושבים ב- 7.3). היחידות של פלזמה extravasation יהיה OD₆₂₀/g משקל יבש.
6. ניתוח נתונים, אקספרס כמו הממוצע ± ב- SEM סטטיסטית להשוות בין קבוצות על ידי מבחן t או בכיוון אחד השונות מבחן מרובה-השוואה של Scheffé (lycofs01.lycoming.edu), לפי הצורך.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

איור 1, תיאור סכמטי של התהליך מוצג, אשר נמצא את התוצאה הערכים extravasation עקבי ואמין ביותר של חומר P-induced פלזמה, מן האיברים של עכברים FVBN. הליך זה בדרך כלל לוקח שני ימי עבודה, מופרדים על-ידי לפחות 48 שעות של זמן המתנה. זה אפשרי להפיץ את זה אפילו יותר, אם זה נעשה באופן ע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כפי שצוין לעיל, המחקר של פלזמה extravasation יוביל בסופו של דבר הידע החדש בדבר הגורמים או דרכים חדשות כדי לעכב או לטפל extravasation פלזמה. באמצעות צבע כחול אוונס, שימוש מוצלח של פרוטוקול extravasation פלזמה (לעיל), הוכח בכתב היד הנוכחי. למרות שהנתונים המוצגים בחזרה ההשערה כי NEP עשויה להגן על להערכת נגד extravasation ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
isoflurane	Vet One	200-070	inhaled anesthetic
ketamine	Vet One	200-055	injectable anesthetic
xylazine	Lloyd Laboratories	139-236	injectable anesthetic
syringes (10,3 & 1 cc)	Becton Dickinson	309604, 309657, 309659
needles (20G1,23G1 & 26G1/2)	Becton Dickinson	305178, 305193, 305111
isoflurane induction chamber	VetEquip	941443	1 Liter
nosecone breathing circuits	VetEquip	RC2	Rodent Circuit Controller 2
oxygen tank	Airgas	UN 1072	100% medical
heating pad	CWE Inc.	TC-1000	temperature controller
rectal temperature probe	CWE Inc.	10-09012	mouse
balance (for rodents)	Ohaus	CS 2000
surgical tools-scissors	Fine Science tools	15000-00	Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11151-10	Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels)
surgical tools-hemostats	Fine Science tools	13009-12	Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue)
surgical tools -suture drivers	Fine Science tools	12502-12	Olsen-Hegar suture drivers (suturing)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11627-12	Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14110-15	Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	18025-10	suture tying forceps (used for Millar cath)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14078-10	Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11254-20	Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14082-09	Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11051-10	10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11251-35	Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels)
surgical tools-retractors	Fine Science tools	17012-11	Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11294-00	Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11297-00	Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14058-11	tough cut iris scissors (mouse dissection, bones)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11009-13	serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat)
surgical tools-hemostats	Fine Science tools	13003-10	Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11006-12	Adson serrated forceps (tissue grasping)
clippers	Oster	A5
tape	Fisherbrand	159015G
artificial tear ointment	Akorn Inc	13985-600-03
lidocaine	Hospira	0409-4277-01	2% injectable
polyvinyl catheters	Tygon	PV-1
Evans blue	Sigma Aldrich	E2129
Substance P	Bachem	H-1890
heparin	Sagent Pharmaceuticals	25201-400-10	1000 U/ml
saline solution	Hospira	0409-7138-09	0.9% sodium chloride
phenobarbital	Vortech	0298-9373-68
sodium citrate	Fisher Scientific	BP327-1
PBS	Sigma Aldrich	P4417-50TAB
Kimwipes for blotting	Fisher Scientific	06-666A
formamide	Sigma Aldrich	47670
microbalance	Denver Instrument	APX-60
microfuge tubes	Fisher Scientific	07-200-534
polystyrene 96 well plate	Becton Dickenson	351172
absorbance plate reader	BioTek	Synergy 2
polyacrylamide gels	Bio-Rad	3450014
protein molecular weight standard	Bio-Rad	1610374
Protran supported nitrocellulose	Amersham (GE)	10600015
gel box	Bio-Rad	1658005
Tris	Fisher Scientific	BP152-1
Tween20	Sigma Aldrich	P-1379
sodium chloride	Fisher Scientific	S271-1
primary NEP polyclonal antibody	R & D Systems	AF1182
doxycycline chow	Teklad (HARLAN)	TD.130750
FVB/NJ wild type mice	Jackson	001800
secondary antibody (goat anti-rabbit)	ZyMed	81-6120
ECL solution-Western Lightening Plus	PerkinElmer	NEL104001EA
film	Pierce	34091