Blu di un Evans ottimizzato protocollo per valutare la perdita vascolare nel topo

Riepilogo

In questo articolo, un protocollo semplice, economico e ottimizzato è descritto che utilizza il metodo di colorante blu di Evans per la valutazione dello stravaso di plasma negli organi dei topi FVBN che può essere adattato per l'uso in altre varietà, specie e altri organi o tessuti.

Abstract

Perdita vascolare, o lo stravaso di plasma, ha un certo numero di cause e può essere una conseguenza grave o sintomo di una risposta infiammatoria. Questo studio può infine condurre a nuove conoscenze sulle cause di o nuovi modi per inibire o trattamento dello stravaso di plasma. È importante che i ricercatori hanno gli strumenti adeguati, tra cui i migliori metodi disponibili, per lo studio di stravaso di plasma. In questo articolo, descriviamo un protocollo, utilizzando il metodo di colorante blu di Evans, per la valutazione dello stravaso di plasma negli organi dei topi FVBN. Questo protocollo è volutamente semplice, a come grande un grado possibile, ma fornisce dati di alta qualità. Blu di Evans è stato scelto principalmente perché è facile per il laboratorio di medio da utilizzare. Abbiamo utilizzato questo protocollo per fornire prove e supporto per l'ipotesi che l'enzima neprilisina può proteggere il sistema vascolare contro lo stravaso di plasma. Tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato sperimentalmente e facilmente adattato per l'uso in altri ceppi di topi o in altre specie, in molti diversi organi o tessuti, per gli studi che possono coinvolgere altri fattori che sono importanti per comprendere, prevenire o curare stravaso di plasma. Questo protocollo è stato ampiamente ottimizzato e modificato da protocolli esistenti e combina affidabilità, facilità d'uso, economia e disponibilità generale di materiali e attrezzature, rendendo questo protocollo superiore per il laboratorio di medio da utilizzare in quantificare lo stravaso di plasma da organi.

Introduzione

Perdita vascolare negli organi si riferisce allo stravaso, o perdita del plasma sanguigno attraverso le lacune prodotta nell'endotelio di post capillare venule negli organi. Questo stravaso di plasma o aumento della permeabilità vascolare, che può derivare da qualche tipo di risposta infiammatoria, può avere gravi conseguenze. Quindi, è importante che questo fenomeno, le cause, modulatori e conseguenze, sono studiate e capite, e allo stesso modo, che gli investigatori hanno una buona strumenti e protocolli con cui per studiarli. Le lacune endoteliale possono essere prodotto tramite una serie di stimoli, ma solitamente sono prodotte dall'azione di neurotrasmettitori peptidici e/o neurochinine sugli endoteli. Uno dei principali mediatori naturali di questo processo, che si traduce nello stravaso aumentati del plasma, è il neuropeptide tachykinin undecapeptide, la sostanza P¹.

Metodi per indagare e misurare la permeabilità vascolare o stravaso di plasma, che utilizzano la proprietà di albumina-associazione di colorante blu di Evans, sono stati sviluppati e di solito sono noti per la loro precisione, semplicità, economia, sicurezza e capacità di consentire la determinazione di stravaso di plasma dai tessuti diversi in una sola volta, se così desidera il^{2,3,4,5,6,7,8,9} . Questo protocollo di blu di Evans per la valutazione dello stravaso di plasma negli organi dei topi FVBN utilizza tutti questi, ma aggiunge alcune importanti modifiche che lo rendono generalmente utile e adattabile per gli studi futuri, che coinvolge il laboratorio di medio che conduce o sarà condurre studi importanti dei fattori connessi con stravaso di plasma o permeabilità vascolare. In questo protocollo, la sostanza P è stato introdotto per i topi a 1 nmol/kg, che aumenta lo stravaso di plasma di 1,5 volte. Questo aumenta la sensibilità del protocollo, con conseguente risultati più facilmente osservabili e ottenibile. Altri fattori che influenzano la permeabilità, come vari altri peptidi, sostanze chimiche o alcune forme di lesione tossica, possono essere utilizzati o studiati da altri laboratori, come desiderato. Vena giugulare iniezioni sono utilizzate nel presente protocollo per introdurre il blu di Evans e sostanza P sistemica, che richiede un intervento chirurgico terminale. Tuttavia, vena giugulare iniezioni^5,7,10, anche dopo un esame delle tecniche chirurgiche terminale necessarie, sono più facili da padroneggiare e portano alla produzione di risultati più coerenti rispetto altri iniezioni di venose, compresa la coda della vena iniezioni^4,9. Anche se potrebbe essere possibile per il blu di Evans da consegnare tramite le iniezioni retro-orbitale del seno venoso, riferimenti nella letteratura non sono stati trovati che utilizzano questo metodo di consegna di blu di Evans. Tuttavia, per quanto riguarda le iniezioni di vena della coda, l'elevato grado di competenza e pratica riproducibile padroneggiare questa tecnica notevolmente limita l'impiego per successo iniezioni di blu di Evans. Al contrario, il metodo di iniezione della vena giugulare alternativo come descritto nel nostro protocollo, offre una soluzione tecnicamente ottenibile. Una procedura fondamentale per la perfusione delle vene del mouse, eseguita solo dopo il sacrificio del mouse irrorato di blu di Evans, rimuove l'eccesso di blu di Evans ed è stato standardizzato nel presente protocollo. Metodi precedentemente descritti di aspersione sono stati attentamente esaminati e modificati per ottenere la presente procedura. Altre modifiche descritte qui sono tutti ottimizzati, semplice e poco costoso.

Ci sono alcune importanti limitazioni del metodo del colorante blu di Evans. Ad esempio, bassa sensibilità a volte connessa con questo metodo potrebbe impedire alcuni ulteriore esame lordo di patologico ed istologico dei tessuti da animali iniettati blu di Evans. Tuttavia, queste e altre limitazioni hanno portato allo sviluppo di metodi alternativi e modelli che, comunque, ancora utilizzano il blu di Evans. La misurazione di blu di Evans di fluorescenza (piuttosto che di visual-gamma) spettroscopia può aumentare la sensibilità del metodo. Inoltre, microscopia di fluorescenza dei tessuti tinto di blu di Evans è stata sviluppata per consentire l'osservazione di perdita vascolare in più distinte posizioni¹¹. Inoltre, corpo intero di imaging e la scansione di un animale vivo precedentemente iniettato con Evans blue¹² consente di indagine delle concentrazioni di blu di Evans in modo continuo, piuttosto che ad uno specifico scelto tempo punto dell'esperimento. Tuttavia, questo metodo richiede la disponibilità di adeguate strutture di imaging e può essere molto costoso. Modifiche che coinvolgono Evans blu e si è esibito in un tipo in vitro di modello, come in una cella cultura o pulcino chorioallantoic modello¹³ (CAM) inoltre sono stati descritti. Questi modelli sono monitorati da fluorescenza e microscopia intravital¹⁴ e consentono la quantificazione dei cambiamenti di permeabilità vascolare nel corso del tempo, ma possono sollevare questioni per quanto riguarda la modellazione accurata delle condizioni in vivo e possono anche essere costoso.

Ci sono stati altri metodi sviluppati per determinare e quantificare la perdita vascolare o permeabilità, che non comportano la somministrazione di blu di Evans. Questi metodi possono impiegare una molecola fluorescente appropriata (ad esempio l'albumina o fluoresceina), o una molecola con tag isotopicamente etichettata o altrimenti, agli animali vivi (o alla cella cultura o chorioallantoic (CAM) modelli¹³, seguita da non-invasivo Imaging (scansione PET, MRI, microscopia intravital, scansione di tutto il corpo) o di imaging invasivo (microscopia fluorescente)^3,12,15. Anche se queste tecniche possono offrire un numero di vantaggi sopra altri Evans metodi blu, hanno anche gli svantaggi, che possono includere il loro notevole complessità, necessaria esperienza, risorse e costi monetari alti.

Neprilisina¹⁶ (peptidasi enzima NEP, noto anche come CD10, MME o Enkephalinase) è stata suggerita per essere coinvolti nell'inibizione dello stravaso di plasma, almeno in parte, attraverso il metabolismo enzimatico e inattivazione di endogeno sostanza p. Così, nei tessuti in cui si verifica la peptidasi di superficie delle cellule NEP, ci può essere un'attenuazione dell'effetto della sostanza P, presumibilmente dall'attività della peptidasi di NEP.

Inizialmente, abbiamo testato per lo stravaso di plasma indotta da sostanza P che utilizzano questo protocollo modificato di blu di Evans, con FVBN wild type (WT) e topi knockout (KO) NEP. Coinvolgimento di NEP nello stravaso di plasma sostanza P-aumentata è stata ritenuta sospetto da questi studi iniziali, e Descriviamo questi ed ulteriori esperimenti ruolo di NEP coinvolgendo nello stravaso di plasma. Tuttavia, il focus di questo manoscritto non è NEP o il suo ruolo nello stravaso di plasma, ma piuttosto lo stravaso di plasma esperimenti stessi. I risultati di NEP sono rappresentativi del tipo di risultati che possono essere ottenuti attraverso l'uso di questo protocollo modificato. Il metodo di blu di Evans per misurare lo stravaso di plasma è stato ottimizzato e modificato, come descritto in dettaglio qui di seguito per i topi FVBN.

Protocollo

Tutte le linee guida internazionali, nazionali e/o istituzionali applicabili per la cura e l'uso di animali (topi) sono state seguite negli esperimenti descritti in questo manoscritto.

Questo metodo utilizza topi adulti FVBN, età compresa tra 16-20 settimane, trovato per essere ottimale per gli scopi di questo studio. Giorno 1 include i passaggi 1-5 e 2 giorni include i passaggi 6-7 (Figura 1).

1. preparazione del materiale

1. Garantire un'adeguata disponibilità di siringhe sterili, monouso e aghi, se chetamina/xilazina è usato come anestetico (come consigliato). Se isoflurane è usata come anestetico, controllare la bombola dell'ossigeno e il livello del liquido di isoflurane per assicurarsi che non ci sono rifornimenti sufficienti per l'esperimento prima di iniziare. Inoltre, montare la punta conica circuiti respiratori e allegarli alla casella di induzione; fissare nuovi contenitori del carbone di legna per i circuiti di respirazione. Preparare la casella induzione attivando l'ossigeno e accertare che la seconda fase legge circa 50 psi.
2. Accendere il rilievo di riscaldamento a 37 ° C.
3. Preparare la sonda di temperatura rettale per la chirurgia.

2. preparazione di Mouse

Questo passaggio include l'anestesia, depilazione e posizionamento (adulto FVBN topi-età 16-20 settimane).

1. Pesare i topi e registrare i pesi.
2. Anestetizzare i topi.
   1. Amministrare la ketamina e xilazina IP (80-100 mg/kg e 7,5-16 mg/kg, rispettivamente). Tuttavia, si raccomanda di iniziare con basse dosi di ketamina e xilazina (circa 30 mg/kg e 6 mg/kg, rispettivamente).
   2. Mantenere l'anestesia con circa 0,1 - 0,25 volte iniziale dosi di chetamina/xilazina durante l'intervento chirurgico. Ketamina e xilazina erano degli agenti anestetici di scelta in questo studio particolare, come maggiore riproducibilità e capacità di sopravvivenza sono stati osservati. Degli agenti anestetici di scelta in altri studi possono essere trovati per essere diversi.  Se viene utilizzato l'isoflurano, mettere il mouse in un'aula di induzione e accendere isoflurano al 5%, fino a quando il mouse perde coscienza completa. Quindi utilizzare un musetto nasale fissato a isoflurane 1.5-2.5% per tutto il resto della procedura.
3. Monitorare i topi ogni 2-3 min di pizzico di punta per verificare la profondità appropriata dell'anestesia.
4. Radere la zona ventrale del collo del mouse.
5. Posizionare il mouse in una posizione supina sul pad preriscaldato. Fissare le zampe e i piedi del mouse alla superficie chirurgico con nastro adesivo.
6. Posto lacrime artificiali unguento per gli occhi per evitare l'essiccazione durante la chirurgia.

3. chirurgici dettagli

1. Praticare un'incisione di 1 cm nel collo proprio ventrale sopra la vena giugulare.
2. Applicare una o due gocce di lidocaina (1-2%) nell'area di incisione per la gestione del dolore e per promuovere la vasodilatazione. Attendere 2 minuti per la lidocaina effettive.
3. Esporre e isolare la vena giugulare interna destra tramite dissezione smussa. Legare la vena con sutura 4-0 e retrarre delicatamente alla fine rostrale della nave con una pinza emostatica. Tagliare un buco, utilizzando forbici bene, circa 3 mm inferiore o caudale alla cravatta, circa a metà strada attraverso il diametro della vena.
4. Contrassegnare un catetere polivinilico PV-1 1,5 cm dall'estremità e inserirla nella vena giugulare attraverso il foro utilizzando un dilatatore e infilare il catetere verso l'estremità caudale della nave, circa 1,5 cm.
5. Legare il catetere in modo sicuro all'interno della parte caudale della nave (sotto il taglio), con seta 4-0. Legare la parte rostrale del vaso verso l'esterno del catetere con le estremità della sutura che è stata usata per legare la vena giugulare rostrale, al punto 3.3.
6. Aderenza alla pelle senza bloccare di nuovo insieme intorno al catetere con seta 4-0 per aiutare a prevenire la perdita di calore corporeo ed essiccazione dei tessuti.
7. Collegare il catetere ad una siringa contenente soluzione fisiologica eparinata (10 U/mL) e irrorare il catetere.

4. iniezioni

1. Iniettare la soluzione di blu di Evans (50 µ l di una soluzione di 30 mg/mL in soluzione salina normale, unheparinized 0,9% o circa 50 mg/kg) il catetere giugulare, seguito da un piccolo volume di soluzione fisiologica eparinizzata per svuotare la linea.
2. 2 min dopo, iniettare la sostanza P (100 μL di soluzione 0,3 μM in soluzione salina normale, unheparinized 0,9%, o 1 nmol/kg), seguita da un piccolo volume di soluzione fisiologica eparinizzata per svuotare la linea. Sostanza P aumenta lo stravaso di proteine plasmatiche attraverso lo strato endoteliale; in questo protocollo, ordinariamente induce un aumento dei valori di stravaso di plasma di circa 1,5 volte, rendendo al plasma stravaso valori più facile da misurare.
3. Attendere 18 min dopo la sostanza P viene iniettato. Durante questo periodo, il colorante blu di Evans sarà equilibrare e circolare.
4. Terminare l'esperimento 18 min dopo l'iniezione della sostanza P (20 min dopo l'iniezione di blu di Evans) sacrificando il mouse con dislocazione cervicale. È probabile che il mouse può essere direttamente cervicale slogato, senza prima dare un'overdose di anestetico, come il mouse è probabilmente ancora ben anestetizzati dalla chirurgia. Tuttavia, se è necessario, una dose eccessiva del anestetici chetamina/xilazina, isoflurano o pentobarbital può essere concesse, seguita da dislocazione cervicale.

5. isolamento degli organi

1. Tagliati la cavità toracica del mouse e gravità-irrorare (da un'altezza di circa 51 cm o 20") il cuore e vasi sanguigni con 50 mL di citrato di sodio di 50 mM, pH 3.5. pH 3.5 conserva presumibilmente associazione blu di Evans all'albumina.
2. Asportare organi pertinenti 1-5 (tessuti) con un bisturi per dissezione (ad es. la vescica urinaria, rene, stomaco, fegato, pancreas, prossimale o distale del colon, ileo, duodeno, fianco pelle, orecchie, coda, cuore e polmoni) e per rimuovere qualsiasi residuo, se presenti.
3. Sciacquare gli organi a temperatura ambiente (TA) tampone fosfato salino (PBS; 1,44 g di Na₂HPO4, 0,24 g di KH₂PO4, 8,0 g di NaCl e 0,20 g di KCl in 1 L, pH 7.4).
4. Asciugare gli organi con tessuto, tagliare ogni organo a metà e pesare ogni mezzo (bagnato pesi, in g).
5. Asciughi uno metà del tessuto in un forno a 150 ° C, su pellicola, per 48 h.
6. Posizionare l'altro tessuto metà in un volume costante (fino a 200 µ l) di formammide in una microfuge tube per 48 h (e fino a 72 h) per estrarre il blu di Evans.

6. misurazione del tessuto OD

1. Rimuovere 50 µ l di Evans blue-infuso formammide (dopo incubazione di 48-72 h RT) dal tubo di microfuge e posto in un pozzetto di una piastra 96 pozzetti in polistirolo. Fare attenzione a non trasferire i pezzi di tessuto insieme la formammide.
2. Mettere 50 µ l di formamide nuovo, puro in ciascuno dei due pozzetti vuoti della piastra 96 pozzetti per gli spazii in bianco.
3. Misurare e registrare il OD₆₂₀ di ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti su un lettore di piastra di assorbanza. 620 nm è la capacità di assorbimento max di blu di Evans.

7. calcolo di stravaso di Plasma

1. Pesare il tessuto asciutto metà che è stata in forno per 48 h.
2. Calcolare il rapporto di peso peso umido/a secco per l'organo specifico di interesse da ogni mouse individuali, a partire con il peso bagnato di questo tessuto metà (ottenuti nel punto 5.4), diviso per il peso a secco di questo tessuto stesso mezzo (ottenuti in punto 7.1).
3. Calcolare il peso a secco (in g) del tessuto metà in formammide dividendo il peso bagnato del tessuto metà prima di esso è stato disposto in formammide (ottenuta al passaggio 5.4) dall'umido: rapporto di peso a secco per l'organo specifico di interesse (calcolato al punto 7.2).
4. Calcolare i valori di₆₂₀ OD rettificato . A partire con il OD₆₂₀ valore da ogni pozzetto sperimentale della piastra 96 pozzetti (contenente formammide blu-infuso di Evans da ogni tessuto, ottenuto nel passaggio 6.3), sottrarre il valore vuoto del₆₂₀ OD ben (il OD₆₂₀ valore medio di i due pozzi contenente formammide pura, preparata al punto 6.2, OD₆₂₀ valori ottenuti nel passaggio 6.3) da ogni valore sperimentale.
5. Calcolare il valore di stravaso di plasma dividendo il corretto OD₆₂₀ (calcolato nel passaggio 7.4) per il peso a secco del tessuto metà in formammide (calcolato in punto 7.3). Le unità di stravaso di plasma sarà il peso a secco OD620/g.
6. Analizzare i dati ed espressa come media ± SEM. statisticamente confrontare i gruppi di test t o analisi unidirezionale della varianza e test di multiplo-confronto di Scheffe (lycofs01.lycoming.edu), come appropriato.

Risultati

Nella Figura 1, è indicato uno schema della procedura, che è stato trovato per causare i valori di stravaso di plasma indotta da sostanza P più affidabili e coerenti da organi dei topi FVBN. Questa procedura richiede solitamente due giorni di lavoro, separati da almeno 48 ore di tempo di attesa. È possibile diffondere ancora di più, se questa operazione viene eseguita costantemente per tutti gli esperimenti da confrontare. Ad esempio, dopo che gli organi...

Discussione

Come discusso in precedenza, lo studio di stravaso di plasma può infine condurre a nuove conoscenze sulle cause di o nuovi modi per inibire o trattamento dello stravaso di plasma. Il riuscito uso del protocollo di stravaso di plasma (sopra), usando il colorante blu di Evans, è stato dimostrato nel manoscritto attuale. Anche se i dati riportati indietro l'ipotesi che la NEP può proteggere il sistema vascolare contro lo stravaso di plasma, questo è un obiettivo secondario attualmente, con l'obiettivo primario è di pre...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
isoflurane	Vet One	200-070	inhaled anesthetic
ketamine	Vet One	200-055	injectable anesthetic
xylazine	Lloyd Laboratories	139-236	injectable anesthetic
syringes (10,3 & 1 cc)	Becton Dickinson	309604, 309657, 309659
needles (20G1,23G1 & 26G1/2)	Becton Dickinson	305178, 305193, 305111
isoflurane induction chamber	VetEquip	941443	1 Liter
nosecone breathing circuits	VetEquip	RC2	Rodent Circuit Controller 2
oxygen tank	Airgas	UN 1072	100% medical
heating pad	CWE Inc.	TC-1000	temperature controller
rectal temperature probe	CWE Inc.	10-09012	mouse
balance (for rodents)	Ohaus	CS 2000
surgical tools-scissors	Fine Science tools	15000-00	Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11151-10	Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels)
surgical tools-hemostats	Fine Science tools	13009-12	Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue)
surgical tools -suture drivers	Fine Science tools	12502-12	Olsen-Hegar suture drivers (suturing)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11627-12	Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14110-15	Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	18025-10	suture tying forceps (used for Millar cath)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14078-10	Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11254-20	Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14082-09	Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11051-10	10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11251-35	Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels)
surgical tools-retractors	Fine Science tools	17012-11	Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11294-00	Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11297-00	Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14058-11	tough cut iris scissors (mouse dissection, bones)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11009-13	serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat)
surgical tools-hemostats	Fine Science tools	13003-10	Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11006-12	Adson serrated forceps (tissue grasping)
clippers	Oster	A5
tape	Fisherbrand	159015G
artificial tear ointment	Akorn Inc	13985-600-03
lidocaine	Hospira	0409-4277-01	2% injectable
polyvinyl catheters	Tygon	PV-1
Evans blue	Sigma Aldrich	E2129
Substance P	Bachem	H-1890
heparin	Sagent Pharmaceuticals	25201-400-10	1000 U/ml
saline solution	Hospira	0409-7138-09	0.9% sodium chloride
phenobarbital	Vortech	0298-9373-68
sodium citrate	Fisher Scientific	BP327-1
PBS	Sigma Aldrich	P4417-50TAB
Kimwipes for blotting	Fisher Scientific	06-666A
formamide	Sigma Aldrich	47670
microbalance	Denver Instrument	APX-60
microfuge tubes	Fisher Scientific	07-200-534
polystyrene 96 well plate	Becton Dickenson	351172
absorbance plate reader	BioTek	Synergy 2
polyacrylamide gels	Bio-Rad	3450014
protein molecular weight standard	Bio-Rad	1610374
Protran supported nitrocellulose	Amersham (GE)	10600015
gel box	Bio-Rad	1658005
Tris	Fisher Scientific	BP152-1
Tween20	Sigma Aldrich	P-1379
sodium chloride	Fisher Scientific	S271-1
primary NEP polyclonal antibody	R & D Systems	AF1182
doxycycline chow	Teklad (HARLAN)	TD.130750
FVB/NJ wild type mice	Jackson	001800
secondary antibody (goat anti-rabbit)	ZyMed	81-6120
ECL solution-Western Lightening Plus	PerkinElmer	NEL104001EA
film	Pierce	34091