Eine optimierte Evans blau Protokoll vaskulären Leck in der Maus bewerten

Zusammenfassung

In diesem Artikel ist eine kostengünstige, optimierte und einfache Protokoll beschrieben die verwendet die Evans-blauer Farbstoff-Methode zur Bewertung von Plasma Extravasation in den Organen der FVBN Mäuse, die für den Einsatz in anderen Sorten, Arten, und andere Organe oder Gewebe angepasst werden kann.

Zusammenfassung

Vaskuläre Leck oder Plasma Paravasation, hat eine Reihe von Ursachen, und möglicherweise eine schwerwiegende Folge oder Symptom einer entzündlichen Reaktion. Diese Studie kann letztlich führen zu neue Erkenntnisse über die Ursachen des oder neue Wege zu hemmen oder Plasma Extravasation zu behandeln. Es ist wichtig, dass Forscher die richtigen Werkzeuge, einschließlich der besten Methoden zur Verfügung, für das Studium Plasma Extravasation. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll mit der Evans blauen Farbstoff Methode, für die Beurteilung der Plasma Extravasation in den Organen der FVBN Mäuse. Dieses Protokoll ist absichtlich einfach, so groß wie möglich, aber bietet hohe Datenqualität. Evans blauen Farbstoff wurde gewählt, vor allem weil es einfach für den durchschnittlichen Labor zu verwenden. Wir haben dieses Protokoll verwendet, Hinweise und Unterstützung für die Hypothese, dass das Enzym Neprilysin das Gefäßsystem gegen Plasma Extravasation schützen kann. Jedoch kann dieses Protokoll experimentell eingesetzt und leicht abgestimmt für den Einsatz in anderen Stämme von Mäusen oder in anderen Arten, in vielen verschiedenen Organen oder Geweben, für Studien, die anderen Faktoren verbunden, die wichtig zu verstehen sein können, zu verhindern oder zu behandeln sind Plasma Extravasation. Dieses Protokoll wurde umfassend optimiert und modifiziert von bestehenden Protokolle und vereint Zuverlässigkeit, Benutzerfreundlichkeit, Wirtschaft, und allgemeine Verfügbarkeit von Material und Ausrüstung, machen dieses Protokoll überlegen für die durchschnittliche Labor in verwenden Quantifizierung der Plasma Extravasation von Organen.

Einleitung

Vaskuläre Leck in den Organen bezieht sich auf Paravasation, oder Austritt von Blutplasma durch Lücken in dem Endothel der produziert nach Kapillare Venolen in den Organen. Dieses Plasma Extravasation oder erhöhten vaskulären Permeabilität, die an irgendeiner Art von einer entzündlichen Reaktion entstehen, kann schwerwiegende Folgen haben. So ist es wichtig, dass dieses Phänomen, seine Ursachen, Modulatoren und folgen, sind studiert und verstanden, und ebenso, dass Ermittler gute tools und Protokolle, um sie zu studieren. Die endothelialen Lücken können über eine Reihe von Reizen hergestellt werden, aber in der Regel entstehen durch die Einwirkung von Peptid Neurotransmitter und/oder Tachykinins auf der gefäßendothelien. Die großen natürlich vorkommende Vermittler dieses Prozesses, führt zu erhöhten Plasma Paravasation, gehört die Undecapeptide Tachykinin Neuropeptid, Substanz P¹.

Methoden zu untersuchen und vaskulären Permeabilität oder Plasma Paravasation, Messen, die die albuminbindung Eigenschaft von Evans blauen Farbstoff verwenden, sind entwickelt worden, und sind in der Regel bekannt für ihre Genauigkeit, Einfachheit, Wirtschaftlichkeit, Sicherheit und Möglichkeit, dass die Bestimmung des Plasma Extravasation aus mehreren Geweben auf einmal wenn ja gewünscht^{2,3,4,5,6,7,8,9} . Dieses Evans blau-Protokoll für die Beurteilung der Plasma Extravasation in den Organen von FVBN Mäusen verwendet alle diese, aber fügt einige wichtigen Änderungen, mit denen es in der Regel nützlich und anpassungsfähig für zukünftige Studien, mit durchschnittlichen Labor, das führt oder wird Führen Sie wichtige Studien der Faktoren im Zusammenhang mit Plasma Extravasation oder vaskulären Permeabilität. In diesem Protokoll ist Substanz P, die Mäuse bei 1 Nmol/kg, eingeführt, die die Extravasation des Plasmas durch 1.5-fold ergänzt. Dies erhöht die Empfindlichkeit des Protokolls, woraus leichter beobachtbar und erhältlich resultiert. Andere Faktoren, die Einfluss auf Durchlässigkeit, wie verschiedene andere Peptide, Chemikalien oder einige Formen von toxischen Verletzungen oder verwendet werden können von anderen Labors, wie gewünscht untersucht. Halsschlagader-Injektionen werden in diesem Protokoll systemisch, einzuführen Evans blau und Substanz P verwendet, die terminal Operation erfordert. Halsschlagader Injektionen^5,7,10, sind auch nach Berücksichtigung der erforderlichen terminal Operationstechniken jedoch einfacher zu meistern und führen zur Produktion von konsistentere Ergebnisse als andere venöse Injektionen, Schwanz Vene Spritzen^4,9. Obwohl es für Evans blau von Retro-Orbital venösen Sinus-Injektionen zu liefernden möglich sind, wurden keine Hinweise in der Literatur gefunden, dass diese Art der Lieferung von Evans blau verwenden. Das hohe Maß an Expertise und Praxis reproduzierbar beherrschen diese Technik stark begrenzt jedoch wie bei Heck-Vene-Injektionen, seine Verwendung für erfolgreiche Evans blau-Injektionen. Im Gegensatz dazu bietet die alternative Halsschlagader Injektionsverfahren wie in unserem Protokoll beschrieben eine technisch erhältlich Lösung. Ein entscheidender Verfahren zur Perfusion der Maus Venen durchgeführt nur, nachdem das Opfer der Evans blau durchblutet Maus, entfernt überschüssige Evans blau färben und hat in diesem Protokoll standardisiert worden. Zuvor beschriebene Methoden der Perfusion wurden sorgfältig geprüft und geändert, um das vorliegende Verfahren zu erhalten. Andere Modifikationen, die hier beschrieben sind alle optimierten, unkompliziert und kostengünstig.

Es gibt einige wichtigeren Einschränkungen der Evans-blauer Farbstoff-Methode. Geringer Empfindlichkeit, manchmal verbunden mit dieser Methode kann beispielsweise einige grobe pathologischen und histologischen Zusatzprüfung von Geweben aus Evans blau injiziert Tiere verhindern. Diese und andere Einschränkungen führten jedoch zur Entwicklung von alternativen Methoden und Modelle, die jedoch nach wie vor Evans blau verwenden. Die Messung von Evans blau durch Fluoreszenz (und nicht von Visual-Palette) Spektroskopie kann erhöhen die Empfindlichkeit der Methode. Darüber hinaus war Fluoreszenzmikroskopie Evans blau gefärbten Gewebe entwickelt, damit für die Beobachtung der vaskulären Leck in deutlicher Standorte¹¹. Auch Ganzkörper-imaging und Scannen von einem lebenden Tier zuvor mit Evans blau¹² ermöglicht die Untersuchung von Evans blau Konzentrationen in kontinuierlicher Weise injiziert, anstatt an einer gewählten Zeit Punkt des Experiments. Allerdings ist diese Methode erfordert die Verfügbarkeit von geeigneten bildgebenden Einrichtungen, und kann sehr teuer sein. Änderungen bei Evans blau und in einem in Vitro Modell durchgeführt, haben wie z. B. in einer Zelle Kultur oder Küken chorioallantoic Modell¹³ (CAM) auch beschrieben worden. Diese Modelle werden durch Fluoreszenz und intravitalen¹⁴ Mikroskopie, überwacht und erlauben die Quantifizierung der vaskulären Permeabilität Veränderungen im Laufe der Zeit aber können werfen Fragen nach präzise Modellierung der in Vivo -Bedingungen und möglicherweise auch teuer.

Es wurden andere Methoden entwickelt, um zu bestimmen und zu quantifizieren, vaskuläre Leck oder Durchlässigkeit, die nicht die Verwaltung von Evans blau beinhalten. Diese Methoden können eine geeignete fluoreszierendes Molekül (z. B. Albumin oder Fluorescein) oder ein isotopisch beschriftete oder anderweitig tagged Molekül, Tiere Leben beschäftigen (oder um Zell-Kultur oder chorioallantoic (CAM) Modelle¹³, gefolgt von nicht-invasive Bildgebung (PET-Scanning, MRI, intravitalen Mikroskopie, ganze Körper-Scan) oder durch invasive Bildgebung (Fluoreszenz-Mikroskopie)^3,12,15. Obwohl diese Techniken eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen Evans blau Methoden anbieten können, haben sie auch Nachteile, die ihre erhebliche Komplexität, erforderliche Know-how, Ressourcen und hohen monetären Kosten beinhalten können.

Neprilysin¹⁶ (Peptidase Enzyms NEP, auch bekannt als CD10, MME oder Enkephalinase) ist vorgeschlagen worden, zu beteiligen, Hemmung der Plasma Paravasation, mindestens im Teil, durch die enzymatischen Metabolismus und Inaktivierung von endogene Substanz p. In Geweben, in denen die Zelle Oberfläche Peptidase NEP auftritt, kann es also eine Abschwächung der Wirkung der Substanz P, vermutlich durch die Peptidase Aktivität der NEP

Zunächst haben wir für die Substanz P-induzierte Plasma Extravasation Nutzung dieses modifizierte Evans blau-Protokoll mit FVBN Wildtyp (WT) und NEP-Knockout (KO)-Mäusen getestet. NEP Beteiligung an Substanz P-augmented Plasma Extravasation wurde aus diesen anfänglichen Studien vermutet, und wir beschreiben diese und weitere Experimente mit NEP Rolle im Plasma Extravasation. Im Mittelpunkt dieser Handschrift ist nicht NEP oder seiner Rolle im Plasma Paravasation, allerdings eher die Plasma Extravasation Experimente selbst. Die NEP-Ergebnisse sind repräsentativ für die Art der Ergebnisse, die durch Einsatz des modifizierten Protokolls erzielt werden können. Die Evans blau-Methode zur Messung der Plasma Extravasation wurden optimiert und verändert, wie im Detail unten für FVBN Mäuse beschrieben.

Protokoll

Alle geltende internationalen, nationalen und/oder institutionellen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren (Mäuse) folgten in den Experimenten in dieser Handschrift beschrieben.

Diese Methode verwendet FVBN Erwachsener Mäuse, im Alter von 16-20 Wochen, optimal für die Zwecke dieser Studie zu sein gefunden. Tag1 umfasst die Schritte 1-5 und Tag2 umfasst Schritte 6 und 7 (Abbildung 1).

1. Ausrüstung Vorbereitung

1. Sichern Sie eine ausreichende Versorgung mit steril, Einweg-Spritzen und Nadeln, wenn Ketamin/Xylazin als die Betäubung verwendet wird (wie empfohlen). Wenn Isofluran als die Betäubung verwendet wird, überprüfen Sie die Sauerstoffflasche und des Flüssigkeitsspiegels Isofluran, stellen Sie sicher, es gibt ausreichende Versorgung für das Experiment vor dem Start. Auch montieren Sie die Atmung Schaltungen Nosecone und bringen Sie sie zum Feld Induktion; Legen Sie neue Holzkohle Kanister auf Atmung Schaltungen. Bereiten Sie die Induktion-Box von der Sauerstoffzufuhr und Feststellung, dass die zweite Stufe ca. 50 Psi liest.
2. Schalten Sie das Heizkissen auf 37 ° C.
3. Die rektale Temperatur-Sonde für die Operation vorbereiten.

(2) Maus-Vorbereitung

Dieser Schritt umfasst die Anästhesie, Haarentfernung und Positionierung (FVBN Mäuse-Erwachsenenalter 16-20 Wochen).

1. Wiegen Sie die Mäuse und nehmen Sie die Gewichte auf.
2. Die Mäuse zu betäuben.
   1. Ketamin und Xylazin IP zu verwalten (80-100 mg/kg und 7,5-16 mg/kg, beziehungsweise). Es wird jedoch empfohlen, mit niedrigeren Dosen von Ketamin und Xylazin beginnen (über 30 mg/kg und 6 mg/kg, beziehungsweise).
   2. Aufrechterhaltung der Narkose mit etwa 0,1 - 0,25 Mal erste Dosen von Ketamin/Xylazin während der Operation. Ketamin und Xylazin waren die Narkose Bevollmächtigten der Wahl in dieser Studie mehr Reproduzierbarkeit und Überlebensfähigkeit beobachtet wurden. Die Narkose Bevollmächtigten Wahl in anderen Studien finden, um anders zu sein.  Wenn Isofluran verwendet wird, setzen Sie die Maus in eine Induktion Kammer und Isofluran auf 5 % schalten Sie ein, bis die Maus das volle Bewusstsein verliert. Verwenden Sie dann eine nasale Nosecone auf 1,5-2,5 % Isofluran für den Rest des Verfahrens festgelegt.
3. Überwachen Sie die Mäuse Alle 2-3 min durch Zehe Prise zu überprüfen, für die entsprechende Tiefe der Narkose.
4. Rasieren Sie die ventralen Halsbereich der Maus.
5. Platzieren Sie den Mauszeiger in Rückenlage auf dem vorgeheizten Pad. Die Pfoten und Füße von der Maus an die chirurgische Oberfläche mit Klebeband zu sichern.
6. Platzieren Sie künstliche Träne Salbe auf die Augen Austrocknen während der Operation zu verhindern.

3. chirurgische Details

1. Machen Sie einen 1 cm Schnitt am rechten ventralen Hals über der Halsschlagader.
2. Wenden Sie ein oder zwei Tropfen von Lidocain (1-2 %) in der Schnitt-Bereich für Schmerztherapie und Vasodilatation zu fördern. Warten Sie 2 Minuten für die Lidocain wirksam werden.
3. Aussetzen und den richtigen internen Halsschlagader über stumpfe Dissektion zu isolieren. Binden Sie die Vene aus mit 4: 0 Naht und einfahren Sie sanft rostral Ende des Gefäßes mit einer Gefäßklemme. Schneiden Sie ein Loch, mit feinen Schere, ca. 3 mm unten oder kaudalen, die Krawatte, etwa auf halbem Weg durch den Durchmesser der Vene.
4. Markieren Sie einen PV-1 polyvinyl Katheter 1,5 cm vom Ende stecken Sie ihn in die Halsschlagader durch das Loch mit einem Schiff Dilatator und Fädeln Sie den Katheter am kaudalen Ende des Schiffes, ca. 1,5 cm.
5. Binden Sie den Katheter sicher innerhalb der kaudalen Teil des Schiffes (unter dem Schnitt), mit 4: 0 Seide. Binden Sie die rostral Teil des Schiffes an der Außenseite des Katheters mit der losen Enden des Nahtmaterials die verwendet wurde, um die rostral Halsschlagader im Schritt 3.3 zu binden.
6. Tack die Haut locker zusammen zurück, um den Katheter mit 4: 0 Seide um Auskühlung und Austrocknung des Gewebes zu verhindern.
7. Verbinden Sie den Katheter mit eine Spritze mit heparinisierten Kochsalzlösung (10 U/mL) und spülen Sie des Katheters.

(4) Injektionen

1. Injizieren Sie die Evans blau-Lösung (50 μL einer 30 mg/mL Lösung in normaler, unheparinized Kochsalzlösung 0,9 % oder ca. 50 mg/kg) in der Halsschlagader Katheter, gefolgt von einem kleinen Volumen von heparinisierten Kochsalzlösung zu spülen Sie die Linie.
2. 2 min später, Substanz P (100 μl einer Lösung von 0,3 μM in normaler, unheparinized Kochsalzlösung 0,9 % oder 1 Nmol/kg), gefolgt von einem kleinen Volumen von heparinisierten Kochsalzlösung zu spülen Sie die Linie zu injizieren. Substanz P ergänzt die Extravasation der Plasmaproteine durch die endotheliale Schicht; in diesem Protokoll induziert es routinemäßig eine Aufwertung der Plasma Extravasation Werte von ca. 1,5-facher erleichtert Plasma Extravasation Werte zu messen.
3. Nach Injektion der Substanz P warten Sie 18 min.. Während dieser Zeit wird der Evans blauen Farbstoff equilibrate und zirkulieren.
4. Beenden Sie das Experiment 18 min nach der Injektion von Substanz P (20 min nach der Injektion Evans blau) durch Verzicht auf die Maus mit zervikale Dislokation. Es ist wahrscheinlich, dass die Maus direkt Zervikal ausgerenkt, ohne zuvor eine Überdosis Betäubungsmittel, wie die Maus ist wahrscheinlich noch gut betäubt von der Operation. Jedoch, wenn es notwendig ist, kann eine Überdosis Narkosemittel Ketamin/Xylazin, Isofluran oder Pentobarbital gegeben werden gefolgt von zervikale Dislokation.

(5) Isolation der Organe

1. Aufschneiden der Brusthöhle der Maus und Schwerkraft-perfundieren (aus einer Höhe von ca. 51 cm oder 20") das Herz und die Blutgefäße mit 50 mL Natriumcitrat 50 mM, pH 3,5. pH 3,5 bewahrt vermutlich Evans blau Bindung an Albumin.
2. Verbrauchsteuern Sie 1-5 zuständigen Organe (Gewebe) mit einem sezierenden Skalpell (z.B. Harnblase, Niere, Magen, Leber, Bauchspeicheldrüse, proximalen oder distalen Colon, Ileum, Zwölffingerdarm, Flanke Haut, Ohren, Rute, Herz und/oder Lunge) und entfernen Sie alle restlichen Inhalte zu, wenn anwesend.
3. Spülen Sie die Organe bei Raumtemperatur (RT) Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS; 1,44 g Na₂HPO4, 0,24 g KH₂PO4, 8,0 g NaCl und 0,20 g KCl in 1 L, pH 7.4).
4. Tupfen Sie die Organe mit Gewebe, jedes Organ in zwei Hälften schneiden und wiegen jeweils die Hälfte (nass Gewichten in g).
5. Trocknen Sie eine Hälfte des Gewebes in einem Trockenschrank bei 150 ° C, auf Folie, für 48 h.
6. Legen Sie die andere Hälfte in eine einheitliche Lautstärke (bis zu 200 µL) von Formamid in ein Microfuge Rohr für 48 h (und bis zu 72 h) Gewebe, die Evans blau zu extrahieren.

6. Messung des Gewebes OD

1. Entfernen Sie 50 µL Evans blau angereichertes Formamid (nach 48-72 h RT Inkubation) aus Microfuge Rohr und Ort in einem Brunnen einer 96-Well Polystyrol Platte. Achten Sie darauf, dass Sie nicht Gewebe Stücke zusammen mit der Formamid übertragen.
2. Platz 50 µL des neuen, reinen Formamid in jeder der zwei leeren Brunnen der 96-Well-Platte für die Rohlinge.
3. Messung und Aufzeichnung der OD-₆₂₀ von jedem Bohrloch 96-Well-Platte auf eine Extinktion Platte Leser. 620 nm ist die Absorption von Evans Blue max.

7. Berechnung der Plasma Extravasation

1. Das trockene Gewebe wiegen die Hälfte in den Ofen für 48 h wurde.
2. Berechnen Sie die nassen Gewicht/Dry-Gewichts-Verhältnis für die spezifische Orgel aus jeder einzelnen Maus, beginnend mit dem Frischgewicht dieses Gewebes halb (erhaltene in Schritt 5.4), dividiert durch das Trockengewicht dieses gleichen Gewebes halb (erhaltene in Schritt 7.1).
3. Berechnen Sie dem Trockengewicht (in g) des Gewebes Hälfte in Formamid dividiert das Frischgewicht des Gewebes Hälfte davor war in Formamid (in Schritt 5.4 erhaltenen) durch Nässe gelegt: Trockengewicht Verhältnis für die spezifische Orgel von Interesse (gerechnet in Schritt 7.2).
4. Berechnen Sie die korrigierte OD₆₂₀ Werte. Beginnend mit der OD-₆₂₀ Wert aus jeder experimentellen Brunnen von den 96-Well-Platte (mit Evans blau angereichertes Formamid aus jedem Gewebe, erwarb Schritt 6.3), subtrahieren die leeren gut OD₆₂₀ Wert (der OD₆₂₀ Mittelwert die zwei Brunnen mit reinen Formamid, zubereitet im Schritt 6.2, OD₆₂₀ Werte in Schritt 6.3) von jedem experimentellen Wert.
5. Berechnen Sie den Plasma Extravasation Wert durch Division der korrigierten OD₆₂₀ (berechnet in Schritt 7.4) durch das Trockengewicht des Gewebes die Hälfte in Formamid (berechnet in Schritt 7.3). Die Einheiten der Plasma Extravasation werden OD620/g Trockengewicht.
6. Daten analysieren und ausdrücklich als Mittelwert ± SEM statistisch vergleichen Gruppen von t-Test oder Einweg Varianzanalyse und Scheffé Multiple-Vergleichstest (lycofs01.lycoming.edu), je nach Bedarf.

Ergebnisse

In Abbildung 1ist eine schematische Darstellung des Verfahrens gezeigt, die gefunden wurde, um die zuverlässige und konsistente Substanz P-induzierte Plasma Extravasation Werte von den Organen der FVBN Mäuse zur Folge haben. Dieser Vorgang dauert in der Regel zwei Tage Arbeit, getrennt durch mindestens 48 h der Wartezeit. Es ist möglich, noch mehr zu verbreiten, geschieht dies konsequent für alle Experimente zu vergleichen. Zum Beispiel nach die Organen a...

Diskussion

Wie oben besprochen, kann das Studium der Plasma Extravasation letztlich neue Erkenntnisse über die Ursachen des oder führen neue Wege zu hemmen oder Plasma Extravasation zu behandeln. Der erfolgreiche Einsatz des Protokolls Plasma Extravasation (oben), wurde mit Evans blau färben, im aktuellen Manuskript nachgewiesen. Obwohl die gezeigten Daten wieder die Hypothese, dass NEP kann das Gefäßsystem schützen gegen Plasma Paravasation, dies ist ein sekundäres Ziel derzeit mit dem primären Ziel, um ein optimiertes Pro...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
isoflurane	Vet One	200-070	inhaled anesthetic
ketamine	Vet One	200-055	injectable anesthetic
xylazine	Lloyd Laboratories	139-236	injectable anesthetic
syringes (10,3 & 1 cc)	Becton Dickinson	309604, 309657, 309659
needles (20G1,23G1 & 26G1/2)	Becton Dickinson	305178, 305193, 305111
isoflurane induction chamber	VetEquip	941443	1 Liter
nosecone breathing circuits	VetEquip	RC2	Rodent Circuit Controller 2
oxygen tank	Airgas	UN 1072	100% medical
heating pad	CWE Inc.	TC-1000	temperature controller
rectal temperature probe	CWE Inc.	10-09012	mouse
balance (for rodents)	Ohaus	CS 2000
surgical tools-scissors	Fine Science tools	15000-00	Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11151-10	Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels)
surgical tools-hemostats	Fine Science tools	13009-12	Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue)
surgical tools -suture drivers	Fine Science tools	12502-12	Olsen-Hegar suture drivers (suturing)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11627-12	Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14110-15	Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	18025-10	suture tying forceps (used for Millar cath)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14078-10	Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11254-20	Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14082-09	Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11051-10	10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11251-35	Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels)
surgical tools-retractors	Fine Science tools	17012-11	Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11294-00	Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11297-00	Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14058-11	tough cut iris scissors (mouse dissection, bones)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11009-13	serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat)
surgical tools-hemostats	Fine Science tools	13003-10	Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11006-12	Adson serrated forceps (tissue grasping)
clippers	Oster	A5
tape	Fisherbrand	159015G
artificial tear ointment	Akorn Inc	13985-600-03
lidocaine	Hospira	0409-4277-01	2% injectable
polyvinyl catheters	Tygon	PV-1
Evans blue	Sigma Aldrich	E2129
Substance P	Bachem	H-1890
heparin	Sagent Pharmaceuticals	25201-400-10	1000 U/ml
saline solution	Hospira	0409-7138-09	0.9% sodium chloride
phenobarbital	Vortech	0298-9373-68
sodium citrate	Fisher Scientific	BP327-1
PBS	Sigma Aldrich	P4417-50TAB
Kimwipes for blotting	Fisher Scientific	06-666A
formamide	Sigma Aldrich	47670
microbalance	Denver Instrument	APX-60
microfuge tubes	Fisher Scientific	07-200-534
polystyrene 96 well plate	Becton Dickenson	351172
absorbance plate reader	BioTek	Synergy 2
polyacrylamide gels	Bio-Rad	3450014
protein molecular weight standard	Bio-Rad	1610374
Protran supported nitrocellulose	Amersham (GE)	10600015
gel box	Bio-Rad	1658005
Tris	Fisher Scientific	BP152-1
Tween20	Sigma Aldrich	P-1379
sodium chloride	Fisher Scientific	S271-1
primary NEP polyclonal antibody	R & D Systems	AF1182
doxycycline chow	Teklad (HARLAN)	TD.130750
FVB/NJ wild type mice	Jackson	001800
secondary antibody (goat anti-rabbit)	ZyMed	81-6120
ECL solution-Western Lightening Plus	PerkinElmer	NEL104001EA
film	Pierce	34091