Um otimizado Evans Blue protocolo para avaliar vazamento Vascular no Mouse

Resumo

Neste artigo, um protocolo simples, econômico e otimizado é descrito que usa o método de corante azul de Evans para avaliar o extravasamento de plasma nos órgãos de ratos FVBN que pode ser adaptada para uso em outras cepas, espécies e outros órgãos ou tecidos.

Resumo

Vazamento vascular ou extravasamento de plasma, tem um número de causas e pode ser uma grave consequência ou sintoma de uma resposta inflamatória. Neste estudo, finalmente, pode levar a novos conhecimentos sobre as causas ou novas formas de inibir ou tratar o extravasamento de plasma. É importante que os pesquisadores tenham as ferramentas apropriadas, incluindo os melhores métodos disponíveis, para estudar o extravasamento de plasma. Neste artigo, descrevemos um protocolo, usando o método do corante azul de Evans, para avaliar o extravasamento de plasma nos órgãos de ratos FVBN. Este protocolo é intencionalmente simples, para tão grande um grau possível, mas fornece dados de alta qualidade. Corante de azul de Evans foi escolhido principalmente porque é fácil para o laboratório de médio a usar. Usamos este protocolo para fornecer provas e suporte para a hipótese de que a enzima neprilysin que proteja a vasculatura contra extravasamento de plasma. No entanto, este protocolo pode ser usado experimentalmente e facilmente adaptado para uso em outras cepas de ratos ou em outras espécies, em muitos diferentes órgãos ou tecidos, para estudos, que pode envolver outros fatores que são importantes para a compreensão, prevenção ou tratamento de extravasamento de plasma. Este protocolo foi extensivamente otimizado e modificado de protocolos existentes e combina confiabilidade, facilidade de uso, economia e disponibilidade geral de materiais e equipamentos, fazendo com que este protocolo superior pelo laboratório média para uso em quantificando o extravasamento de plasma de órgãos.

Introdução

Vazamento vascular nos órgãos refere-se ao extravasamento, ou vazamento de plasma sanguíneo através de aberturas produzido no endotélio de pós capilares vênulas nos órgãos. Este extravasamento de plasma ou aumento da permeabilidade vascular, que pode decorrer de algum tipo de reacção inflamatória, pode ter graves consequências. Assim, é importante que este fenômeno, suas causas, moduladores e consequências, são estudadas e entendidas, e da mesma forma, que os investigadores têm boas ferramentas e protocolos com os quais a estudá-los. As lacunas endoteliais podem ser produzidas através de uma série de estímulos, mas geralmente são produzidas pela ação de neurotransmissores do peptide e/ou taquininas sobre o endothelia. Um dos principais mediadores naturais deste processo, o que resulta em extravasamento de plasma aumentado, é o undecapeptide tachykinin neuropeptide, substância P¹.

Métodos para investigar e medir a permeabilidade vascular ou extravasamento de plasma, que usam a propriedade de ligação de albumina de corante azul de Evans, foram desenvolvidos e são geralmente conhecidos pela sua precisão, simplicidade, economia, segurança e capacidade de permitir que o determinação de extravasamento de plasma de vários tecidos ao mesmo tempo, se assim desejado^{2,3,4,5,6,7,,89} . Este protocolo de azul de Evans para avaliar o extravasamento de plasma nos órgãos de ratos FVBN usa todas essas, mas adiciona algumas importantes modificações que tornam geralmente útil e adaptável para futuros estudos, envolvendo o laboratório de médio que conduz ou será realizar estudos importantes de fatores associados com extravasamento de plasma ou a permeabilidade vascular. Neste protocolo, a substância P é introduzido aos ratos 1 nmol/kg, o que aumenta o extravasamento de plasma por 1.5-fold. Isto aumenta a sensibilidade do protocolo, resultando em resultados mais facilmente observáveis e alcançável. Outros fatores que afetam a permeabilidade, como vários outros peptídeos, substâncias químicas ou algumas formas de lesão tóxica, podem ser usados ou estudados por outros laboratórios, como desejado. Veia jugular injeções são utilizadas neste protocolo apresentar azul de Evans e substância P sistemicamente, que requer cirurgia terminal. No entanto, veia jugular injeções^5,7,10, mesmo após a consideração das necessárias técnicas cirúrgicas terminais, são mais fáceis de dominar e levam à produção de resultados mais consistentes do que outro injeções venosas, incluindo a cauda veia injeções^4,9. Embora seja possível para Evans azul ser entregue por injeções de seio venoso orbital retrô, não há referências na literatura foram encontradas que usam este método de entrega de azul de Evans. No entanto, quanto a injeções de veia da cauda, o alto grau de especialização e prática reproducibly dominar esta técnica extremamente limita seu uso para injeções bem sucedidas de azul de Evans. Em contraste, o método de injeção alternativa veia jugular, conforme descrito em nosso protocolo, oferece uma solução tecnicamente obtenível. Um procedimento crucial para perfusão das veias do rato, realizado logo após o sacrifício do rato azul-perfundidos Evans, remove o excesso corante azul de Evans e tem sido padronizado neste protocolo. Métodos anteriormente descritos de perfusão foram cuidadosamente examinados e modificados para obter o presente procedimento. Outras modificações aqui descritas são todos otimizada, simples e barato.

Existem algumas limitações importantes de método de corante azul de Evans. Por exemplo, baixa sensibilidade, às vezes associada com este método pode impedir alguns adicional bruta exame patológico e histológica de tecidos de animais injetado azul de Evans. No entanto, estas e outras limitações conduziram ao desenvolvimento de métodos alternativos e modelos que, não obstante, ainda usam azul de Evans. A medição de azul de Evans por fluorescência (em vez de alcance visual) espectroscopia pode aumentar a sensibilidade do método. Além disso, a microscopia de fluorescência dos tecidos manchadas de azul de Evans foi desenvolvida para permitir a observação de vazamento vascular nas mais distintas localidades¹¹. Também, todo o corpo de imagem e digitalização de um animal vivo previamente injetaram com Evans azul¹² permite a investigação das concentrações de azul de Evans de forma contínua, em vez de em um específico escolhido tempo momento do experimento. No entanto, este método requer a disponibilidade de instalações adequadas de imagem e pode ser muito caro. Modificações envolvendo Evans azul e executados em um tipo in vitro do modelo, como em uma célula de cultura ou garota corioalantoicas modelo¹³ (CAM) também foram descritos. Estes modelos são monitorados por fluorescência e microscopia intravital¹⁴ e permitam a quantificação de alterações de permeabilidade vascular ao longo do tempo, mas podem levantar questões sobre modelagem exata das condições na vivo e também podem ser caro.

Há outros métodos desenvolvidos para determinar e quantificar vazamento vascular ou permeabilidade, que não envolvem a administração de azul de Evans. Esses métodos podem empregar uma molécula fluorescente apropriada (como albumina ou fluoresceína), ou uma molécula etiquetada desvendar etiquetada ou não, de animais vivos (ou a célula cultura ou corioalantoicas (CAM) modelos¹³, seguido por não-invasiva Imaging (digitalização de PET, MRI, microscopia intravital, varredura de corpo inteiro) ou por invasivas de imagens (microscopia fluorescente)^3,12,15. Embora essas técnicas podem oferecer um número de vantagens sobre outros Evans métodos azuis, eles também têm desvantagens, que podem incluir seus consideráveis complexidades, necessária experiência, recursos e elevados custos monetários.

Neprilysin¹⁶ (peptidase enzima NEP, também conhecido como CD10, MME ou Enkephalinase) foi sugerido para ser envolvido na inibição de extravasamento de plasma, pelo menos em parte, através do metabolismo enzimático e inactivação de p. de substância endógena Assim, nos tecidos em que ocorre o peptidase de superfície celular NEP, pode haver uma atenuação do efeito da substância P, presumivelmente pela atividade peptidase de NEP.

Inicialmente, nós testamos para extravasamento de plasma induzido por substância P, utilizando este protocolo modificado de azul de Evans, com FVBN selvagem tipo (WT) e ratos de NEP nocaute (KO). Envolvimento do NEP no extravasamento de plasma aumentada de substância P suspeitou-se destes estudos iniciais, e nós descrever estas experiências ainda mais o papel do NEP envolvendo em extravasamento de plasma. No entanto, não é o foco deste manuscrito NEP ou seu papel no extravasamento de plasma, mas prefiro o extravasamento de plasma experimentos próprios. Os resultados do NEP são representativos do tipo de resultados que podem ser obtidos através do uso do presente protocolo modificado. O método de azul de Evans para medir o extravasamento de plasma foi otimizado e modificado, conforme descrito em detalhe abaixo para os ratos FVBN.

Protocolo

Todas as orientações aplicáveis internacionais, nacionais e/ou institucionais para o cuidado e o uso de animais (ratos) foram seguidas nos experimentos descritos neste manuscrito.

Esse método usa ratos adultos FVBN, com idades entre 16-20 semanas, encontrado para ser o ideal para os fins deste estudo. Dia 1 inclui as etapas 1 a 5 e dia 2 inclui as etapas de 6-7 (Figura 1).

1. preparação do material

1. Assegurar um fornecimento adequado de seringas descartáveis, esterilizadas e agulhas, se xilazina/cetamina é usada como anestésico (como recomendado). Se isoflurano é usado como anestésico, verifique se o tanque de oxigênio e o nível do líquido de isoflurano para certificar-se de que há um fornecimento adequado para o experimento antes de começar. Também, montar o cone do nariz respirando circuitos e anexá-los à caixa de indução; Anexe novos cilindros de carvão para os circuitos de respiração. Prepare a caixa de indução ligando o oxigênio e verificar que a segunda fase lê aproximadamente 50 psi.
2. Ligue o aquecimento pad a 37 ° C.
3. Prepare a sonda de temperatura retal para a cirurgia.

2. Mouse preparação

Esta etapa inclui anestesia, depilação e posicionamento (FVBN ratos-idade adulta 16-20 semanas).

1. Pesar os ratos e registar os pesos.
2. Anestesia os ratos.
   1. Administrar IP ketamina e xilazina (80-100 mg/kg e 7,5-16 mg/kg, respectivamente). No entanto, recomenda-se começar com doses menores de ketamina e xilazina (sobre 30 mg/kg e 6 mg/kg, respectivamente).
   2. Manter a anestesia com cerca de 0,1 - 0,25 vezes inicial doses de cetamina/xilazina durante a cirurgia. Ketamina e xilazina foram o agente anestésico (s) de escolha neste estudo específico, como observaram-se mais a reprodutibilidade e a capacidade de sobrevivência. O agente anestésico (s) de escolha em outros estudos pode ser encontradas para ser diferente.  Se o isoflurano é usado, coloque o mouse em uma câmara de indução e ligue isoflurano para 5% até o mouse perde a consciência plena. Em seguida, use um cone de nariz nasal de isoflurano 1,5-2,5% no restante do processo.
3. Monitore os ratos cada 2-3 min pitada de dedo do pé para verificar se há profundidade apropriada da anestesia.
4. Raspe a região do pescoço ventral do mouse.
5. Posicione o mouse na posição supina sobre a almofada pré-aquecido. Prenda as patas e pés do mouse à superfície com fita cirúrgica.
6. Coloque a pomada de lágrima artificial para os olhos para evitar que sequem durante a cirurgia.

3. detalhes cirúrgicas

1. Faça uma incisão de 1 cm no pescoço bem ventral sobre a veia jugular.
2. Aplica uma ou duas gotas de lidocaína (1-2%) para a área de incisão para tratamento da dor e promover a vasodilatação. Espere 2 min. para a lidocaína seja efetivada.
3. Expor e isolar a veia jugular interna direita através de dissecção romba. Amarrar a veia com sutura de 4-0 e gentilmente retrair extremidade rostral do navio com uma pinça hemostática. Corte um buraco, usando a tesoura bem, cerca de 3 mm abaixo ou caudal para a gravata, aproximadamente na metade do diâmetro da veia.
4. Marcar um cateter de polivinil PV-1 1,5 cm da extremidade e inseri-lo na veia jugular no orifício, usando um dilatador de vaso e passe o cateter no caudal final do navio, cerca de 1,5 cm.
5. Amarre o cateter firmemente dentro da parte caudal do navio (abaixo do corte), com seda 4-0. Amarre a parte rostral do navio à parte externa do cateter, com as pontas soltas da sutura que foi usado para amarrar a veia jugular rostral, na etapa 3.3.
6. Aderência a pele frouxamente de volta ao redor do cateter com seda 4-0 para ajudar a prevenir a perda de calor do corpo e desidratação dos tecidos.
7. Conectar o cateter a uma seringa contendo soro fisiológico heparinizado (10 U/mL) e irrigue o cateter.

4. injeções

1. Injete a solução de azul de Evans (50 μL de solução 30 mg/mL em soro fisiológico a 0,9% normal, unheparinized, ou aproximadamente 50 mg/kg) o cateter da veia jugular, seguido por um pequeno volume de solução salina heparinizada para liberar a linha.
2. 2 min depois, injetar substância P (100 μL de solução 0,3 mm em soro fisiológico a 0,9% normal, unheparinized, ou 1 nmol/kg), seguido por um pequeno volume de solução salina heparinizada para liberar a linha. Substância P aumenta o extravasamento de proteínas do plasma através da camada endotelial; neste protocolo, rotineiramente induz um aumento dos valores de extravasamento de plasma de aproximadamente 1.5-fold, facilitando a plasma valores de extravasamento medir.
3. Espere 18 min depois que a substância P é injetado. Durante este tempo, o corante azul de Evans vai equilibrar e fazer circular.
4. Encerrar o experimento 18 min após a injeção da substância P (20 min após a injeção de azul de Evans), sacrificando o mouse com deslocamento cervical. É provável que o mouse pode ser diretamente cervically deslocado, sem primeiro dar uma overdose de anestésico, como o mouse é provavelmente ainda bem anestesiado da cirurgia. No entanto, se for necessário, uma overdose de anestésico cetamina/xilazina, isoflurano, o pentobarbital pode ser dadas, seguido por deslocamento cervical.

5. isolamento dos órgãos

1. Abrir a cavidade do peito do rato e gravidade-perfundir (de uma altura de cerca de 51 cm ou 20") o coração e os vasos sanguíneos com 50 mL de citrato de sódio de 50 mM, pH 3,5. pH 3.5 presumivelmente preserva a ligação azul de Evans a albumina.
2. 1-5 órgãos pertinentes (tecidos) com um bisturi de dissecação (por exemplo, a bexiga urinária, rim, estômago, fígado, pâncreas, proximal ou distal do cólon, íleo, duodeno, flanco pele, orelhas, cauda, coração, e/ou pulmões) impostos especiais de consumo e remover qualquer conteúdo residual, se presente.
3. Lave os órgãos em temperatura ambiente (RT) fosfato salino (PBS; 1,44 g de Na₂HPO4, 0,24 g de KH₂PO4, 8,0 g de NaCl e 0,20 g de KCl em 1 L, pH 7,4).
4. Blot-os órgãos com tecido, corte cada órgão ao meio, e pesar cada metade (molhado pesos, em g).
5. Secar uma metade do tecido em um forno de secagem a 150 ° C, na folha, por 48 h.
6. Coloque o metade em um volume consistente (até 200 µ l) de formamida em uma microcentrífuga tubo para 48 h (e até 72 h) outros tecidos para extrair o azul de Evans.

6. medição de tecido OD

1. Retire 50 µ l de Evans azul-infundido formamida (após incubação de 48-72 h RT) do tubo de microcentrífuga e lugar para um poço de uma placa de poliestireno de 96 poços. Tenha cuidado para não transferir partes de tecido junto com o formamide.
2. Colocar 50 µ l de formamida nova, pura, em cada um dos dois poços vazios da placa de 96 poços para os espaços em branco.
3. Medir e registrar o OD₆₂₀ de cada poço da placa de 96 poços em um leitor de placa de absorvância. 620 nm é a absorbância máxima de azul de Evans.

7. cálculo de extravasamento de Plasma

1. Pesar o tecido seco metade que foi ao forno por 48 h.
2. Calcule a relação de peso de peso molhado/seco para o órgão específico de interesse de cada mouse individual, começando com o peso molhado deste tecido metade (obtidos no passo 5.4), dividido pelo peso seco do tecido mesmo metade (obtidos no passo 7.1).
3. Calcular o peso seco do tecido (em g) metade em formamida, dividindo o peso úmido do tecido metade antes que ele foi colocado em formamida (obtida na etapa 5.4) pelo molhado: relação de peso seco para o órgão específico de juros (calculados na etapa 7.2).
4. Calcule os valores corrigidos de₆₂₀ OD. Começando com o OD₆₂₀ o valor de cada poço experimental da placa de 96 poços (contendo Evans azul-infundido formamide de cada tecido, obtido na etapa 6.3), subtrair o valor em branco bem OD₆₂₀ (o OD₆₂₀ valor médio de os dois poços que contêm o formamide puro, preparado na etapa 6.2, OD₆₂₀ valores obtidos na etapa 6.3) de cada valor experimental.
5. Calcule o valor de extravasamento de plasma dividindo o OD corrigido₆₂₀ (calculado na etapa 7,4) por peso seco do tecido metade em formamida (calculado no passo 7.3). As unidades de extravasamento de plasma será o peso seco da OD620/g.
6. Analisar dados e expresso como a média ± SEM. estatisticamente comparar grupos pelo teste t ou unidirecional análise de variância e teste de comparação múltipla de Scheffé (lycofs01.lycoming.edu), conforme o caso.

Resultados

Na Figura 1, um esquema do procedimento é mostrado, que foi encontrado para resultar nos valores de extravasamento plasma induzido por substância P mais confiável e consistente de órgãos de ratos FVBN. Este procedimento geralmente leva dois dias de trabalho, separados pelo menos 48 h de tempo de espera. É possível para espalhá-lo ainda mais, se isso for feito consistentemente para todos os experimentos a serem comparadas. Por exemplo, depois que os ó...

Discussão

Como discutido acima, o estudo de extravasamento de plasma em última análise, pode levar a novos conhecimentos sobre as causas ou novas formas de inibir ou tratar o extravasamento de plasma. O uso bem sucedido do protocolo de extravasamento de plasma (acima), usando o corante azul de Evans, foi demonstrado no manuscrito atual. Embora os dados mostrados volta a hipótese que a NEP pode proteger a vasculatura contra extravasamento de plasma, este é um objetivo secundário atualmente, com o objetivo primário de apresent...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
isoflurane	Vet One	200-070	inhaled anesthetic
ketamine	Vet One	200-055	injectable anesthetic
xylazine	Lloyd Laboratories	139-236	injectable anesthetic
syringes (10,3 & 1 cc)	Becton Dickinson	309604, 309657, 309659
needles (20G1,23G1 & 26G1/2)	Becton Dickinson	305178, 305193, 305111
isoflurane induction chamber	VetEquip	941443	1 Liter
nosecone breathing circuits	VetEquip	RC2	Rodent Circuit Controller 2
oxygen tank	Airgas	UN 1072	100% medical
heating pad	CWE Inc.	TC-1000	temperature controller
rectal temperature probe	CWE Inc.	10-09012	mouse
balance (for rodents)	Ohaus	CS 2000
surgical tools-scissors	Fine Science tools	15000-00	Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11151-10	Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels)
surgical tools-hemostats	Fine Science tools	13009-12	Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue)
surgical tools -suture drivers	Fine Science tools	12502-12	Olsen-Hegar suture drivers (suturing)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11627-12	Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14110-15	Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	18025-10	suture tying forceps (used for Millar cath)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14078-10	Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11254-20	Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14082-09	Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11051-10	10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11251-35	Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels)
surgical tools-retractors	Fine Science tools	17012-11	Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11294-00	Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11297-00	Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14058-11	tough cut iris scissors (mouse dissection, bones)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11009-13	serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat)
surgical tools-hemostats	Fine Science tools	13003-10	Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11006-12	Adson serrated forceps (tissue grasping)
clippers	Oster	A5
tape	Fisherbrand	159015G
artificial tear ointment	Akorn Inc	13985-600-03
lidocaine	Hospira	0409-4277-01	2% injectable
polyvinyl catheters	Tygon	PV-1
Evans blue	Sigma Aldrich	E2129
Substance P	Bachem	H-1890
heparin	Sagent Pharmaceuticals	25201-400-10	1000 U/ml
saline solution	Hospira	0409-7138-09	0.9% sodium chloride
phenobarbital	Vortech	0298-9373-68
sodium citrate	Fisher Scientific	BP327-1
PBS	Sigma Aldrich	P4417-50TAB
Kimwipes for blotting	Fisher Scientific	06-666A
formamide	Sigma Aldrich	47670
microbalance	Denver Instrument	APX-60
microfuge tubes	Fisher Scientific	07-200-534
polystyrene 96 well plate	Becton Dickenson	351172
absorbance plate reader	BioTek	Synergy 2
polyacrylamide gels	Bio-Rad	3450014
protein molecular weight standard	Bio-Rad	1610374
Protran supported nitrocellulose	Amersham (GE)	10600015
gel box	Bio-Rad	1658005
Tris	Fisher Scientific	BP152-1
Tween20	Sigma Aldrich	P-1379
sodium chloride	Fisher Scientific	S271-1
primary NEP polyclonal antibody	R & D Systems	AF1182
doxycycline chow	Teklad (HARLAN)	TD.130750
FVB/NJ wild type mice	Jackson	001800
secondary antibody (goat anti-rabbit)	ZyMed	81-6120
ECL solution-Western Lightening Plus	PerkinElmer	NEL104001EA
film	Pierce	34091