En iyi duruma getirilmiş bir Evans mavi Mouse vasküler sızıntı değerlendirmek için iletişim kuralı

Özet

Bu makalede, ekonomik, en iyi duruma getirilmiş ve basit bir protokol bu Evans mavi boya yöntemi diğer suşları, türler ve diğer organ veya doku kullanmak için adapte edilebilir FVBN farelerin organlarda plazma ekstravazasyonu değerlendirmek için kullandığı açıklanmıştır.

Özet

Vasküler sızıntı veya plazma ekstravazasyonu, bir nedeni vardır ve ciddi sonucu veya bir enflamatuar yanıt belirtisi olabilir. Bu çalışmada sonuçta nedenleri ile ilgili yeni bilgi ya da inhibe veya plazma ekstravazasyonu tedavi etmek için yeni yollar açabilir. Araştırmacılar plazma ekstravazasyonu çalışmak için en iyi yöntemler kullanılabilir, dahil olmak üzere uygun araçlara sahip önemlidir. Bu makalede, biz FVBN farelerin organlarda plazma ekstravazasyonu değerlendirmek için Evans mavi boya yöntemini kullanarak bir protokol tanımlamak. Bu iletişim kuralı kasten basittir, için iyi bir derece, mümkün olduğunca ama sağlar yüksek kalitede veri. Evans mavi boya öncelikle çünkü kullanmak ortalama laboratuvar için kolay seçildi. Enzim neprilysin plazma ekstravazasyonu karşı damarlara korusun hipotez için kanıt ve destek sağlamak için bu protokolü kullanmış. Ancak, bu iletişim kuralını deneysel olarak kullanılan olabilir ve kolayca anlama, önlenmesi ve tedavisinde önemli diğer faktörler içerebilir çalışmaları için diğer suşların fareler veya diğer türler, birçok farklı organ veya doku, kullanılacak adapte plazma ekstravazasyonu. Bu iletişim kuralı kapsamlı bir şekilde optimize edilmiş ve kullanımı, ekonomi ve genel availability-in malzeme ve ekipman, bu iletişim kuralını kullanmak ortalama laboratuvar için üstün yapım kolaylığı varolan iletişim kuralları ve birleştiren güvenilirlik modifiye, plazma ekstravazasyonu düşük organlarını miktarının.

Giriş

Organlarda vasküler sızıntı ekstravazasyonu için başvurur veya kan plazma arasındaki endotel üretilen geçitlerden kaçağı sonrası kapiller venüller organlarda. Bu plazma ekstravazasyonu veya bazı tip bir enflamatuar yanıt ortaya çıkabilecek, artmış vasküler geçirgenliği ciddi sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, bu fenomen, nedenleri, modülatörler ve sonuçları, okudu ve anlaşılır, aynı şekilde, müfettişler kadrini ve araçları protokol önemli ve onları çalışma kullanılacak. Endotel boşluklar uyaran bir dizi üretilen ama genellikle peptid nörotransmitter ve/veya tachykinins endothelia üzerinde eylem tarafından üretilmektedir. Artmış plazma ekstravazasyonu oluşur, bu sürecin önemli doğal olarak meydana gelen arabulucular biridir undecapeptide tachykinin peptit, madde P¹.

Evans mavi boya albümin-bağlama özelliği kullanmak, araştırmak ve vasküler geçirgenliği veya plazma ekstravazasyonu, ölçmek için yöntemler geliştirilmiştir ve genellikle onların doğruluğu, basitlik, ekonomi, güvenlik ve izin yeteneği için bilinen Hemen, plazma ekstravazasyonu birkaç doku üzerinden belirlenmesi Eğer öyleyse istenen^{2,3,4,5,6,7,8,9} . Plazma ekstravazasyonu organlarda FVBN farelerin değerlendirmek için bu Evans mavi iletişim kuralı tüm bunlar kullanır, ancak genellikle yararlı ve gelecekteki araştırmalar yapar veya olacak ortalama laboratuvar içeren, uyarlanabilir olsun bazı önemli değişiklikler ekler plazma ekstravazasyonu veya vasküler geçirgenliği ile ilişkili faktörler önemli çalışmalar yapmak. Bu protokol için madde P 1 nmol/kg, hangi 1.5-fold tarafından plazma ekstravazasyonu zenginleştirerek fareler için verilir. Bu daha kolay gözlemlenebilir ve elde edilebilecek sonuçlarında ortaya çıkan protokolü, hassasiyeti artırır. Geçirgenliği gibi çeşitli diğer peptidler, kimyasal madde veya toksik yaralanma, bazı türlerinin etkileyen diğer faktörler kullanılan ya da istediğiniz gibi diğer laboratuvarlar tarafından okudu. Juguler ven enjeksiyonları terminal ameliyat gerektiren Evans mavi ve madde P sistemik, tanıtmak için bu protokol için kullanılır. Ancak, juguler ven enjeksiyonları^5,7,10, hatta gerekli terminal cerrahi teknikleri, dikkate sonra daha kolay usta ve diğerinden daha tutarlı sonuçlar üretim yol venöz enjeksiyonu, kuyruk dahil olmak üzere enjeksiyonları^4,9damar. Retro-orbital venöz sinüs enjeksiyonları tarafından teslim edilmek üzere mavi Evans için mümkün olabilir, ancak hiçbir başvuru literatürde teslimat Evans mavi bu yöntemi kullanan tespit edilmiştir. Ancak, kuyruk ven enjeksiyon gelince, yüksek seviyede uzmanlık ve büyük ölçüde bu tekniği tekrarlanarak master için pratik kullanımı başarılı Evans mavi enjeksiyonlar için sınırlar. Buna ek olarak, alternatif juguler ven enjeksiyon yöntemi bizim iletişim kuralında, açıklandığı gibi teknik olarak elde edilebilecek bir çözüm sunar. Bir çok önemli fare damar, perfüzyon için müdahalede sonra sadece mavi periosteum Evans fare kurban aşırı Evans mavi boya kaldırır ve bu protokol için standart. Perfüzyon, önceden açıklanan yöntemleri dikkatle inceledi ve mevcut prosedür elde etmek için değiştirilebilir. Burada açıklanan diğer değişiklikler tüm en iyi duruma getirilmiş, basit ve ucuz.

Evans mavi boya yönteminin önemli bazı sınırlamalar vardır. Örneğin, bazen bu yöntemle ilişkili düşük duyarlılık Evans mavi enjekte hayvanlardan dokuların bazı ek brüt patolojik ve histolojik muayene engelleyebilir. Ancak, bu ve diğer sınırlamalar alternatif yöntemler ve yine de, hala Evans mavi kullanan modelleri gelişmesine yol açmıştır. Evans mavi ölçümü Floresan (yerine göre görsel menzilli) spektroskopisi yönteminin duyarlılığını artabilir. Ayrıca, floresans mikroskobu Evans mavi lekeli dokuların daha farklı yerlerde¹¹vasküler sızıntı gözlenmesi için izin vermek için geliştirilmiştir. Ayrıca, tüm vücut görüntüleme ve yaşayan bir hayvan tarama daha önce mavi¹² Evans mavi konsantrasyonları incelenmesi için sürekli bir şekilde sağlar Evans ile enjekte yerine bir belirli zaman seçilmiş deneme üzerine gelin. Ancak, bu yöntem uygun görüntüleme özellikleri gerektirir ve çok pahalı olabilir. Değişiklikler, Evans mavi ve gerçekleştirilen bir vitro tür modeli içeren gibi bir hücreye kültür ya da piliç chorioallantoic modeli¹³ (CAM) Ayrıca tarif edilmiştir. Bu modeller floresans ve intravital¹⁴ mikroskobu, tarafından izlenir ve vasküler permeabilite değişiklikleri miktar, zaman içinde izin ama doğru modelleme ile ilgili sorular vivo durumlardan artırabilir ve de kullanabilirsiniz pahalı.

Evans mavi yönetim içermeyen diğer yöntemleri belirlemek ve vasküler sızıntı veya geçirgenliği, ölçmek için geliştirilmiş oldu. Bu Yöntemler (örneğin, albümin veya fluoresein) uygun bir floresan molekül veya canlı hayvanlar için bir isotopically etiketli veya başka bir şekilde etiketlenmiş molekül istihdam (veya modelleri¹³non-invaziv tarafından takip, kültür veya chorioallantoic (CAM) hücre için görüntüleme (PET tarama, MRI, intravital mikroskobu, tüm vücut tarama) veya invaziv görüntüleme (Floresan Mikroskobu)^3,12,15. Her ne kadar bu teknikler mavi yöntemleri bir dizi diğer Evans avantajlar sunabilir, aynı zamanda onların önemli karmaşıklığı, gerekli uzmanlık, kaynak ve yüksek parasal maliyeti içerebilir dezavantajları var.

Neprilysin¹⁶ (peptidaz enzim NEP, olarak da bilinen CD10, MME veya Enkephalinase) plazma ekstravazasyonu, en azından bölümünde, enzimatik metabolizma ve endojen madde p. inactivation inhibe içinde dahil olmak için önerilen Böylece, hücre yüzey peptidaz NEP oluşmasına neden olan dokularda olabilir bir zayıflama etkisinin bir madde P, muhtemelen NEP. peptidaz etkinliği tarafından

Başlangıçta, madde P kaynaklı plazma ekstravazasyonu bu değiştirilmiş Evans mavi iletişim kuralı, FVBN vahşi türü (WT) ve NEP nakavt (KO) fare ile kullanmak için test ettik. Madde P artar plazma ekstravazasyonu NEP katılımı bu ilk çalışmalardan şüphelenildi ve bunlar tarif ve daha fazla plazma ekstravazasyonu içeren NEP'ın rolü deneyler. Ancak, bu yazının odak NEP veya plazma ekstravazasyonu rolü değil, ama oldukça plazma ekstravazasyonu kendilerini deneyler. Değiştirilmiş bu iletişim kuralı kullanımı ile elde edilen sonuçlar tür temsilcisi NEP sonuçlarıdır. Evans mavi yöntem plazma ekstravazasyonu ölçmek için en iyi duruma getirilmiş ve FVBN fareler için ayrıntılı olarak açıklandığı gibi değiştirilebilir.

Protokol

Tüm ilgili uluslararası, ulusal ve/veya kurumsal yönergeleri bakım ve hayvanlar (fare) kullanımı için bu el yazması açıklanan deneylerde takip edildi.

Bu yöntem FVBN yetişkin fareler, 16-20 hafta, bu çalışmanın amaçları için en uygun olduğu tespit yaşlı kullanır. 2 gün 6 ile 7 (Şekil 1) içerir ve adım 1-5 gün 1 içerir.

1. ekipman hazırlık

1. Ketamin/xylazine anestezik olarak (önerilen) kullanılıyorsa, steril, tek kullanımlık şırınga ve iğne, yeterli kaynağımız tutun. İsoflurane anestezik kullanılırsa, oksijen tüpü ve isoflurane başlamadan önce deney için yeterli malzeme olduğundan emin olmak için sıvı seviyesi kontrol edin. De, devreler nefes nosecone montajı ve indüksiyon kutusuna ekleyebilirsiniz; Yeni kömür kutu nefes devreler ekleyin. İndüksiyon kutusu üzerinde oksijen dönüm ve ikinci aşamada yaklaşık 50 psi okur ascertaining hazırlayın.
2. 37 ° c ısıtma yastığını açmak
3. Rektal sıcaklık probu ameliyat için hazırlayın.

2. fare hazırlık

Bu adım, anestezi, epilasyon ve konumlandırma (yetişkin FVBN fareler-yaş 16-20 hafta) içerir.

1. Fareler tartmak ve ağırlıkları kaydedin.
2. Fareler anestezi.
   1. Ketamin ve xylazine IP yönetmek (80-100 mg/kg ve 7,5-16 mg/kg, sırasıyla). Ancak, ketamin ve xylazine daha düşük doz ile başlamak tavsiye edilir (30 mg/kg ve 6 mg/kg, sırasıyla).
   2. Anestezi ile yaklaşık 0.1 korumak - ketamin/xylazine ameliyat boyunca doz 0.25 kez ilk. Ketamin ve xylazine daha fazla tekrarlanabilirlik ve Beka gözlendi olarak anestezik temsilcisi belirli bu çalışmada tercih edildi. Anestezik temsilcisi seçim diğer çalışmalarda farklı olduğu tespit.  İsoflurane kullandıysanız, fare bir indüksiyon odasında koymak ve isoflurane %5 için fareyi tam bilincini kaybeder kadar açmak. Daha sonra 1,5-%2,5 isoflurane yordamı kalanı boyunca ayarlamak bir burun nosecone kullanın.
3. Fareler her 2-3 dk uygun anestezi derinliği için kontrol etmek için ayak çimdik tarafından izlemek.
4. Fare ventral boyun bölgesi tıraş.
5. Önceden ısıtılmış panelindeki sırtüstü pozisyonda fareyi getirin. Pençeleri ve ayak bandı ile cerrahi yüzeye fare güvenli.
6. Suni gözyaşı merhem ameliyat sırasında kurumasını önlemek için gözlerinin üzerine yerleştirin.

3. cerrahi ayrıntıları

1. 1 cm kesi şu ventral boynundan juguler ven içinde olun.
2. Lidocaine (% 1-2) bir veya iki damla ağrı yönetimi için ve vazodilatasyon tanıtmak için kesi bölgeye uygulanır. Lidokain etkili olması için 2 dk. bekleyin.
3. Ortaya çıkarmak ve künt diseksiyon ile Şu iç juguler ven yalıtır. Ven 4-0 sütür ile bağlayın ve yavaşça bir hemostat ile gemi rostral sonu geri çek. Bir delik, ince makas, yaklaşık 3 mm aşağıda veya kaudal bağlamak için damar çapı yaklaşık olarak yarısına kullanarak.
4. Bir PV-1 Polivinil kateter sonundan itibaren 1.5 cm işaretlemek ve juguler ven bir gemi dilatör kullanarak delikten takın ve kateter gemi, yaklaşık olarak 1.5 cm kaudal sonuna doğru iplik.
5. Kaudal bölümü (aşağıda kesim), geminin içinde güvenli bir şekilde kateter ile 4-0 ipek. Kateter dışarıya adım 3.3 rostral juguler ven bağlamaya kullanılan dikiş gevşek uçları ile gemi rostral parçası bağla.
6. Tack cilt gevşek geri birlikte vücut ısı kaybı ve kurutulma dokuların önlemeye yardımcı olmak için 4-0 ipek sondayla çevresinde.
7. Kateter heparinized serum fizyolojik (10 U/mL) içeren bir şırınga bağlanmak ve kateter floş.

4. enjeksiyonları

1. Evans mavi çözüm (% 0,9 normal, unheparinized serum fizyolojik veya yaklaşık 50 mg/kg 30 mg/mL solüsyon 50 μL) çizgi temizlemek için heparinized serum küçük bir birim tarafından takip juguler ven kateteri içine enjekte.
2. 2 dk sonra madde satırı temizlemek için heparinized serum küçük bir birim tarafından takip P (0.3 mikron çözüm % 0,9 normal, unheparinized serum fizyolojik veya 1 nmol/kg 100 μL), enjekte et. Madde P endotel katmanı üzerinden proteinler plazma ekstravazasyonu zenginleştirerek; Bu protokol için rutin olarak plazma ekstravazasyonu değerleri ölçmek daha kolay hale bir büyütme plazma ekstravazasyonu değerleri arasında yaklaşık 1.5-fold neden olmaktadır.
3. Madde P enjekte sonra 18 dk bekleyin. Bu süre boyunca, Evans mavi boya equilibrate ve dolaşımda.
4. Deney 18 dk madde P (20 dk sonra Evans mavi enjeksiyon) enjeksiyon sonra fare ile servikal çıkığı feda ederek sona erdirmek. Fareyi doğrudan cervically olabilir muhtemelen çıkık, anestezi, aşırı dozda vermeden faredir muhtemelen hala iyi imzalat ameliyattan. Eğer gerekirse, ancak, aşırı doz anestezikler ketamin/xylazine, isoflurane veya Fentobarbital, servikal çıkığı tarafından takip verilebilir.

5. yalıtım organları

1. Göğüs boşluğu fare derini yüzüp, kalp ve kan damarlarının 50 mL 50 mM sodyum sitrat, pH 3.5 ile (bir yükseklikten 51 cm veya 20") yerçekimi sıvı. pH 3.5 muhtemelen Evans mavi bağlayıcı albumin için korur.
2. 1-5 ilgili organları (mendil) (Örneğin idrar kesesi, böbrek, mide, karaciğer, pankreas, distal veya proksimal kolon, ileum, oniki parmak bağırsağı, gögüs deri, kulaklar, kuyruk, kalp, ve/veya akciğer) parçalanmış bir neşter ile tüketim ve eğer herhangi bir kalıntı içeriği kaldırmak mevcut.
3. Oda sıcaklığında (RT) fosfat tamponlu tuz (PBS; Na₂HPO4, KH₂PO4, 8.0 g 0,24 g NaCl 1.44 g ve 1 L, pH 7.4 KCl 0.20 g) organları durulayın.
4. Doku organlarla leke, her organ yarıya ve her yarı ağırlığında (ıslak ağırlıkları, g).
5. Bir kuru bir kurutma fırın 48 h için folyo üzerinde 150 ° C'de dokusunda yarısı.
6. Formamide bir microfuge içinde tutarlı hacmi (en fazla 200 µL) ikiye tüp 48 h için (ve en fazla 72 s) diğer doku yerleştirmek mavi Evans ayıklamak için.

6. ölçüm doku OD

1. Evans mavi-infüzyon formamide (48-72 h RT kuluçka sonra) 50 µL microfuge tüp ve yer 96-şey polistiren tabakta bir kuyunun içine çıkarın. Doku parçaları ile birlikte formamide aktarmak için dikkatli olun.
2. Yeni, saf formamide her iki boş Wells 96-şey plaka boşlukları için yer 50 µL.
3. Ölçü ve kaydı 96-şey plaka üzerinde bir absorbans plaka okuyucu her şey OD₆₂₀ . 620 nm olduğunu absorbans max Evans mavi.

7. plazma ekstravazasyonu hesaplanması

1. Kuru doku tartmak yarısı 48 h fırında olmuştur.
2. Bu aynı doku kuru ağırlığının tarafından yarı bölünmüş belirli organ dan bireysel her fare (içinde elde edilen adım 5,4), yarı başlayan bu doku ıslak ağırlık ile ilgi (içinde elde edilen adım 7.1) ıslak ağırlık/Kuru ağırlık oranını hesaplamak.
3. Kuru ağırlık (g) dokusunun formamide ikiye yarısı daha önce yerleştirilir (5.4. adımda elde) formamide tarafından ıslak mendil ıslak ağırlığına bölünerek hesaplamak: Kuru ağırlık oranı (7,2 adımda hesaplanır) ilgi belirli organ için.
4. OD₆₂₀ düzeltilmiş değerleri hesaplar. İle OD₆₂₀ başlangıç değeri (Evans formamide 6,3. adımda elde her dokusundan mavi-infüzyon içeren) 96-şey plaka deneysel her kuyudan çıkarmak boş iyi OD₆₂₀ değeri (ortalama OD₆₂₀ değeri saf formamide, 6.2, adımda hazırlanan içeren iki kuyu 6.3. adımda elde₆₂₀ değerleri OD) deneysel her değerinden.
5. Plazma ekstravazasyonu değer doku kuru ağırlığının tarafından düzeltilen OD₆₂₀ (içinde hesaplanan adım 7,4) bölerek formamide (içinde hesaplanan adım 7.3) ikiye hesaplayın. Plazma ekstravazasyonu birim OD₆₂₀/g kuru ağırlık olacaktır.
6. Verileri çözümlemek ve SEM istatistiksel ortalama ± karşılaştırmak gibi gruplar t testi veya tek yönlü varyans analizi ve Scheffé'ın çoklu karşılaştırma testi (lycofs01.lycoming.edu), uygun olarak ifade eder.

Sonuçlar

Şekil 1' de, bir şematik yordam, hangi FVBN farelerin organları en güvenilir ve tutarlı madde P kaynaklı plazma ekstravazasyonu değerleri neden tespit edilmiştir gösterilir. Bu yordam genellikle iş, bekleme süresi en az 48 saat tarafından ayrılmış iki gün sürer. Bu karşılaştırılmak üzere tüm deneylerin tutarlı bir şekilde yapılırsa daha, yaymak mümkündür. Organları üzerinde gün 1 izole sonra Örneğin, organları sıvı azot ...

Tartışmalar

Yukarıda da açıklandığı gibi plazma ekstravazasyonu çalışmanın sonuçta nedenleri ile ilgili yeni bilgi ya da inhibe veya plazma ekstravazasyonu tedavi etmek için yeni yollar açabilir. Başarılı kullanımı, plazma ekstravazasyonu Protokolü (üstte), Evans mavi boya, kullanarak geçerli el yazması kanıtlanmıştır. Her ne kadar gösterilen verileri NEP damarlara korusun hipotez plazma ekstravazasyonu karşı bu bir ikincil halen, kolayca ortalama laboratuvar için kullanılabilir en iyi duruma getirilmi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
isoflurane	Vet One	200-070	inhaled anesthetic
ketamine	Vet One	200-055	injectable anesthetic
xylazine	Lloyd Laboratories	139-236	injectable anesthetic
syringes (10,3 & 1 cc)	Becton Dickinson	309604, 309657, 309659
needles (20G1,23G1 & 26G1/2)	Becton Dickinson	305178, 305193, 305111
isoflurane induction chamber	VetEquip	941443	1 Liter
nosecone breathing circuits	VetEquip	RC2	Rodent Circuit Controller 2
oxygen tank	Airgas	UN 1072	100% medical
heating pad	CWE Inc.	TC-1000	temperature controller
rectal temperature probe	CWE Inc.	10-09012	mouse
balance (for rodents)	Ohaus	CS 2000
surgical tools-scissors	Fine Science tools	15000-00	Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11151-10	Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels)
surgical tools-hemostats	Fine Science tools	13009-12	Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue)
surgical tools -suture drivers	Fine Science tools	12502-12	Olsen-Hegar suture drivers (suturing)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11627-12	Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14110-15	Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	18025-10	suture tying forceps (used for Millar cath)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14078-10	Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11254-20	Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14082-09	Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11051-10	10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11251-35	Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels)
surgical tools-retractors	Fine Science tools	17012-11	Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11294-00	Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11297-00	Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection)
surgical tools-scissors	Fine Science tools	14058-11	tough cut iris scissors (mouse dissection, bones)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11009-13	serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat)
surgical tools-hemostats	Fine Science tools	13003-10	Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue)
surgical tools-forceps	Fine Science tools	11006-12	Adson serrated forceps (tissue grasping)
clippers	Oster	A5
tape	Fisherbrand	159015G
artificial tear ointment	Akorn Inc	13985-600-03
lidocaine	Hospira	0409-4277-01	2% injectable
polyvinyl catheters	Tygon	PV-1
Evans blue	Sigma Aldrich	E2129
Substance P	Bachem	H-1890
heparin	Sagent Pharmaceuticals	25201-400-10	1000 U/ml
saline solution	Hospira	0409-7138-09	0.9% sodium chloride
phenobarbital	Vortech	0298-9373-68
sodium citrate	Fisher Scientific	BP327-1
PBS	Sigma Aldrich	P4417-50TAB
Kimwipes for blotting	Fisher Scientific	06-666A
formamide	Sigma Aldrich	47670
microbalance	Denver Instrument	APX-60
microfuge tubes	Fisher Scientific	07-200-534
polystyrene 96 well plate	Becton Dickenson	351172
absorbance plate reader	BioTek	Synergy 2
polyacrylamide gels	Bio-Rad	3450014
protein molecular weight standard	Bio-Rad	1610374
Protran supported nitrocellulose	Amersham (GE)	10600015
gel box	Bio-Rad	1658005
Tris	Fisher Scientific	BP152-1
Tween20	Sigma Aldrich	P-1379
sodium chloride	Fisher Scientific	S271-1
primary NEP polyclonal antibody	R & D Systems	AF1182
doxycycline chow	Teklad (HARLAN)	TD.130750
FVB/NJ wild type mice	Jackson	001800
secondary antibody (goat anti-rabbit)	ZyMed	81-6120
ECL solution-Western Lightening Plus	PerkinElmer	NEL104001EA
film	Pierce	34091